Summary
Denne videoen viser en disseksjon prosedyre for behandling av human pancreas i flere lagringsformater. Anatomisk orientering opprettholdes gjennom hele bukspyttkjertelen regionene å tillate definisjon av regional holme sammensetning og tetthet.
Abstract
Dette disseksjon og prøvetaking ble utviklet for Nettverk for Bukspyttkjertelen organdonorer med Diabetes (nPOD) program for å standardisere utarbeidelsen av bukspyttkjertelen utvinnes fra avdød organdonorer. Bukspyttkjertelen er delt inn i 3 hovedområder (hode, kropp, hale) etterfulgt av serielle tverrgående seksjoner hele mediale til laterale akse. Vekslende seksjoner brukes til fast parafin og friske frosne blokker og gjenværende prøvene er hakket for snap frosne prøven preparater, enten med eller uten RNase hemmere, for DNA, RNA, eller protein isolasjon. Det overordnede målet i bukspyttkjertelen disseksjon prosedyren er å prøve hele bukspyttkjertelen samtidig opprettholde anatomisk orientering.
Endokrine celle heterogenitet i form av holmen sammensetning, størrelse, og tall rapporteres for menneskelige holmer i forhold til gnager holmer 1. Flertallet av menneskelige holmer fra bukspyttkjertelen hodet, blir kroppen og halen regionene består av insulin-containing beta-cellene etterfulgt av lavere andeler av glukagon som inneholder alfa-celler og somatostatin-inneholder Í-celler. Pankreas polypeptid-holdige PP celler og ghrelin-holdige Epsilon celler er også tilstede, men i lite antall. I kontrast, inneholder uncinate regionen holmer som primært består av pankreas polypeptid-holdige PP celler 2. Disse regionale holmen variasjoner oppstår fra utviklingsmessige forskjeller. Bukspyttkjertelen utvikler seg fra den ventrale og dorsale bukspyttkjertelen knopper i forutgående og etter rotasjon av magesekken og tolvfingertarmen, den ventrale lobe trekk og sikringer med dorsal tre. Den ventrale lapp danner den bakre delen av hodet inkludert uncinate prosessen mens dorsal lapp gir opphav til resten av orgelet. Regional bukspyttkjertelen variasjon er også rapportert ved halen regionen har høyere holme tetthet sammenlignet med andre regioner og dorsal lobe-deriverte komponenter gjennomgår selektiv atrofi i type 1 diabetes Andre organer og vev er ofte utvinnes fra organdonorer og omfatter bukspyttkjertelen lymfeknuter, milt og ikke-bukspyttkjertelen lymfeknuter. Disse prøvene er gjenvunnet med lignende formater som for bukspyttkjertelen med tillegg av isolering av cryopreserved celler. Når proksimale duodenum er inkludert med bukspyttkjertelen, kan duodenal mucosa samles for parafin og frossen blokk og hakket snap frosne preparater.
Protocol
1. Sett opp
- Tapekassetter for parafin blokker manuelt med en blyant, eller automatisk med en kassett skriver. Inkluder donor identifikator (CaseID), prøvetype, alikvoter nummer, og noen ekstra unik identifikasjon (sak regneark, bilag 1 ).
- Etiketten OCT former som for kassetter med en permanent markør. Klipp ut 5-10 cm biter av aluminiumsfolie.
- Skriv ut eller manuelt etikett med permanent markør alle hetteglass og slanger. Inkluder nok hetteglass for hakket snap frosne prøver og slanger med RPMI media for ferske leveranser. For snap frosne ampuller med RNAlater, tilsett 1 mL RNAlater til hver cryovial.
- Set-up disseksjon styrene i biosikkerhet hette og benkeplater med sterilisert disseksjon instrumenter (tang, skalpeller, blader, gasbind pads (4x4)) samt kassetter og Oct støpeformer arrangert for bruk.
- Forbered en frysing bad ved å settetørris i en mellomstor Styrofoam boksen (10x10 cm) til en dybde på minst 3 cm og legg isopentan til tørris er helt dekket.
- Valgfritt: Fyll en liten Dewar beholder med flytende nitrogen.
- Hvis bukspyttkjertelen er nødvendig for elektronmikroskopi (EM), forberede TAAB bindemiddel ved å legge 1,25 ml 16% paraformaldehyde, 1,25 ml 8% glutaraldehyd, og 7,5 ml 0.1m PBS. Forbered Lowicryl bindemiddel ved å legge 2,5 ml 16% paraformaldehyde til 7,5 mL 0.1m PBS.
