Summary
Notre protocole a été développé pour offrir proprement et facilement les îlots ou de cellules sous la capsule rénale de souris. Les cellules sont concentrées en granules dans le tube final utilisé pour la transplantation des cellules sous la capsule rénale. La facilité de cette technique réduit le stress pour les cellules et la souris.
Abstract
Notre protocole a été développé pour offrir proprement et facilement les îlots ou de cellules sous la capsule rénale de souris diabétiques ou normale. Nous avons trouvé qu'il était plus facile de concentrer les îlots ou de cellules en granules dans le tube de livraison finale (PE50) utilisé pour la transplantation des cellules sous la capsule rénale. Cette technique offre à la fois rapidité et la facilité tout en réduisant les stress indu aux cellules ou à la souris.
Chargement: Installé, cueillies à la main, d'îlots ou de cellules granulées sont soigneusement aspiré au fond d'un microtube de 1,5 ml en utilisant un pipetteman P200 et une droite, à paroi fine pointe de la pipette. Une longueur de tube PE50 est attaché à la pointe de la pipette en utilisant un tube en silicone petites adaptateur. Les cellules sont autorisés à s'installer, dans la pointe, puis sont transférés à la tubulure PE50 par lentement composant le pipetteman. Une fois les cellules vers la fin du tube PE50, un coude est faite et le tube de silicone adaptateur est placé sur le pli. Le tube PE50 est transféré à un 15 ml conique contenant une pipette ml couper 5, et le tube PE50 est enregistrée sur le côté de la pipette 5 ml d'éviter de curling lors de la centrifugation. Les cellules sont autorisés à atteindre 1000 rpm et s'arrêta.
Transplantation: souris receveuses sont anesthésiés, rasés et nettoyés. Une petite incision est faite sur le flanc gauche de la souris et le rein est exposé. Le rein, la graisse et les tissus sont maintenus humides avec un tampon saline normale. L'extrémité distale de la PE50 est attachée à une seringue Hamilton entraînement à vis, contenant une pipette, en utilisant le tube adaptateur en silicone. Une petite incision est faite sur le côté flanc droit du rein, pas trop grand ni trop profonde. L'extrémité biseautée du tube PE50, plus proche des cellules, est soigneusement placé sous la capsule, le tube est déplacé autour doucement pour faire de l'espace tout en tamponnant une solution saline normale; une capsule sèche peut se déchirer facilement. Une petite bulle d'air est livré sous la capsule par lentement numérotation du lecteur vis de la seringue. Les îlots sont ensuite lentement livré derrière la bulle d'air. Une fois l'homéostasie du rein les îlots ont été livrés est maintenue et le bric est cautérisée à basse température. Le rein est placé dans la cavité et le péritoine et la peau sont suturés et agrafées. Les souris sont immédiatement traités avec flunixine et la buprénorphine carrés et placé dans une cage sur un coussin chauffant.
Protocol
Préparation des îlots pour la transplantation (Tx)
- Sous un microscope inversé, la main-pick îlots en utilisant un Pipetman P200 et embout de la pipette directement à partir des îlots de culture dans une plaque de 100mm.
- Comptez 100 îlots à un moment et le transfert dans chaque tube à centrifuger (~ 500 îlots / tube / souris).
- Autoriser îlots pour se déposent au fond des tubes à centrifuger.
- Dessinez un îlot granulés dans un Pipetman P200 (fixé à 130ul) en utilisant une pipette droite paroi mince.
- Placer un adaptateur de tube silicone sur le bout de la seringue. Insérer une longueur de tube PE50 dans l'adaptateur en silicone.
- Accrochez le Pipetman sur le côté de la hotte et le ruban du tube PE50 au mur capuche supérieur des îlots à la pointe. Cela permettra de régler les îlots seulement dans la pointe de la pipette.
- Transfert des îlots dans la tubulure PE50 par lentement composant le Pipetman et en déplaçant les îlots dans la tubulure PE50, en faisant attention de ne pas expulser les îlots de la fin.
