Summary
Il nostro protocollo è stato sviluppato per fornire in modo pulito e facilmente le cellule o isolotti sotto la capsula renale di topi. Le cellule sono concentrate in pellet nel tubo finale utilizzato per il trapianto delle cellule sotto la capsula renale. La facilità di questa tecnica riduce lo stress per le cellule e il mouse.
Abstract
Il nostro protocollo è stato sviluppato per fornire in modo pulito e facilmente le cellule o isolotti sotto la capsula renale di topi diabetici o normale. Abbiamo scoperto che era più facile concentrare le isolette o cellule in pellet nel tubo di consegna finale (PE50) utilizzato per il trapianto di cellule sotto la capsula renale. Questa tecnica fornisce velocità e facilità, riducendo qualsiasi sforzo eccessivo per le celle o per il mouse.
Caricamento in corso: Fondata, raccolte a mano, isolotti o cellule pellet sono accuratamente aspirato dal fondo di una provetta 1,5 ml con un pipetteman P200 e un rettilineo, a parete sottile punta della pipetta. Una lunghezza di PE50 tubo è attaccato alla punta della pipetta con un piccolo tubo di silicone adattatore. Le cellule sono permesso di stabilirsi, in punta, e poi vengono trasferiti al tubo PE50 lentamente componendo il pipetteman. Una volta che le cellule sono quasi alla fine del tubo PE50, un punto di discontinuità è fatto e il tubo in silicone adattatore è posizionato sopra il nodo. La PE50 tubo è trasferito ad un 15 ml conica contenente una riduzione del 5 pipetta ml, e il tubo PE50 è registrato sul lato della pipetta 5 mL per evitare il curling durante la centrifugazione. Le cellule sono permesso di raggiungere 1.000 giri al minuto e si fermò.
Trapianto: topi destinatari sono anestetizzati, rasato e pulito. Una piccola incisione viene fatta sul fianco sinistro del mouse e il rene è esposto. L', rene grasso e il tessuto sono mantenute umide con normale soluzione salina tampone. L'estremità distale del PE50 è attaccato ad una siringa Hamilton azionamento della vite, contenente un puntale, utilizzando il tubo adattatore silicone. Un piccolo nick è fatto sul lato fianco destro del rene, non troppo grande né troppo profondo. L'estremità smussata del tubo PE50, più vicino alle celle, è accuratamente posizionato sotto la capsula, il tubo viene spostato delicatamente per fare spazio, mentre tampone soluzione fisiologica; una capsula secca può strappare facilmente. Una piccola bolla d'aria è fornito sotto la capsula lentamente componendo il disco vite siringa. Isolotti sono poi lentamente consegnati dietro la bolla d'aria. Omeostasi renale una volta le isole sono state consegnate viene mantenuta e la knick è cauterizzato a basse temperature. Il rene è posto nuovamente dentro la cavità ed il peritoneo e la pelle sono suturate e pinzati. I topi sono immediatamente trattati con Buprenorfina e Flunixin mq e posto in una gabbia su una piastra elettrica.
Protocol
Preparazione di isole per trapianto (Tx)
- Sotto un microscopio invertito, selezionare manualmente isolette con una Pipetman P200 e punta della pipetta direttamente dalla isole coltivate in un piatto di 100mm.
- Conte isolotti 100 in una volta e trasferire in ogni provetta (~ 500 isolotti / tubo / mouse).
- Lasciare isolotti di depositarsi sul fondo dei tubi microcentrifuga.
- Disegna uno isolotto a pellet in un Pipetman P200 (fissata a 130ul) utilizzando una scala a parete sottile punta della pipetta.
- Posizionare un adattatore tubo di silicone sopra la punta della siringa. Inserire una lunghezza di PE50 tubo nel adattatore silicone.
- Appendere la Pipetman a lato del cofano e il nastro PE50 tubo alla parete cappa superiore alla isolotti nella punta. In questo modo il isolette di stabilirsi solo nella punta della pipetta.
- Trasferire il isolotti nel tubo PE50 lentamente componendo il Pipetman e spostando gli isolotti nel tubo PE50, facendo attenzione a non espellere le isole dalla fine.