- Forbered løsninger som brukes for å isolere cellene. Til 500 ml flaske DMEF (med glutamin), følger aseptiske teknikker mens legge følgende:
- Fetal bovin serum (FBS): add 50ml, siste 10%.
- Penicillin / Streptomycin (Pen / Strep, 10000 U / ml / 10000 ug / ml lager) - tilsett 5 ml penn / Strep lager til RPMI for endelig konsentrasjon på 100 U / ml / 100ug/mL. Også legge til 5 ml til en 500 ml flaske DPBS når de brukes for å holde lymfeknuter eller milt prøver.
2. Personell
3. Pancreas Dissection
- Fjern tolvfingertarmen og milt og rengjør bukspyttkjertelen av utenforliggende fett, fartøyer, og nerver ved hjelp sløv og skarp disseksjon
- Plasser den rensede bukspyttkjertelen på en dissekere bord dekket med papirhåndklær. Dypp en bomullsdott-tipped applikator i blått blekk og spredning på fremre overflate i bukspyttkjertelen. Klatt av overflødig.
- Valgfritt: Dypp en ny applikator i svart blekk og spredning på bakre overflaten av bukspyttkjertelen. Tilbake bukspyttkjertelen til normal orientering med anterior vender prosector.
- Skjær bukspyttkjertelen inn i 3 regioner: hode, kropp og hale (figur 1). Klipp krysset mellom head og kropp deretter dele den gjenværende delen inn ~~~HEAD=NNS like store deler for kropp og hale.
- Vei hver region av bukspyttkjertelen og rekord vekter (sak workup ark ( vedlegg 1 )).
- Seksjon (~~~HEAD=NNS 0,5 cm) hver region i bukspyttkjertelen i en tverrstilt "brød brød" måte (figur 1).
- Bruk delene fra begge veikryss mellom regionene for hakket prøver. Avhengig bukspyttkjertelen størrelse, kan en prøve fra kroppen-tail krysset regionen være vanskelig å få tak i så fall antall parafin blokker kan reduseres for å få hakket prøver eller bare prøver fra bukspyttkjertelen hode-kropp regionen kan innhentes. Etiketten cryovials henhold til hodet eller kroppen til å betegne proksimal regionen i krysset.
- Kjøttdeig biter og deler jevnt mellom cryovials (≥ 1 gram per hetteglass). Raskt fryse hetteglass uten RNAlater i flytende nitrogen eller i tørris - isopentan slurry deretter overføre toa -80 ° C fryser.
- Hold hetteglass med RNAlater ved romtemperatur i 30 minutter for å tillate likevekt, remix og raskt fryse i flytende nitrogen eller i tørris-isopentan slurry deretter overføre til en -80 ° C fryser.
- Fjern vekslende seksjoner for parafin og Oct blokker begynner med parafin (figur 1).
- Len deg alle tverrgående deler til høyre.
- Place ~ 1,5 x 1,5 x 0,5 cm seksjoner i kassettene. Hvis de tverrgående delene er for store, halvert (Figur 2b). Tapekassetter for blå fremre halvparten så "A" og bakre halvparten så "B".
- Hvis brikkene er fortsatt for stor, klippe hver del vinkelrett på forrige kuttet (figur 2c). Tapekassetter AD med klokken. Trim stykker videre som nødvendig for å passe innenfor kassetter.
- Antall blokker sekvensielt innen regionen, som starter med den mest mediale delen.
- For parafin blokker, posisjon Cassettes så etiketten er til venstre og sted vevet inn i kassetten, opprettholde sin orientering. Lukk kassett lokket og overføring til en container med ~ 500 ml 10% nøytral bufret formalin (NBF). Start tidtakingen fiksering når den siste kassetten er plassert i bindemiddel.
- For OCT blokker, hell et tynt lag av oktober media i prelabeled formen deretter lå vevet i formen være sikker på å opprettholde orientering og dekke vev med oktober Raskt dypp OCT formene i en tørris - isopentan slurry for ~ 1 minutt. Fjern fra slurry og sted på tørris for midlertidig lagring eller i -80 ° C fryseboks for langtidslagring.
- Skaff ~~~HEAD=NNS 0,5 x 0,5 cm skiver fra head-kroppen knutepunkt for elektronmikroskopi (EM). Plasser en skive i TAAB fiksativ og den andre skive i Lowicryl bindemiddel. Oppbevar begge typer bindemiddel med prøver ved 4 ° C i minst 48 timer og / eller på ubestemt tid inntil videre bearbeiding for EM.