- Faire un coude dans l'extrémité biseautée du tube PE50. Tout en conservant le pli, débrancher le tube adaptateur en silicone du Pipetman et sécuriser le pli avec l'adaptateur en silicone.
- Placez les îlots, dans le tube PE50, côté silicone tube plié l'adaptateur vers le bas, dans un coniques de 15 ml avec une pipette de réduire de 5 ml et bande les tubes PE50 sur le côté de la pipette 5 ml d'éviter de curling du tube PE50 tandis centrifugation.
- Centrifuger les Coniques PE50/15mL à 1000 rpm et éteindre la centrifugeuse. (Ne jamais préparer plus de 10 préparations d'îlots à un moment).
- Placer le tube sur la glace.
Préparation de la souris pour la transplantation
- Anesthésier la souris avec isofluorane ou avec la kétamine / Xylexene (voir protocole de préparation).
- Après anesthésie a pris affectent, se raser le flanc gauche de la souris.
- Swab la peau de souris, le centre-out, avec un tampon povidone iodée et puis essuyez avec un tampon d'EtOH.
- Localisez le rein gauche (juste à droite de la rate). Faire une petite incision dans la peau, ce qui expose le péritoine.
- Faire une petite incision dans le péritoine d'exposer le rein. Garder la petite incision aidera à garder les reins soulevés et exposés.
- Appliquez une légère pression des deux côtés de l'incision, d'augmenter ou de pop le rein de la souris.
- Gardez l'humidité du rein en appliquant une solution saline normale avec un coton-tige.
- En utilisant une seringue 23 ou 25 aiguille de la jauge, faire une petite rayure sur le flanc droit du rein, créant une entaille dans la capsule du rein; pas trop profond ou trop grand.
Transplantation d'îlots
Note: Bien que la souris est en préparation pour Tx, la deuxième personne devrait préparer le Hamilton-vis de greffe d'îlots entraînement de la seringue.
- Lentement retirer le tube de silicone adaptateur de la tubulure PE50 tout en gardant le coude dans le tube.
- Placez l'extrémité opposée du tube PE50 dans le tube adaptateur en silicone et placez le tube adaptateur en silicone sur la pointe de la pipette attaché à la «vis-lecteur" seringue en verre de Hamilton. Relâchez doucement le pli dans le tube PE50, en s'assurant que les îles ne s'échappent.
- Advance les îlots lentement vers l'extrémité du tube PE50 utilisant la "vis" mécanisme, mais garder une petite bulle d'air à l'avant des îlots dans la tubulure PE50.
- Into the nick faite dans les reins, glissez soigneusement le tube PE50 sous la capsule, ce qui rend une petite poche. Soyez très prudent pour ne pas crever le rein ou la perforation grâce à la capsule.
- Il aide à garder la zone humide et capsule avec une solution saline normale-Gentamycine coton imbibé-tige; une capsule sèche va se déchirer facilement.
- Déplacez doucement le tube dans toutes les directions, créant une «poche» pour les îlots transplantés pour se reposer. N'oubliez pas de réappliquer supplémentaires sérum physiologique pour garder la zone humide.
- Sous la direction de la personne qui a ouvert la souris et qui a placé le tube PE50 sous la capsule rénale, la deuxième personne, qui a préparé la souris et d'une seringue Hamilton de greffe, va avancer lentement îlots sous la capsule, l'intérieur de la «poche», derrière une petite bulle d'air délivré par le tube PE50, jusqu'à ce que tous les îlots sont transplantés.
- Retirer lentement le tube PE50, sécher la zone avec un écouvillon sec et soigneusement cautériser le nick à basse température.
- En utilisant un coton-tige sec, s'assurer que tous les saignements ont cessé. Une fois l'arrêt du saignement, ré-humidifier les reins avec une solution saline stérile, et doucement remplacer les reins dans le péritoine avant la clôture de la souris avec suture et des agrafes cutanées.
Fermeture / Relance de la souris
- Fermer le péritoine avec un point en cours en utilisant 5-0 sutures de soie w / une aiguille 19mm C-6.
- En utilisant une pince tirer des deux côtés de l'incision cutanée ensemble.
- Agrafer la peau avec 2 ou 3 agrafes.
