Summary
Denne video viser en dissektion procedure for behandling af human pancreas i flere lagringsformater. Anatomisk orientering opretholdes under hele pancreas regioner tillader definition af regional ø sammensætning og densitet.
Abstract
Dette dissektion og prøveudtagningsprocedure blev udviklet for Netværk for Pankreatisk organdonorer med Diabetes (nPOD) program til at standardisere forberedelse af bugspytkirtlen genvundet fra døde organdonorer. Bugspytkirtlen er opdelt i 3 vigtigste regioner (hoved, krop, hale), efterfulgt af serielle tværsnit i hele medialt for laterale akse. Skiftevise sektioner anvendes til fast paraffin og friske frosne blokke og tilbageværende prøver hakkes til lynfrosset prøve præparater, enten med eller uden RNAse inhibitorer, DNA, RNA eller protein isoleret. Det overordnede mål i bugspytkirtlen dissektion procedure er at prøve det hele bugspytkirtlen og samtidig opretholde anatomiske orientering.
Endokrine celle heterogenitet i form af ø-sammensætning, størrelse og tal er rapporteret for humane øer i forhold til gnaver holme 1. Størstedelen af humane øer fra bugspytkirtlen hovedet er krop og hale regioner er sammensat af insulin-containing p-celler efterfulgt af lavere andele af glucagon-indeholdende a-celler og somatostatin-holdige △-celler. Pankreatiske polypeptid-holdige PP-celler og ghrelin-holdige epsilon celler er også til stede, men i mindre mængder. I modsætning hertil indeholder uncinate region øer, der primært består af pankreatiske polypeptid-holdige PP-celler 2. Disse regionale ø variationer opstår udviklingsmæssige forskelle. Bugspytkirtlen udvikler sig fra de ventrale og dorsale pancreas knopper i formave og efter rotation i maven og duodenum de ventrale lap træk og sikringer med den dorsale 3. Den ventrale lap danner den bageste del af hovedet, herunder uncinate processen, mens dorsal lap giver anledning til resten af organet. Regional bugspytkirtlen variation er også rapporteret med halen regionen har højere holm massefylde sammenlignet med andre regioner, og den dorsale Lap-afledte komponenter undergår selektiv atrofi i type 1-diabetes Yderligere organer og væv er ofte inddrives fra organdonorer og omfatter pancreas lymfeknuder, milt og ikke-pancreas lymfeknuder. Disse prøver udvundet med samme format som for pancreas med tilsætning af isolering af kryopræserverede celler. Når den proksimale duodenum er inkluderet i bugspytkirtlen, kan duodenal mucosa skal indsamles til paraffin og frosne blokke og hakket snap frosne præparater.
Protocol
1. Set-up
- Tapekassetter til paraffinblokke manuelt med en blyant, eller automatisk med en kassette printer. Medtag donor identifikator (CaseID), prøvetype, alikvot nummer, og eventuelle yderligere entydig identifikation (sag regneark, bilag 1 ).
- Label OLT forme som for kassetter med en permanent markør. Klip 5-10 cm rektangler af aluminiumsfolie.
- Udskriv eller manuelt etiket med permanent markør alle hætteglas og rør. Medtag nok hætteglas for hakket snap frosne prøver og rør med RPMI medier til friske forsendelser. For snap frosne hætteglas med RNAlater, tilsættes 1 ml RNAlater til hver cryovial.
- Set-up dissektion bestyrelser i biosikkerhed hætte og bordplader med steriliseret dissektion instrumenter (tænger, skalpeller, blade, gazetamponer (4x4)) samt kassetter og OLT forme indrettet med henblik på brug.
- Forbered en frysebadet ved at sættetøris i en mellemstor Styrofoam kasse (10x10 cm) til en dybde på mindst 3 cm, og der tilsættes isopentan indtil tøris helt dækket.
- Valgfrit: Fyld en lille Dewar beholder med flydende nitrogen.
- Hvis pancreas er nødvendig til elektronmikroskopi (EM) fremstilles TAAB fiksativ ved tilsætning 1,25 ml 16% paraformaldehyd, 1,25 ml 8% glutaraldehyd og 7,5 ml 0,1 M PBS. Forberede Lowicryl fikseringsmiddel ved tilsætning af 2,5 ml 16% paraformaldehyd og 7,5 ml 0,1 M PBS.
- Fremstille opløsninger, der anvendes til isolering af celler. Til 500 ml flaske DMEF (med glutamin), aseptiske teknikker følge, mens at tilføje følgende:
- Føtalt bovint serum (FBS): add 50 ml, endelig 10%.