4. Spleen, lymfeknute Dissecsjoner og Duodenal slimhinner disseksjoner
- Isoler pankreas lymfeknuter (PLN) fra fett og trimme alt bindevev til noden kapsel. Plass i sterile cellekultur parabolen inneholder DMEF. Avhengig samlede tall isolert, dele PLN inn alikvoter for ferske forsendelser, cryopreserved celle isoleringer, parafin og / eller OCT blokker, og hetteglass. Finhakk store noder i biter ikke større enn 0,5 cm.
- Finhakk ikke bukspyttkjertelen lymfeknuter og milt i små (~~~HEAD=NNS 0,5 cm) kuber. Plass i fiksativ, oktober media, og eller DMEM for ferske eksempler forsendelser eller cryopreserved celle isoleringer henhold til mengder startmaterialer.
- Åpne tolvfingertarmen og tørk forsiktig duodenal mucosa rene av gjørme med en fuktet kompress. Klipp deler av slimhinnen for parafin og / eller frosne OCT blokker og kvernet prøver for ampuller, med og uten RNAlater. Frys som for andre prøver.
5. Wrap OCT blokker i pre-merket aluminiumsfolie og sted OCT blokker og hetteglassene i bokser for langtidslagring ved -80 ° C.
6. Send Faste Prøver for parafin Processing
- Fiks vev i 16 timer (range 20 ± 4 timer) ved hjelp av en automatisk parafin-prosessor eller bruker manuell timing. Prosess for å parafin blokker med en automatisk prosessor ( vedlegg 2 ).
- Legge seksjoner i nøyaktig orientering som plasseres av prosector med kassetten etiketten til venstre. Integrer den duodenal mucosa med snittflaten ned slik at undersøkelse av slimhinnen vinkelrett på submucosa.
7. Rengjør disseksjon områder og desinfisere. Vask disseksjon instrumenter og re-sterilisere. Plasser levning menneskelig vev i formalin fiksativ for lagring som biomedisinsk avfall. Kast biomedisinsk avfall i henhold til lokale forskrifter innen én måned.
8. Oppdater Eksempel lagersystem
ve_title "> 9. Representative ResultaterDenne fremgangsmåten vil behandle en intakt menneskelige bukspyttkjertelen med representativ prøvetaking i hele organet herunder avgrensning av de tre store regionene, nemlig hode, kropp og hale innen 2 timer. Den uncinate regionen, som finnes i bakre hode regionen, er inkludert i hodet disseksjon. Median bukspyttkjertelen vekt på organdonorer uten diabetes var 82,4 gram (52,7 - 139.0 gram). Pancreas regionale vektene var omtrent lik (figur 3).
Denne fremgangsmåten kan også gi rom for gjenoppbygging av hele bukspyttkjertelen med beisede lysbilder fra sekvensiell parafin og Oct blokker. Flere formater er gjennomførbare som åpner for maksimal utnyttelse for nåværende og fremtidige teknologier. Den nåværende nPOD saken regneark er levert ( vedlegg 1 ) som brukes til å dokumentere utvinnes prøver og påfølgende procEssing av delmengde typer og mengder.
Figur 1. Samlet ordningen av prosedyren. Hele bukspyttkjertelen behandles samtidig opprettholde anatomiske orientering. Hodet regionen er lengre i superior-underlegne aksen på grunn av tilstedeværelsen av ventrale bukspyttkjertelen lapp i bakre region som inkluderer uncinate regionen. Klekket område ved veikryss betegne områder som brukes til hakket prøvene i cryovials. P, parafin, O, oktober
Figur 2. Bokstaver ordning for bukspyttkjertel seksjoner. Tverrgående bukspyttkjertel skiver kan videre deles inn i halvdeler eller kvartaler og bokstaver med klokken.