- Nettoyer la peau de la souris de tout le sang, à l'aide d'un coton-tige et Saline.
- Traiter immédiatement de la souris avec une injection sous-cutanée de flunixine et la buprénorphine.
- Placez la souris dans une cage, qui est placé sur un coussin chauffant ou en dessous d'une lampe chauffante, jusqu'à ce que la souris est pleinement active.
- Retirez les agrafes cutanées dans 2 semaines.
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Discussion
Ce protocole prévoit une option pratique et efficace pour la prestation proprement et facilement les îlots ou de cellules sous la capsule rénale de souris diabétiques ou normale. La technique de concentration et de granulation des îlots ou de cellules dans la tubulure de livraison finale (PE50) utilisé pour la transplantation des cellules sous la capsule rénale offre une méthode facile et efficace de la transplantation de cellules, tout en réduisant les stress indu aux cellules ou à la souris.
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Acknowledgments
UCSF Diabetes Center. NIH UCSF DERC Islet Core. FRDJ. LifeScan Inc Johnson & Johnson Company.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical gloves | Fisher Scientific | 11-394-95(sz) | |
| Surgical scrub sponges | Moore Medical | 42940AK | |
| Forceps | Miltex Inc. | 6-114 and 6-26 | 2 with teeth, 2 straight |
| Dissecting scissors n=2 | Miltex Inc. | 5-290 | |
| Oster razor (sz. 40 blade) | Fisher Scientific | 01-305-10B | |
| 4x4 Sterile gauze pads | Moore Medical | 08252AK | |
| Povidone Iodine pads | Moore Medical | 08486AK | |
| Alcohol pads | Fisher Scientific | 14-819-2 | |
| Heating pad | Moore Medical | 42508AK | |
| 23G or 25G needles | 1" long | ||
| Cidex solution | Moore Medical | 07535AK | for cleaning/santizing instruments |
| PE50 polyethylene tubing | BD Biosciences | 427411 | PE50, 0.965mm O.D. x 0.58mm I.D. |
| Cidex + 28 day soln | Moore Medical | 35625AK | |
| Silicone tubing | Spectrum Chromat. | 123732 | 5/32”OD x 1/32” ID |
| Instrument sterilizing container | Moore Medical | 39074AK | |
| Straight Pipet Tips | USA Scientific, Inc. | 1111-0810 | sterile |
| Glass syringe w/screw-drive | Hamilton Co | 1001 | |
| Cauterizing tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS230 | |
| Needle Holder | Moore Medical | 41-067 | |
| 5-0 silk | LOOK Surgical | 754B | for suture (6-C) |
| Cotton tipped swab | Moore Medical | ||
| 9mm autoclip stapler | BD Biosciences | 7630 | |
| 9mm staples | BD Biosciences | 7631 | |
| 9mm staple remover | BD Biosciences | 7637 |
References
- Tang, Q., Henriksen, K. J., Bi, M., Finger, E. B., Szot, G., Ye, J., Masteller, E. L., McDevitt, H., Bonyhadi, M., Bluestone, J. A. In vitro-expanded antigen-specific regulatory T cells suppress autoimmune diabetes. J Exp Med. 199, 1455-1465 (2004).
- Rulifson, I. C., Szot, G. L., Palmer, E., Bluestone, J. A. Inability to induce tolerance through direct antigen presentation. Am J Transplant. 2, 510-519 (2002).
- Lenschow, D. J., Zeng, Y., Hathcock, K. S., Zuckerman, L. A., Freeman, G., Thistlethwaite, J. R., Gray, G. S., Hodes, R. J., Bluestone, J. A. Inhibition of transplant rejection following treatment with anti-B7-2 and anti-B7-1 antibodies. Transplantation. Transplantation. 60, 1171-1178 (1995).
- Lenschow, D. J., Zeng, Y., Thistlethwaite, J. R., Montag, A., Brady, W., Gibson, M. G., Linsley, P. S., Bluestone, J. A. Long-term survival of xenogeneic pancreatic islet grafts induced by CTLA4lg. Science. 257, 789-792 (1992).