- Penicillin / streptomycin (Pen / Strep, 10.000 U / ml / 10.000 ug / ml stamopløsning) - Tilsæt 5 ml Pen / Strep bestand RPMI til en slutkoncentration på 100 U / ml / 100ug/mL. Også tilsættes 5 ml i en 500 ml flaske med DPBS, når det anvendes til at holde lymfeknuder eller milten prøver.
2. Personale
3. Pancreas Dissection
- Fjerne duodenum og milten og rense pancreas af fremmede fedt, fartøjer og nerver ved stump og skarp dissektion
- Placer den rensede bugspytkirtlen på en dissekere bord dækket med køkkenrulle. Dyppe en bomulds-applikator med blåt blæk og spredes på den forreste overflade af pancreas. Dup overskydende.
- Valgfrit: Dyp et nyt applikator med sort blæk og spredes på den bageste overflade af pancreas. Tilbage pancreas til normal orientering med forreste overflade vendende prosector.
- Skær bugspytkirtlen i 3 regioner: hoved, krop og hale (figur 1). Skær krydset mellem head og krop derefter opdele den resterende del i ~~~HEAD=NNS lige store dele for krop og hale.
- Afvejes hver region i bugspytkirtlen og optage vægte (Sag workup ark ( bilag 1 )).
- Sektion (ca. 0,5 cm) hver region i bugspytkirtlen i en tværgående "brød brød" måde (figur 1).
- Brug afsnittene fra begge kryds mellem regioner for hakket prøver. Afhængigt pancreas størrelse, kan en prøve fra legemet-hale junction region være vanskeligt at opnå i hvilket tilfælde antallet af paraffinblokke kan reduceres til opnåelse af hakkede prøver eller kun prøver fra pancreas hoved-legeme region kan opnås. Label kryohætteglas efter som hoved eller krop til at betegne proksimale region i krydset.
- Hakkekød stykker og deler ligeligt mellem kryohætteglas (≥ 1 gram per hætteglas). Hurtigt fryse hætteglas uden RNAlater i flydende nitrogen eller i tøris - isopentan gylle derefter overføre toa -80 ° C fryser.
- Holde hætteglas med RNAlater ved stuetemperatur i 30 minutter for at tillade ækvilibrering remix og hurtigt nedfryses i flydende nitrogen eller tøris-isopentan opslæmning derefter overføres til en -80 ° C fryser.
- Fjerne skiftevise sektioner af paraffin-og OCT blokke begynder med paraffin (figur 1).
- Læner alle tværsnit til højre.
- Place ~ 1,5 x 1,5 x 0,5 cm sektioner i kassetterne. Hvis tværsnit er for store, skåret i halve (figur 2b). Tapekassetter til blå forreste halvt så "A", og bageste halvdel som "B".
- Hvis stykker er stadig for stor, skæres hvert afsnit vinkelret på forrige snit (Figur 2c). Tapekassetter AD i urets måde. Trim stykker yderligere som er nødvendige for at passe ind i kassetter.
- Antal blokke sekventielt i regionen, begyndende med den mest mediale del.
- For paraffinblokke og position cassettes så etiketten er til venstre og anbringes væv ind i kassetten, bevare sin orientering. Tæt kassettedækslet og overføres til en beholder med ~ 500 ml 10% neutral pufret formalin (NBF). Starte timing fiksering, når den sidste kassetten er placeret i fiksativ.
- For OLT blokke, et tyndt lag af oktober medier hældes i prelabeled formen derefter lægge vævet i formen være sikker på at bevare orienteringen og dække væv med oktober Hurtigt nedsænkes OLT formene i et tøris - isopentan opslæmning til ~ 1 minut. Fjern fra gylle og sted på tøris til midlertidig opbevaring eller i -80 ° C fryser til langtidsopbevaring.
- Opnåelse -0,5 x 0,5 cm skiver fra hoved-legeme forbindelsen til elektronmikroskopi (EM). Anbring en skive i TAAB fiksativ og den anden skive i Lowicryl fiksativ. Gemme begge typer fiksativ med prøver ved 4 ° C i mindst 48 timer og / eller det uendelige, indtil yderligere behandling for EM.
