Summary
وصفنا إعداد الخلايا التائية عامل النمو المستخدمة في المختبر في التوسع من الفئران محددة مستضد خطوط تي اللمفاوية.
Abstract
صيانة خطوط محددة مستضد الخلايا التائية أو استنساخ في الثقافة يتطلب جولات من مستضد التي يسببها تفعيل مفصولة مراحل التوسع 1،2 الخلية. إضافة انترلوكين 2 إلى وسائل الإعلام الثقافة خلال مرحلة التوسع ضروري لمنع موت الخلايا وكافية للحفاظ على المدى القصير خطوط الخلايا T ولكن ثبت لزيادة الاستقطاب TH1 3. استبدال انترلوكين 2 بواسطة الخلايا التائية عامل النمو (TCGF) الذي يحتوي على مزيج من السيتوكينات هو أكثر فعالية من انترلوكين 2 في الحفاظ على المدى الطويل خطوط الخلايا التائية في المختبر 3. وعلاوة على ذلك ، يمكن بسهولة TCGF تكون مستعدة بكميات كبيرة في المختبر ، وأرخص بكثير من المؤتلف انترلوكين 2.
هنا ، وتبين لنا كيفية تحضير TCGF من الفئران supernatants ثقافة خلية طحالية. لهذا الإجراء ، ونحن الحصاد الطحال من الفئران لويس السذاجة الموت الرحيم لجمع الدم والغدة الصعترية. نحن نستعد وحيدة الخلية الحذف من الطحال ، lyze خلايا الدم الحمراء من صدمة ناضح ، والبذور splenocytes في المتوسط الثقافة. يتم تحفيز الخلايا مع كونكانافالين A ، وهو أن mitogen غير انتقائي تنشيط الخلايا اللمفية تي جميع الفئران ، الأمر الذي أدى إلى إنتاج السيتوكينات. يتم جمع supernantant الثقافة بعد 48 ساعة كونكانافالين andexcess منضما إلى mannoside الميثيل ألفا لمنعها من تفعيل خطوط الخلايا التائية التي ستضاف TCGF. وTCGF غير معقمة ، ثم تمت تصفيتها ، aliquoted ، وتخزينها في -20 درجة مئوية.
Protocol
- تأخذ الطحال الفئران لويس (الجرذان بين 200G - 160 هي الأفضل). Dilacerate على الجليد في طبق بتري تحتوي على المضادات الحيوية PBS + (PBS - PS) باستخدام مصفاة الخلية. وضعت في أنبوب 50 مل. تمتلئ PBS - PS.
- تدور لمدة 10 دقيقة على 4 إلى خلايا بيليه درجة مئوية.
- غسل الخلايا مرتين.
- Resuspend الكرية في NH 4 الكلورين 0.15 متر (5 مل في الطحال). المزيج بلطف وبشكل مستمر مع الماصة لمدة 3 دقائق على الجليد لليز في الكريات الحمراء. ملء الأنبوب مع المتوسط.
- تدور لمدة 10 دقيقة على 4 إلى خلايا بيليه درجة مئوية.
- غسل الخلايا مرتين.
- عدد الخلايا. والطحال الفئران يعطي 200-250000000 الخلايا.
- بذور الخلايا بنحو 2 مليون لكل مل في المتوسط الكامل : 50 مل لكل 75 قارورة 2 سم.
- اسمحوا تنمو لمدة 48 ساعة في الحاضنة.
- تدور لمدة 15 دقيقة عند 4 درجة مئوية إلى خلايا بيليه.
- جمع طاف ؛ تجاهل الخلايا.
- إضافة 15 ملغ / مل a mannoside الميثيل إلى طاف. مزيج دقيق.
- تصفية (0.2 ملم)
- قسامة وتخزينها في -20 درجة مئوية. يمكن الاحتفاظ بها في 4 درجات مئوية لمدة 10 أيام إذا لزم الأمر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نحن نستعد TCGF من splenocytes الفئران لويس لأننا الموت ببطء بانتظام الفئران ساذج من هذه السلالة لحصاد المصل والتوتة لتحفيز خلايا الفئران خطوط لويس تي في المختبر. ويمكن استخدام هذا TCGF لتعزيز النمو والبقاء على قيد الحياة من خطوط الخلايا التائية من سلالات الفئران الأخرى. ويمكن أيضا أن تكون مستعدة TCGF من سلالات أخرى من الفئران.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS, 1x, sterile | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 14040-182 | |
| Penicillin / Streptomycin 100x | Reagent | Sigma-Aldrich | P0781 | Add 5 ml of 100x solution to 500 ml PBS to prepare PBS-PS |
| Cell strainer, 70 um diameter | Tool | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Ammonium Chloride (NH4Cl) | Reagent | Sigma-Aldrich | A0171 | Prepare a 0.15 M solution in sterile distilled water, keep cold |
| RPMI 1640 | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 21870-092 | |
| Fetal Bovine Serum (FCS, FBS) | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 16140-071 | Heat-inactivated |
| Penicillin / Streptomycin / L-Glutamine | Reagent | Cambrex/BioWhittaker | 17-718R | PSG |
| RPMI vitamins, 100x | Reagent | Sigma-Aldrich | R7256 | |
| Sodium pyruvate, 100x | Reagent | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| Non-essential amino acids, 100x | Reagent | Sigma-Aldrich | ||
| Beta-mercapt–thanol | Reagent | Sigma-Aldrich | M7522 | |
| alpha methyl mannoside | Reagent | Sigma-Aldrich | M6882 | |
| Concanavalin A | Reagent | Sigma-Aldrich | M6882 | |
| To prepare complete culture medium add the following to a 500 ml bottle of RPMI 1640 and sterile-filter: 10% FCS; 1 bottle of PSG; 5 ml RPMI vitamins; 5 ml sodium pyruvate; 5 ml non-essential amino acids; 50 uM beta-mercapt–thanol; 2 ug/ml Concanavalin A. | ||||
References
- Beeton, C., Barbaria, J., Devaux, J., Benoliel, A. -M., Gola, M., Sabatier, J. -M., Bernard, D., Crest, M., Beraud, E. Selective blocking of voltage-gated K+ channels treats experimental autoimmune encephalomyelitis and inhibits T-cell activation. J. Immunol. 166, 936-944 (2001).
- Beeton, C., Wulff, H., Barbaria, J., Clot-Faybesse, O., Pennington, M., Bernard, D., Cahalan, M. D., Chandy, K. G., Beraud, E. Selective blockade of T lymphocyte K+ channels ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis, a model for multiple sclerosis. Proc. Natl. Acad. 98, 13942-13947 (2001).
- Mor, F., Cohen, I. R. Propagation of Lewis rat encephalitogenic T cell lines: T-cell-growth-factor is superior to recombinant IL-2. J. Neuroimmunol. 123, 76-82 (2002).
