Summary
El protocolo fue desarrollado para ofrecer de forma limpia y fácil de islotes o células bajo la cápsula renal de ratones. Las células se concentran en pastillas en el tubo final utilizado para trasplantar las células en la cápsula renal. La facilidad de esta técnica reduce el estrés de las células y el ratón.
Abstract
El protocolo fue desarrollado para ofrecer de forma limpia y fácil de islotes o células bajo la cápsula renal de ratones diabéticos o normal. Se encontró que era más fácil concentrarse los islotes o células en pastillas en el tubo de distribución final (PE50) utilizados para el trasplante de las células en la cápsula renal. Esta técnica ofrece la velocidad y la facilidad y reducir cualquier tensión indebida a las células o el ratón.
Cargando: Colocado, recogido a mano, los islotes o células sedimentadas son cuidadosamente aspiración de la parte inferior de un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml con un pipetteman p200 y una escalera, de pared delgada punta de la pipeta. Una longitud de tubería PE50 está conectado a la punta de la pipeta con un tubo de silicona pequeño adaptador. Las células se deja reposar en la punta, y luego se transfieren a la tubería PE50 lentamente marcando el pipetteman. Una vez que las células se encuentran cerca del extremo de la tubería PE50, una torcedura se hace y el tubo adaptador de silicona se coloca sobre la torcedura. La tubería PE50 se transfiere a un cónico de 15 ml que contiene una pipeta de corte de 5 ml, y la tubería PE50 se pega por el lado de la pipeta de 5 ml para evitar curling durante la centrifugación. Las células pueden llegar a 1.000 rpm y se detuvo.
Trasplante: ratones receptores son anestesiados, afeitado y limpio. Una pequeña incisión en el flanco izquierdo del ratón y el riñón está expuesto. Los riñones, la grasa y el tejido se mantiene húmeda con hisopo de solución salina normal. El extremo distal de la PE50 está conectado a una jeringa Hamilton tornillo disco, que contiene una punta de la pipeta, utilizando el adaptador de tubo de silicona. Una pequeña incisión se hace en el lado del flanco derecho de los riñones, no demasiado grande ni demasiado profunda. El extremo biselado de la tubería PE50, la más cercana a las células, se coloca cuidadosamente debajo de la cápsula, el tubo se mueve alrededor con cuidado para hacer el espacio mientras la limpia solución salina normal, una cápsula seca puede romper fácilmente. Una pequeña burbuja de aire se entrega bajo la cápsula lentamente marcando el husillo de la jeringa. Los islotes son entregados luego, lentamente, detrás de la burbuja de aire. Una vez que la homeostasis de los islotes se han entregado los riñones se mantiene y los chismes se cauteriza con fuego lento. El riñón se coloca en la cavidad y el peritoneo y la piel son suturados y engrapados. Los ratones son inmediatamente tratados con buprenorfina flunixino y cuadrados y se coloca en una jaula en una almohadilla eléctrica.
Protocol
Preparación de los islotes para trasplante (Tx)
- Bajo un microscopio invertido, recoger a mano islotes con un Pipetman P200 y punta de la pipeta directamente de los islotes se cultivan en una placa de 100 mm.
- Contar islotes 100 a la vez y transferir a cada tubo de microcentrífuga (~ 500 islotes / metro / ratón).
- Permitir a los islotes se depositan en el fondo de los tubos de microcentrífuga.
- Dibuja un islote de pellets en una Pipetman P200 (fijado en 130ul) utilizando una escalera de pared delgada punta de la pipeta.
- Coloque un adaptador de tubo de silicona por la punta de la jeringa. Inserte una longitud de tubería PE50 en el adaptador de silicona.
- Cuelgue el Pipetman al lado de la campana y la cinta de la tubería PE50 a la pared cubierta superior a los islotes en la punta. Esto permitirá a los islotes de resolver sólo en la punta de la pipeta.
- La transferencia de los islotes en el tubo PE50 lentamente marcando el Pipetman y mover los islotes en el tubo de PE50, teniendo cuidado de no expulsar a los islotes de la final.