- Fare un nodo alla fine smussata del tubo PE50. Pur mantenendo le piegare, staccare il tubo in silicone adattatore dal Pipetman e fissare la piega con l'adattatore in silicone.
- Posizionare le isole, nel tubo PE50, piegato lato tubi di silicone adattatore verso il basso, in un mL 15 conico con una pipetta 5 ml e taglio del nastro il tubo PE50 sul lato della pipetta 5 mL per evitare di curling del tubo PE50 mentre centrifugazione.
- Centrifugare il conicals PE50/15mL a 1000 giri al minuto e spegnere centrifuga. (Non preparare più di 10 preparati isolotto in una sola volta).
- Tubo posto sul ghiaccio.
Preparazione del mouse per trapianti
- Anestetizzare i topi con isofluorane o con ketamina / Xylexene (vedi protocollo di preparazione).
- Dopo che ha preso effetto anestetico, radere il fianco sinistro del mouse.
- Tampone pelle di topo, centro-out, con tampone Iodio Povidone e poi pulire con un tampone imbevuto ETOH.
- Individuare il rene sinistro (appena a destra della milza). Fai una piccola incisione nella pelle, esponendo il peritoneo.
- Fai una piccola incisione nel peritoneo esporre il rene. Mantenere la piccola incisione aiuterà a mantenere il rene sollevato ed esposto.
- Applicare una leggera pressione su entrambi i lati dell'incisione, alzare o pop il rene fuori del mouse.
- Mantenere umido il renali mediante l'applicazione di soluzione fisiologica con un tampone di cotone con punta.
- Utilizzando una siringa 23 o 25 gauge, fare un piccolo graffio sul fianco destro del rene, la creazione di un nick nella capsula del rene, non troppo profonda o troppo grande.
Trapianto di isole
Nota: Quando il mouse si sta preparando per Tx, la seconda persona deve preparare la vite-drive Hamilton siringa trapianto di isole.
- Rimuovere lentamente il tubo in silicone adattatore dal tubo PE50 mantenendo il nodo nel tubo.
- Posizionare l'estremità opposta del tubo PE50 nel tubo in silicone adattatore e posizionare il tubo in silicone adattatore sulla punta della pipetta collegata al "vite-drive" siringa di vetro Hamilton. Rilasciare lentamente il nodo nel tubo PE50, assicurandosi che le isole non fuoriesca.
- Anticipo le isolette lentamente fino alla punta del tubo PE50 utilizzando il meccanismo "a vite", ma mantenere una piccola bolla d'aria nella parte anteriore delle isole nel tubo PE50.
- Nel nick fatto nel rene, far scorrere con attenzione la PE50 tubi sotto la capsula, facendo una piccola tasca. State molto attenti a non sgorbia o pungere il rene attraverso la capsula.
- Aiuta a mantenere la zona umida e capsula con normale soluzione fisiologica Gentamicina tampone di cotone imbevuto di punta, una capsula secca si strappa facilmente.
- Spostare delicatamente il tubo in tutte le direzioni, creando una "tasca" per le isole trapiantate per riposare. Ricordarsi di riapplicare ulteriore soluzione fisiologica per mantenere la zona umida.
- Sotto la direzione della persona che ha aperto il mouse e che ha posto il PE50 tubi sotto la capsula renale, la seconda persona, che ha preparato il mouse e la siringa trapianto Hamilton, lentamente anticipo isole sotto la capsula, all'interno della "tasca", dietro una piccola bolla d'aria formulato dal tubo PE50, fino a quando tutte le isole sono trapiantati.
- Rimuovere lentamente il tubo PE50, asciugare la zona con un tampone asciutto e con attenzione cauterizzare il nick a basse temperature.
- Utilizzando un tampone di cotone asciutto capovolto, assicurarsi che tutti sanguinamento si è fermato. Una volta emorragia si è fermata, ri-inumidire il rene con soluzione salina sterile, e gentilmente sostituire il rene nel peritoneo prima di chiudere il mouse con sutura e punti metallici pelle.
Chiusura / Revival di mouse
- Chiudere il peritoneo con un punto in esecuzione utilizzando 5-0 suture di seta w / un ago C-6 19mm.
- Forcipe utilizzando disegnare entrambi i lati della incisione cutanea insieme.
