Summary
В этом видеоролике показано вскрытие процедуры для обработки поджелудочной железы человека в различных форматах хранения. Анатомические ориентация сохраняется в течение поджелудочной регионов позволяют определить состав региональных островок и плотности.
Abstract
Это рассечение и процедуры отбора образцов, был разработан для сети поджелудочной доноров органов с диабетом (nPOD) в рамках программы стандартизации подготовки поджелудочной железы оправился от трупных доноров органов. Поджелудочная железа состоит из 3 основных регионов (голова, тело, хвост), а затем серийных поперечных срезов всей медиальной к поперечной оси. Переменный разделы предназначены для фиксированного парафина и свежезамороженной блоков и остатков образцов фарш для оснастки замороженных препаратов образца, с или без РНКазы ингибиторов ДНК, РНК или белка изоляции. Основная цель процедуры вскрытия поджелудочной железы, чтобы попробовать все поджелудочной железы при сохранении анатомической ориентации.
Эндокринные клетки неоднородность с точки зрения островок состав, размер, и количество сообщается на человека островков по сравнению с грызунами островки 1. Большинство человеческих островков из поджелудочной железы головы, тела и хвоста регионов состоят из инсулина containinг β-клеток, затем нижние пропорции глюкагон содержащие α-клеток и соматостатин-содержащие δ-клетками. Панкреатический полипептид содержащих ПП клетки и грелина содержащих клетки эпсилон также присутствуют, но в небольших количествах. В отличие от крючковатыми область содержит островков, которые в основном состоят из панкреатический полипептид, содержащий клетки PP 2. Эти региональные различия островок возникают развития различий. Поджелудочная железа развивается из брюшной и спинной поджелудочной почки в кишки и после поворота желудка и двенадцатиперстной кишки, брюшной движется доли и сливается с спинной 3. Вентральной доли является задняя часть головы, включая крючковатыми процесса, а спинной доли приводит к остальной части органа. Региональные изменения поджелудочной железы также сообщил, с хвостом области, имеющие высшее островок плотность по сравнению с другими регионами и спинной доли производные компоненты проходят выборочный атрофии сахарным диабетом 1 типа Дополнительная органов и тканей часто оправился от доноров органов и включать поджелудочной железы лимфатических узлов, селезенки и поджелудочной железы, не лимфатических узлов. Эти образцы будут восстановлены с подобными форматами, как и для поджелудочной железы с добавлением изоляции криоконсервированных клеток. При проксимальной части двенадцатиперстной кишки входит поджелудочной железы, слизистой оболочки двенадцатиперстной кишки могут быть собраны для парафиновых и замороженных блоков и оснастки фарш замороженные препараты.
Protocol
1. Настройка
- Этикетка кассеты для парафиновых блоков вручную с помощью карандаша или автоматически с помощью кассеты принтера. Включите доноров идентификатор (CaseID), образец типа, аликвоту количество, и любой дополнительный уникальный идентификатор (на примере листа, Приложение 1 ).
- Этикетка октября формы, как и для кассет с перманентным маркером. Вырежьте 5-10 см прямоугольники из алюминиевой фольги.
- Печать этикетки или вручную с перманентным маркером все флаконы и труб. Включите достаточно флаконы для фарша оснастки замороженных образцов и труб со средствами массовой информации RPMI свежих поставок. Для оснастки замороженных флаконов с RNAlater, добавляют 1 мл RNAlater каждого cryovial.
- Настройка платы рассечение в области биобезопасности капот и столешницей с стерилизовать рассечение инструментов (пинцеты, скальпели, ножи, марлевые прокладки (4x4)), а также кассет и восьмеричные формы расположены в порядке использования.
- Подготовить замораживание ванной, положивсухой лед в средних холодильных боксах из пенопласта (10х10 см) на глубину не менее 3 см и добавить изопентан до сухого льда полностью покрыта.
- Дополнительно: Заполните небольшой контейнер Дьюара с жидким азотом.
- Если поджелудочная железа необходимы для электронной микроскопии (ЭМ), подготовить TAAB фиксирующий добавлением 1,25 мл 16% параформальдегида, 1,25 мл 8% глутарового альдегида и 7,5 мл 0,1 М PBS. Подготовить Lowicryl фиксатором, добавляя 2,5 мл 16% параформальдегида в 7,5 мл 0,1 М PBS.
- Подготовка решения, используемые для изоляции клеток. В 500 мл бутылку DMEF (с глютамином), выполните асептики при добавлении следующего:
- Эмбриональной телячьей сыворотки (FBS): добавить 50 мл, оставшиеся 10%.