4. Milt, lymfeknude Dissectioner og duodenale slimhinde dissektioner
- Isolere pancreatiske lymfeknuder (PLN) fra fedt og trimme al bindevæv til knudepunktet kapslen. Sted i sterilt celledyrkningsskål indeholder DMEF. Afhængig af i alt isoleret numre, PLN opdele i portioner for friske forsendelser, kryopræserverede celle isolationer, paraffin og / eller OLT blokke, og hætteglas. Hakke store lymfeknuder i stykker ikke større end 0,5 cm.
- Hakke ikke-pancreatiske lymfeknuder og milt i små (ca. 0,5 cm) terninger. Place i fiksativ, oktober medier, og eller DMEM for frisk prøve forsendelser eller kryopræserverede celle isoleringer efter mængder af råvarer.
- Åbn duodenum og tør forsigtigt duodenale slimhinde rene af slim med et fugtet stykke gaze. Snit af slimhinden for paraffin og / eller frosne OCT blokke og hakket prøver til hætteglas, med og uden RNAlater. Frys som for andre prøver.
5. Wrap OLT blokke i præ-mærket aluminiumsfolie og sted OLT blokke og hætteglassene i kasser til langtidsopbevaring ved -80 ° C.
6. Indsend Faste Prøver for Paraffin behandling
- Fix væv i 16 timer (interval 20 ± 4 timer) ved hjælp af en automatisk paraffin-processor eller ved manuel timing. Proces til paraffinblokke ved hjælp af en automatisk processor ( bilag 2 ).
- Indlejre sektioner i den nøjagtige orientering placeret ved prosector med kassetten etiket til venstre. Indlejre den duodenale slimhinde med skærefladen ned for at tillade gennemgang af slimhinden vinkelret på submucosa.
7. Rengør dissektion områder og desinficere. Vask dissektion instrumenter og re-steriliseres. Placer rest humane væv i formalin fiksativ for opbevaring som biomedicinsk affald. Kassér biomedicinsk affald i henhold til lokale regler inden for en måned.
8. Opdater Sample Inventory System
ve_title "> 9. Repræsentative resultaterDenne procedure vil behandle en intakt human pancreas med repræsentative stikprøver i hele organ, herunder afgrænsning af de tre store regioner, nemlig hoved, krop og hale inden for 2 timer. Den uncinate region, der findes i den bageste hovedet region, er inkluderet i hovedet dissektion. Den mediane bugspytkirtlen vægt organdonorer uden diabetes var 82,4 gram (52,7 - 139,0 gram). Pankreas regionale vægte var omtrent ens (figur 3).
Denne procedure kan også gøre det muligt for genopbygning af hele bugspytkirtlen ved hjælp af farvede objektglas fra sekventiel paraffin-og OLT-blokke. Flere formater er muligt giver mulighed for maksimal udnyttelse af nuværende og fremtidige teknologier. Den nuværende nPOD sagen regneark findes ( bilag 1 ), der bruges til at dokumentere gendannede prøver og efterfølgende procEssing af alikvote typer og mængder.
Figur 1. Samlet ordning af proceduren. Hele bugspytkirtlen behandles samtidig bevare anatomiske retningslinjer. Hovedet region er længere i den øvre ringere akse på grund af tilstedeværelsen af den ventrale pancreas lap i den posteriore region, der omfatter uncinate region. Skraverede område på kryds betegner regioner, der anvendes til fremstilling af hakket prøver i kryohætteglas. P, Paraffin, O, oktober
Figur 2. Bogstaver ordning for pancreas sektioner. Tværgående bugspytkirtel skiver kan yderligere opdeles i halve eller kvarte og bogstaver i urets måde.