Figur 3. Pancreas vekter fra organdonorer uten diabetes. Deintakt bukspyttkjertelen fra voksne givere (> 17 år) ble veid deretter delt inn i regioner og regionale vekter innhentet. Data er midler ± SEM (N = 15).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Målet med denne prosedyren er å definere en standard bukspyttkjertelen behandling som kan være harmonisert på tvers av flere innsamlingssteder og dermed tillate sammenligninger av resultater oppnådd av forskjellige grupper. Den disseksjon Metoden er basert på standard kirurgiske patologi praksis med flere trinn for annotering av store bukspyttkjertel regioner etterfulgt av intra-regionale underavdelinger. Standardisering av biospecimen bearbeidingsmetoder kreves for å lette innsamling av høy kvalitet prøver eksemplifisert ved publisering av beste praksis for biospecimen samling fra nasjonale biobanking organisasjoner som National Cancer Institute 6. Den biobanking av menneskelige bukspyttkjertelen prøver fra donorer som representerer ulike stadier av diabetes og egnede kontroll populasjoner har vært rapportert 7-9. Imidlertid har nøyaktige detaljer for de prøver samlet inn fra bukspyttkjertelen hodet regionen har manglet. Betydelig interindividuell holme heterogenitet er godt kjent with opp til 5-fold variasjoner i holmen størrelse fordeling, slik at annotering av pankreas-regionen er nødvendig når analysere iboende heterogenity 10. Behandling pankreas prøver i standardiserte formater vil bistå med å løse pasientens individuelle faktorer, slik at andre bakenforliggende viktige sykdom faktorer kan bedre løst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Forfatterne takker givernes familiene og orgelet innkjøpsorganisasjoner involvert i denne forskningen og Maria Martino og Irina Kusmartseva for sin eksperthjelp. Dette arbeidet ble finansiert av Juvenile Diabetes Research Foundation (MC-T., MA) i støtte av Nettverk for Bukspyttkjertelen organdonorer med diabetes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection instruments including scalpels with 22 blades | Various | Various | |
| Centrifuge tubes (15 and 50 ml) | Fisher Scientific | 05-539-5, 430828 | Sterile |
| Cryotubes(1.8 ml) | VWR North America | 89004-300 | Sterile, bar codes optional |
| RNAlater | Ambion | AM7021 | |
| Surgical Pathology Ink | |||
| Cassettes | Mercedes Medical | CAS ECO109 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher Scientific | 23-245-685 | |
| OCT Freezing Media | TissueTek | 4583 | |
| Molds | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 58952 | Various sizes |
| Isopentane | Fisher Scientific | O3551-4 | OCT chilling bath |
| Dry ice | OCT chilling bath | ||
| Liquid nitrogen in Dewar flask | Snap freezing cryovials | ||
| Cell culture dish (100mm) | Corning | 430167 | Sterile |
| Hyclone DMEF | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30023.01 | Sterile, store refrigerated, glutamine included |
| Fetal Bovine Serum | Cellgro | 35-010-CV | Sterile, store frozen aliquots |
| Penicillin/Streptomycin/Antifungal | GIBCO, by Life Technologies | 15240-062 | Sterile, store frozen aliquots |
| Type 9 Paraffin | Richard-Allan Scientific | 8337 | |
| 1X D-PBS | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | Sterile |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Make fresh, store refrigerated |
| 8% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16019 | Make fresh, store refrigerated |
| Biosafety Level 2 hood | Various | ||
| Ultra-low freezer | Various | ||
| Sakura Cassette Printer | Sakura Finetek | ||
| Sakura VIP300 | Sakura Finetek | Automatic paraffin processor | |
| Paraffin Embedding Station | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| Table 1. Specific reagents and equipment. | |||
References
- Brissova, M. Assessment of human pancreatic islet architecture and composition by laser scanning confocal microscopy. J. Histochem. Cytochem. 53, 1087-1097 (2005).
- Rahier, J. The pancreatic polypeptide cells in the human pancreas: the effects of age and diabetes. J. Clin. Endocrinol. Metab. 56, 441-444 (1983).
- Uchida, T., Takada, T., Ammori, B. J., Suda, K., Takahashi, T. Three-dimensional reconstruction of the ventral and dorsal pancreas: a new insight into anatomy and embryonic development. J. Hepatobiliary Pancreat. Surg. 6, 176-180 (1999).
- Wittingen, J., Frey, C. F. Islet concentration in the head, body, tail and uncinate process of the pancreas. Ann. Surg. 179, 412-414 (1974).
- Rahier, J., Goebbels, R., Henquin, J. Cellular composition of the human diabetic pancreas. Diabetologia. 24, 366-371 (1983).
- Vaught, J. An NCI perspective on creating sustainable biospecimen resources. J. Natl. Cancer Inst. Monogr. 42, 1-7 (2011).
- Gianani, R. Initial results of screening of nondiabetic organ donors for expression of islet autoantibodies. J. Clin. Endocrinol. Metab. 91, 1855-1861 (2006).
- Tauriainen, S., Salmela, K., Rantala, I., Knip, M., Hyöty, H. Collecting high-quality pancreatic tissue for experimental study from organ donors with signs of β-cell autoimmunity. Diabetes Metab. Res. Rev. 26, 585-592 (2010).
- In't Veld, P. Screening for insulitis in adult autoantibody-positive organ donors. Diabetes. 56, 2400-2404 (2007).
- Töns, H. A., Terpstra, O. T., Bouwman, E. Heterogeneity of human pancreata in perspective of the isolation of the islets of langerhans. Transplant Proc. 40, 367-369 (2008).