- Пенициллина / стрептомицина (Pen / Strep, 10000 ЕД / мл / 10000 мкг / мл акций) - добавить 5 мл Pen / Strep акции RPMI для конечной концентрации 100 МЕ / мл / 100ug/mL. Кроме того, добавить 5 мл на 500 мл бутылку DPBS, когда используется для проведения лимфатических узлов или селезенки образцов.
2. Персонал
3. Поджелудочная железа Dissection
- Удалить двенадцатиперстной кишки и селезенки и поджелудочной железы очистить от посторонних жиров, сосуды и нервы тупыми и острыми вскрытия
- Положите вымытую поджелудочной железы на вскрытии покрытая бумажным полотенцем. Смочите ватные аппликатор в синие чернила и распространения на передней поверхности поджелудочной железы. Пятно от избытка.
- Дополнительно: Опустите новый аппликатор черными чернилами и распространения на задней поверхности поджелудочной железы. Вернуться поджелудочной железы нормальной ориентации с передней поверхности, обращенной прозектор.
- Вырезать поджелудочной железы в 3 регионах: голова, тело и хвост (рис. 1). Вырезать стыке HEAг и тела затем разделить оставшуюся часть в ~ равными частями тела и хвоста.
- Взвешивание каждого региона поджелудочной железы и запись веса (на примере проработки листе ( Приложение 1 )).
- Раздел (~ 0,5 см) каждого региона поджелудочной железы в поперечной "хлеба буханка" образом (рис. 1).
- Используйте разделы как из соединения между регионами для фарша образца. В зависимости от размеров поджелудочной железы, образец из организма хвост области перехода может быть трудно получить в этом случае число парафиновых блоков может быть уменьшен для получения фарша образцы или только образцы головки поджелудочной железы тела регионе могут быть получены. Этикетка криопробирки зависимости от того, головы и тела, чтобы обозначить проксимальной области на стыке.
- Фарш части и разделить поровну между криопробирки (≥ 1 г в одном флаконе). Быстрое замораживание флаконов без RNALater в жидкий азот или сухой лед - изопентан суспензия затем передать тО.А. -80 ° C морозильник.
- Хранить флаконы с RNALater при комнатной температуре в течение 30 минут, чтобы обеспечить равновесие, ремиксов и быстро заморозить в жидком азоте или в сухой лед, изопентан суспензия затем передать в морозильной камере -80 ° C.
- Удалить переменный разделы парафин и восьмеричные блоков, начиная с парафином (рис. 1).
- Наклонитесь всем поперечном сечении с правой стороны.
- Место ~ 1,5 х 1,5 х 0,5 см. разделы в кассеты. Если поперечные срезы слишком велики, разрезать пополам (рис. 2б). Этикетка для кассеты синий передняя половина "А" и задняя половина "B".
- Если куски все еще слишком большой, вырезать каждую секцию перпендикулярно к предыдущему разреза (рис. 2). Этикетка кассет AD по часовой стрелке. Обрезка части дальнейшей необходимости укладываться в кассеты.
- Количество блоков последовательно в регионе, начиная с самой медиальной разделе.
- Для парафиновых блоков, положение сassettes так метка слева и место ткани в кассету, сохраняя ориентацию. Закройте крышку кассеты и передаче в контейнер с ~ 500 мл 10% нейтральном буферном растворе формалина (НБФ). Начать времени фиксации, когда последняя кассета находится в фиксатор.
- Для блоков Office, залить тонким слоем ОКТ средств массовой информации в форме prelabeled затем заложить ткань в форме будучи уверенным, что для поддержания ориентации и покрывать ткани с октября Быстро погрузите центра развертывания форм в сухой лед - изопентан суспензии в течение ~ 1 минуты. Удалить из раствора и помещают на сухой лед для временного хранения или в -80 ° C морозильник для длительного хранения.
- Получить ~ 0,5 х 0,5 см кусочки из головы тело соединение для электронной микроскопии (ЭМ). Место один ломтик в фиксирующий TAAB и другой срез в Lowicryl фиксатором. Хранить обоих типов фиксатор с образцами при температуре 4 ° C в течение 48 часов и / или на неопределенный срок до дальнейшей обработки для EM.