- Haga un nudo en el extremo biselado de la tubería PE50. Mientras que el mantenimiento de la torcedura, desconecte el tubo adaptador de silicona de la Pipetman y asegurar el pliegue con el adaptador de silicona.
- Lugar de los islotes, en la PE50 tubo, tubo de silicona lado retorcido adaptador hacia abajo, en un 15 mL cónico con una pipeta de 5 mL y corte de cinta el tubo PE50 por el lado de la pipeta de 5 ml para prevenir la curvatura de la tubería PE50, mientras que la centrifugación.
- Se centrifuga la conicals PE50/15mL a 1000 rpm y apague centrífuga. (No se permite cocinar más de 10 preparaciones de islotes al mismo tiempo).
- Coloque el tubo en hielo.
Preparación de ratón para el trasplante
- Anestesiar a los ratones con isofluorano o con ketamina / Xylexene (ver protocolo de preparación).
- Después de anestésico haya hecho afectan, afeitarse el flanco izquierdo del ratón.
- Hisopo de piel de ratón, centro-out, con hisopo de povidona yodada y luego limpie con una gasa con EtOH.
- Localizar el riñón izquierdo (a la derecha del bazo). Haga una pequeña incisión en la piel, la exposición del peritoneo.
- Haga una pequeña incisión en el peritoneo exponer el riñón. Mantenimiento de la pequeña incisión ayudará a mantener el riñón levantado y expuesto.
- Aplique una ligera presión a ambos lados de la incisión, subir o pop el riñón del ratón.
- Mantener la humedad del riñón mediante la aplicación de solución salina normal con un hisopo de algodón.
- Con una jeringa de 23 o 25 aguja, que un pequeño rasguño en el flanco derecho de los riñones, la creación de una incisión en la cápsula renal, no es demasiado profunda o demasiado grande.
Trasplante de los islotes
Nota: Mientras que el ratón se está preparando para Tx, la segunda persona debe preparar el Hamilton a tornillo sin fin jeringa trasplante de islotes.
- Retire lentamente el tubo adaptador de silicona de la tubería PE50, manteniendo el pliegue en la tubería.
- Coloque el extremo opuesto de la tubería PE50 en el tubo adaptador de silicona y colocar el tubo adaptador de silicona en la punta de la pipeta conectada a la "tornillo sin fin" vidrio de la jeringa Hamilton. Suelte lentamente el pliegue en la tubería PE50, asegurándose de que las islas no se filtran.
- Avance de los islotes lentamente hasta la punta de la tubería PE50 con el "tornillo" mecanismo, pero mantener una pequeña burbuja de aire en la parte delantera de los islotes en el tubo de PE50.
- En el nick realizada en los riñones, deslice con cuidado la tubería PE50 debajo de la cápsula, haciendo un pequeño hueco. Tenga mucho cuidado de no gubia del riñón o la punción a través de la cápsula.
- Ayuda a mantener la zona húmeda y la cápsula con solución salina normal-Gentamicina algodón empapado hisopo, una cápsula seca se desgarra con facilidad.
- Mueva suavemente el tubo en todas las direcciones, creando un "bolsillo" de los islotes trasplantados a descansar. Recuerde volver a aplicar una solución salina normal adicionales para mantener el área húmeda.
- Bajo la dirección de la persona que ha abierto el ratón y que ha colocado la tubería PE50 bajo la cápsula renal, la segunda persona, que preparó el ratón y una jeringa Hamilton trasplante, poco a poco avanzará islotes bajo la cápsula, dentro del "bolsillo", detrás de una pequeña burbuja de aire emitido por el tubo de PE50, hasta que todos los islotes son trasplantados.
- Lentamente retire la tubería PE50, seque el área con un hisopo seco y cuidadosamente cauterizar el nick con el fuego bajo.
- El uso de un algodón seco hisopo, asegúrese de que la hemorragia se ha detenido. Cuando la hemorragia se ha detenido, volver a humedecer el riñón con solución salina estéril, y suavemente reemplazar el riñón en el peritoneo antes de cerrar el ratón con la sutura y grapas de piel.
Cierre / Revival de ratón
- Cerrar el peritoneo con una sutura con 5-0 suturas de seda w / una aguja C-6 de 19 mm.