Figur 3. Bugspytkirtel vægte fra organdonorer uden diabetes.intakt bugspytkirtlen fra voksne donorer (> 17 år) blev vejet og derefter inddelt i regioner opnåede og regionale vægte. Data er middel ± SEM (N = 15).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Målet med denne procedure er at definere en standard bugspytkirtlen behandling, der kan harmoniseres på tværs af flere indsamlingssteder og dermed muligt at sammenligne resultater af forskellige grupper. Dissektionsmetoden er baseret på standard kirurgiske patologi praksis med yderligere skridt for annotation af større bugspytkirtel regioner efterfulgt af intra-regionale underafdelinger. Standardisering af biospecimen forarbejdningsmetoder er forpligtet til at lette indsamlingen af høj kvalitet prøver eksemplificeret ved offentliggørelse af bedste praksis for biospecimen samling fra nationale biobanking organisationer såsom National Cancer Institute 6. Den biobanking af menneskelige bugspytkirtel prøver fra donorer, der repræsenterer forskellige stadier af diabetes og egnede kontrolinstrumenter befolkninger er blevet rapporteret 7-9. Imidlertid har præcise detaljer for disse prøver indsamlet fra pancreas hovedet regionen har manglet. Betydelig inter-individuel ø heterogenitet er velkendt with op til 5-fold variationer i ø-størrelsesfordeling, således at annotation af pancreas region er nødvendig, når der analyseres iboende heterogenitetsindeks 10. Behandling af pancreas prøver i standardiserede formater vil hjælpe med at løse enkelte patients faktorer, så andre underliggende vigtige sygdomsfaktorer bedre kan løses.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Forfatterne takker donorernes familier og de organudtagning involveret i denne forskning og Maria Martino og Irina Kusmartseva for deres eksperthjælp. Dette arbejde blev finansieret af Juvenile Diabetes Research Foundation (MC-T., MA) til støtte for Netværk for Pankreatisk organdonorer med Diabetes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection instruments including scalpels with 22 blades | Various | Various | |
| Centrifuge tubes (15 and 50 ml) | Fisher Scientific | 05-539-5, 430828 | Sterile |
| Cryotubes(1.8 ml) | VWR North America | 89004-300 | Sterile, bar codes optional |
| RNAlater | Ambion | AM7021 | |
| Surgical Pathology Ink | |||
| Cassettes | Mercedes Medical | CAS ECO109 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher Scientific | 23-245-685 | |
| OCT Freezing Media | TissueTek | 4583 | |
| Molds | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 58952 | Various sizes |
| Isopentane | Fisher Scientific | O3551-4 | OCT chilling bath |
| Dry ice | OCT chilling bath | ||
| Liquid nitrogen in Dewar flask | Snap freezing cryovials | ||
| Cell culture dish (100mm) | Corning | 430167 | Sterile |
| Hyclone DMEF | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30023.01 | Sterile, store refrigerated, glutamine included |
| Fetal Bovine Serum | Cellgro | 35-010-CV | Sterile, store frozen aliquots |
| Penicillin/Streptomycin/Antifungal | GIBCO, by Life Technologies | 15240-062 | Sterile, store frozen aliquots |
| Type 9 Paraffin | Richard-Allan Scientific | 8337 | |
| 1X D-PBS | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | Sterile |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Make fresh, store refrigerated |
| 8% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16019 | Make fresh, store refrigerated |
| Biosafety Level 2 hood | Various | ||
| Ultra-low freezer | Various | ||
| Sakura Cassette Printer | Sakura Finetek | ||
| Sakura VIP300 | Sakura Finetek | Automatic paraffin processor | |
| Paraffin Embedding Station | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| Table 1. Specific reagents and equipment. | |||
References
- Brissova, M. Assessment of human pancreatic islet architecture and composition by laser scanning confocal microscopy. J. Histochem. Cytochem. 53, 1087-1097 (2005).
- Rahier, J. The pancreatic polypeptide cells in the human pancreas: the effects of age and diabetes. J. Clin. Endocrinol. Metab. 56, 441-444 (1983).
- Uchida, T., Takada, T., Ammori, B. J., Suda, K., Takahashi, T. Three-dimensional reconstruction of the ventral and dorsal pancreas: a new insight into anatomy and embryonic development. J. Hepatobiliary Pancreat. Surg. 6, 176-180 (1999).
- Wittingen, J., Frey, C. F. Islet concentration in the head, body, tail and uncinate process of the pancreas. Ann. Surg. 179, 412-414 (1974).
- Rahier, J., Goebbels, R., Henquin, J. Cellular composition of the human diabetic pancreas. Diabetologia. 24, 366-371 (1983).
- Vaught, J. An NCI perspective on creating sustainable biospecimen resources. J. Natl. Cancer Inst. Monogr. 42, 1-7 (2011).
- Gianani, R. Initial results of screening of nondiabetic organ donors for expression of islet autoantibodies. J. Clin. Endocrinol. Metab. 91, 1855-1861 (2006).
- Tauriainen, S., Salmela, K., Rantala, I., Knip, M., Hyöty, H. Collecting high-quality pancreatic tissue for experimental study from organ donors with signs of β-cell autoimmunity. Diabetes Metab. Res. Rev. 26, 585-592 (2010).
- In't Veld, P. Screening for insulitis in adult autoantibody-positive organ donors. Diabetes. 56, 2400-2404 (2007).
- Töns, H. A., Terpstra, O. T., Bouwman, E. Heterogeneity of human pancreata in perspective of the isolation of the islets of langerhans. Transplant Proc. 40, 367-369 (2008).