4. Селезенки, лимфатических узлов DissecTIONS и слизистой оболочки двенадцатиперстной кишки вскрытия
- Изолировать поджелудочной железы лимфатических узлов (PLN) за счет жиров и отделка всех соединительных тканей к узлу капсулы. Место в стерильную чашку культуры ячейку, содержащую DMEF. В зависимости от общего числа изолирован, разделить на порции PLN свежих поставок, криоконсервированных выделения ячейки, парафин и / или октябре блоки, и флаконы. Фарш большие узлы на кусочки размером не более 0,5 см.
- Фарш без поджелудочной железы лимфатических узлах и селезенке в небольшом (~ 0,5 см) кубиками. Место в фиксатор, OCT СМИ, или DMEM свежие поставки образца или криоконсервированных выделения ячейки в зависимости от количества исходных материалов.
- Откройте в двенадцатиперстную кишку и осторожно протрите чистой слизистой оболочки двенадцатиперстной кишки в слизистой смоченным марлевым тампоном. Сокращение участков слизистой парафина и / или замороженных блоков ОКТ и фарш образцов для флаконов, с и без RNAlater. Мораторий, как и для других образцов.
5. Wrap октября блоков в предварительно помечены алюминиевой фольги и место октября блоков и флаконов в ящики для длительного хранения при температуре -80 ° C.
6. Отправить фиксированной Образцы для обработки парафин
- Исправить тканей в течение 16 часов (в пределах 20 ± 4 часа) с помощью автоматического процессор парафин или с помощью ручного времени. Процесс в парафиновых блоков с использованием автоматического процессор ( Приложение 2 ).
- Вставить разделы в точной ориентации в качестве размещенных прозектор с кассетной этикетке слева. Вставить в слизистой оболочке двенадцатиперстной кишки с поверхности разреза вниз, чтобы рассмотрение перпендикулярно слизистой оболочки подслизистой.
7. Очистите рассечение области и дезинфекции. Вымойте рассечение инструментов и повторно стерилизовать. Поместите остатки человеческих тканей в формалине фиксатором для хранения, биомедицинских отходов. Отменить биомедицинских отходов в соответствии с местным законодательством в течение одного месяца.
8. Обновление системы Пример инвентаризации
ve_title "> 9. Результаты представительЭта процедура будет обрабатывать нетронутыми человеческой поджелудочной железы с репрезентативной выборкой по всему органу, включая разграничение трех основных регионах, в частности, головы, тела и хвоста в течение 2 часов. Крючковатыми области, обнаружили в задней области головы, входит в голове рассечение. Средний вес поджелудочной железы в донорских органов, не страдающих диабетом составил 82,4 грамма (52,7 - 139,0 грамма). Поджелудочная железа региональных веса были примерно равны (рис. 3).
Эта процедура также может позволить реконструкцию всей поджелудочной железы использованием окрашенных слайды из последовательных парафин и восьмеричные блоков. Различные форматы возможны позволяет максимально использовать для нынешних и будущих технологий. В настоящее время nPOD лист случае при условии ( Приложение 1 ), который используется для документирования восстановленных образцов и последующий процессэссинг по аликвоту типах и количествах.
Рисунок 1. Общая схема процедуры. Всей поджелудочной железы обрабатываются при сохранении анатомической ориентации. Глава региона больше в верхней-нижней оси в связи с наличием вентральной доли поджелудочной железы в задней области, которая включает крючковатыми региона. Появившиеся области на перекрестках обозначают регионы для фарша образцов криопробирки. P, парафин, O, октябрь
Рисунок 2. Надписи схема поджелудочной железы разделов. Поперечных срезов поджелудочной железы можно разделить на половинки или четвертинки и буквами по часовой стрелке.