- Pinzas de uso de dibujar ambos lados de la incisión de la piel juntos.
- Alimento básico de la piel junto con 2 o 3 grapas.
- Limpie la piel del ratón de cualquier sangre, mediante un hisopo de algodón y Saline.
- Inmediatamente el tratamiento de los ratones con una inyección subcutánea de flunixino y buprenorfina.
- Coloque el ratón en una jaula, que se coloca en una almohadilla eléctrica o por debajo de una lámpara de calor, hasta que el ratón está en plena actividad.
- Quitar las grapas de piel en dos semanas.
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Discussion
Este protocolo proporciona una opción práctica y eficiente de limpia y fácilmente la entrega de los islotes o células bajo la cápsula renal de ratones diabéticos o normal. La técnica de la concentración y peletización de los islotes o células en el tubo de distribución final (PE50) utilizado para trasplante de las células en la cápsula renal ofrece un método fácil y eficaz de trasplante de células, mientras que la reducción de cualquier exceso de estrés a las células o el ratón.
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Acknowledgments
UCSF Diabetes Center. NIH UCSF DERC islote central. JDRF. LifeScan Inc. Johnson & Johnson Company.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical gloves | Fisher Scientific | 11-394-95(sz) | |
| Surgical scrub sponges | Moore Medical | 42940AK | |
| Forceps | Miltex Inc. | 6-114 and 6-26 | 2 with teeth, 2 straight |
| Dissecting scissors n=2 | Miltex Inc. | 5-290 | |
| Oster razor (sz. 40 blade) | Fisher Scientific | 01-305-10B | |
| 4x4 Sterile gauze pads | Moore Medical | 08252AK | |
| Povidone Iodine pads | Moore Medical | 08486AK | |
| Alcohol pads | Fisher Scientific | 14-819-2 | |
| Heating pad | Moore Medical | 42508AK | |
| 23G or 25G needles | 1" long | ||
| Cidex solution | Moore Medical | 07535AK | for cleaning/santizing instruments |
| PE50 polyethylene tubing | BD Biosciences | 427411 | PE50, 0.965mm O.D. x 0.58mm I.D. |
| Cidex + 28 day soln | Moore Medical | 35625AK | |
| Silicone tubing | Spectrum Chromat. | 123732 | 5/32”OD x 1/32” ID |
| Instrument sterilizing container | Moore Medical | 39074AK | |
| Straight Pipet Tips | USA Scientific, Inc. | 1111-0810 | sterile |
| Glass syringe w/screw-drive | Hamilton Co | 1001 | |
| Cauterizing tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS230 | |
| Needle Holder | Moore Medical | 41-067 | |
| 5-0 silk | LOOK Surgical | 754B | for suture (6-C) |
| Cotton tipped swab | Moore Medical | ||
| 9mm autoclip stapler | BD Biosciences | 7630 | |
| 9mm staples | BD Biosciences | 7631 | |
| 9mm staple remover | BD Biosciences | 7637 |
References
- Tang, Q., Henriksen, K. J., Bi, M., Finger, E. B., Szot, G., Ye, J., Masteller, E. L., McDevitt, H., Bonyhadi, M., Bluestone, J. A. In vitro-expanded antigen-specific regulatory T cells suppress autoimmune diabetes. J Exp Med. 199, 1455-1465 (2004).
- Rulifson, I. C., Szot, G. L., Palmer, E., Bluestone, J. A. Inability to induce tolerance through direct antigen presentation. Am J Transplant. 2, 510-519 (2002).
- Lenschow, D. J., Zeng, Y., Hathcock, K. S., Zuckerman, L. A., Freeman, G., Thistlethwaite, J. R., Gray, G. S., Hodes, R. J., Bluestone, J. A. Inhibition of transplant rejection following treatment with anti-B7-2 and anti-B7-1 antibodies. Transplantation. Transplantation. 60, 1171-1178 (1995).
- Lenschow, D. J., Zeng, Y., Thistlethwaite, J. R., Montag, A., Brady, W., Gibson, M. G., Linsley, P. S., Bluestone, J. A. Long-term survival of xenogeneic pancreatic islet grafts induced by CTLA4lg. Science. 257, 789-792 (1992).