- Il fiocco pelle con 2 o 3 punti.
- Pulire la pelle del mouse di qualsiasi sangue, usando un tampone di cotone con punta e Saline.
- Immediatamente trattare il mouse con una iniezione sottocutanea di Flunixin e buprenorfina.
- Posizionare il mouse in una gabbia, che viene posizionato su una piastra elettrica o sotto una lampada riscaldante, fino a quando il mouse è pienamente attiva.
- Rimuovere i punti della pelle in 2 settimane.
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Discussion
Questo protocollo fornisce una soluzione pratica ed efficiente per fornire in modo pulito e facilmente le cellule o isolotti sotto la capsula renale di topi diabetici o normale. La tecnica di concentrazione e cubettatura le isolette o cellule nel tubo di consegna finale (PE50) utilizzato per il trapianto di cellule sotto la capsula renale offre un metodo semplice ed efficace di trapianto di cellule, riducendo qualsiasi sforzo eccessivo per le celle o per il mouse.
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Acknowledgments
UCSF Diabetes Center. NIH UCSF DERC Islet Core. JDRF. LifeScan Inc. Johnson Johnson & Company.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical gloves | Fisher Scientific | 11-394-95(sz) | |
| Surgical scrub sponges | Moore Medical | 42940AK | |
| Forceps | Miltex Inc. | 6-114 and 6-26 | 2 with teeth, 2 straight |
| Dissecting scissors n=2 | Miltex Inc. | 5-290 | |
| Oster razor (sz. 40 blade) | Fisher Scientific | 01-305-10B | |
| 4x4 Sterile gauze pads | Moore Medical | 08252AK | |
| Povidone Iodine pads | Moore Medical | 08486AK | |
| Alcohol pads | Fisher Scientific | 14-819-2 | |
| Heating pad | Moore Medical | 42508AK | |
| 23G or 25G needles | 1" long | ||
| Cidex solution | Moore Medical | 07535AK | for cleaning/santizing instruments |
| PE50 polyethylene tubing | BD Biosciences | 427411 | PE50, 0.965mm O.D. x 0.58mm I.D. |
| Cidex + 28 day soln | Moore Medical | 35625AK | |
| Silicone tubing | Spectrum Chromat. | 123732 | 5/32”OD x 1/32” ID |
| Instrument sterilizing container | Moore Medical | 39074AK | |
| Straight Pipet Tips | USA Scientific, Inc. | 1111-0810 | sterile |
| Glass syringe w/screw-drive | Hamilton Co | 1001 | |
| Cauterizing tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS230 | |
| Needle Holder | Moore Medical | 41-067 | |
| 5-0 silk | LOOK Surgical | 754B | for suture (6-C) |
| Cotton tipped swab | Moore Medical | ||
| 9mm autoclip stapler | BD Biosciences | 7630 | |
| 9mm staples | BD Biosciences | 7631 | |
| 9mm staple remover | BD Biosciences | 7637 |
References
- Tang, Q., Henriksen, K. J., Bi, M., Finger, E. B., Szot, G., Ye, J., Masteller, E. L., McDevitt, H., Bonyhadi, M., Bluestone, J. A. In vitro-expanded antigen-specific regulatory T cells suppress autoimmune diabetes. J Exp Med. 199, 1455-1465 (2004).
- Rulifson, I. C., Szot, G. L., Palmer, E., Bluestone, J. A. Inability to induce tolerance through direct antigen presentation. Am J Transplant. 2, 510-519 (2002).
- Lenschow, D. J., Zeng, Y., Hathcock, K. S., Zuckerman, L. A., Freeman, G., Thistlethwaite, J. R., Gray, G. S., Hodes, R. J., Bluestone, J. A. Inhibition of transplant rejection following treatment with anti-B7-2 and anti-B7-1 antibodies. Transplantation. Transplantation. 60, 1171-1178 (1995).
- Lenschow, D. J., Zeng, Y., Thistlethwaite, J. R., Montag, A., Brady, W., Gibson, M. G., Linsley, P. S., Bluestone, J. A. Long-term survival of xenogeneic pancreatic islet grafts induced by CTLA4lg. Science. 257, 789-792 (1992).