Рисунок 3. Поджелудочная железа весом от доноров органов без сахарного диабета.нетронутым поджелудочной железы взрослых доноров (> 17 лет) был взвешен, то делится на регионы и региональные веса получены. Данные средства ± SEM (n = 15).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Целью этой процедуры является определение стандартной обработки поджелудочной железы, которые могут быть согласованы на нескольких сайтах сбор и таким образом позволяет сравнение результатов, полученных разными группами. Вскрытие метод основан на стандартной хирургической патологии практики дополнительные шаги для аннотации основных регионах поджелудочной железы следует межрегиональных подразделений. Стандартизация методов biospecimen обработка требуется для облегчения сбора высокой пробы качества на примере публикации рекомендации по biospecimen коллекцию из национальных biobanking таких организаций, как Национальный институт рака 6. Biobanking из образцов человеческой поджелудочной железы от доноров, представляющих различные стадии сахарного диабета и подходит населения контроль сообщалось 7-9. Тем не менее, точные детали для тех образцов, взятых из области головы поджелудочной железы не хватало. Значительное между отдельными островками неоднородность известно шго до 5-кратное изменение островок размер дистрибутива, так что аннотации поджелудочной области необходимо при анализе присуща гетерогенности 10. Обработка поджелудочной образцов в стандартных форматов будет оказывать помощь в решении индивидуальных факторов пациента так, чтобы другие основные ключевые факторы заболевания могут быть лучше решены.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Авторы благодарят доноров, семей и органов заготовительных организаций, участвующих в этом исследовании и Мария Мартино и Ирина Kusmartseva за экспертную помощь. Эта работа финансировалась по делам несовершеннолетних исследований диабета Foundation (MC-T., MA) в поддержку сети поджелудочной доноров органов с диабетом.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection instruments including scalpels with 22 blades | Various | Various | |
| Centrifuge tubes (15 and 50 ml) | Fisher Scientific | 05-539-5, 430828 | Sterile |
| Cryotubes(1.8 ml) | VWR North America | 89004-300 | Sterile, bar codes optional |
| RNAlater | Ambion | AM7021 | |
| Surgical Pathology Ink | |||
| Cassettes | Mercedes Medical | CAS ECO109 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher Scientific | 23-245-685 | |
| OCT Freezing Media | TissueTek | 4583 | |
| Molds | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 58952 | Various sizes |
| Isopentane | Fisher Scientific | O3551-4 | OCT chilling bath |
| Dry ice | OCT chilling bath | ||
| Liquid nitrogen in Dewar flask | Snap freezing cryovials | ||
| Cell culture dish (100mm) | Corning | 430167 | Sterile |
| Hyclone DMEF | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30023.01 | Sterile, store refrigerated, glutamine included |
| Fetal Bovine Serum | Cellgro | 35-010-CV | Sterile, store frozen aliquots |
| Penicillin/Streptomycin/Antifungal | GIBCO, by Life Technologies | 15240-062 | Sterile, store frozen aliquots |
| Type 9 Paraffin | Richard-Allan Scientific | 8337 | |
| 1X D-PBS | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | Sterile |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Make fresh, store refrigerated |
| 8% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16019 | Make fresh, store refrigerated |
| Biosafety Level 2 hood | Various | ||
| Ultra-low freezer | Various | ||
| Sakura Cassette Printer | Sakura Finetek | ||
| Sakura VIP300 | Sakura Finetek | Automatic paraffin processor | |
| Paraffin Embedding Station | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| Table 1. Specific reagents and equipment. | |||
References
- Brissova, M. Assessment of human pancreatic islet architecture and composition by laser scanning confocal microscopy. J. Histochem. Cytochem. 53, 1087-1097 (2005).
- Rahier, J. The pancreatic polypeptide cells in the human pancreas: the effects of age and diabetes. J. Clin. Endocrinol. Metab. 56, 441-444 (1983).
- Uchida, T., Takada, T., Ammori, B. J., Suda, K., Takahashi, T. Three-dimensional reconstruction of the ventral and dorsal pancreas: a new insight into anatomy and embryonic development. J. Hepatobiliary Pancreat. Surg. 6, 176-180 (1999).
- Wittingen, J., Frey, C. F. Islet concentration in the head, body, tail and uncinate process of the pancreas. Ann. Surg. 179, 412-414 (1974).
- Rahier, J., Goebbels, R., Henquin, J. Cellular composition of the human diabetic pancreas. Diabetologia. 24, 366-371 (1983).
- Vaught, J. An NCI perspective on creating sustainable biospecimen resources. J. Natl. Cancer Inst. Monogr. 42, 1-7 (2011).
- Gianani, R. Initial results of screening of nondiabetic organ donors for expression of islet autoantibodies. J. Clin. Endocrinol. Metab. 91, 1855-1861 (2006).
- Tauriainen, S., Salmela, K., Rantala, I., Knip, M., Hyöty, H. Collecting high-quality pancreatic tissue for experimental study from organ donors with signs of β-cell autoimmunity. Diabetes Metab. Res. Rev. 26, 585-592 (2010).
- In't Veld, P. Screening for insulitis in adult autoantibody-positive organ donors. Diabetes. 56, 2400-2404 (2007).
- Töns, H. A., Terpstra, O. T., Bouwman, E. Heterogeneity of human pancreata in perspective of the isolation of the islets of langerhans. Transplant Proc. 40, 367-369 (2008).
