Summary
وقد تم تطوير بروتوكول لدينا نظيفة وسهولة إيصال الجزر أو الخلايا تحت الكبسولة الكلى من الفئران. وتتركز الخلايا في الكريات في الأنابيب المستخدمة النهائية لزرع الخلايا تحت الكبسولة الكلى. سهولة هذا الأسلوب يقلل من الإجهاد على الخلايا والماوس.
Abstract
وقد تم تطوير بروتوكول لدينا نظيفة وسهولة إيصال الجزر أو الخلايا تحت الكبسولة الكلى السكري أو من الفئران العادية. وجدنا أنه من الأسهل أن تركز على الجزر أو في خلايا الكريات في الأنبوب التسليم النهائي (PE50) تستخدم لزرع الخلايا تحت الكبسولة الكلى. توفر هذه التقنية على حد سواء بسرعة وسهولة مع الحد من أي ضغوط لا داعي لها على الخلايا أو الماوس.
التحميل : تسويتها ، منتقاة ، ويستنشق بعناية أو خلايا الجزر مكعبات قبالة الجزء السفلي من أنبوب microcentrifuge 1.5 مل باستخدام pipetteman P200 وعلى التوالي ، غيض ماصة رقيقة الجدار. ومرفق طول أنابيب PE50 إلى الطرف ماصة تستخدم محول السيليكون الصغيرة الأنابيب. ويسمح للخلايا لتسوية ، في تلميح ، ومن ثم يتم نقلها إلى أنابيب PE50 عن طريق الاتصال برقم pipetteman ببطء. مرة واحدة في الخلايا قرب نهاية الأنبوب PE50 ، يتم إجراء شبك ويتم وضع أنابيب محول السيليكون خلال شبك. ينقل الأنبوب PE50 إلى 15 مل مل مخروطي يحتوي على قطع الماصة 5 ، وسجلت أكثر من الأنبوب PE50 جانب الماصة 5 مل لمنع الطرد المركزي خلال الشباك. ويسمح للخلايا لتصل إلى 1000 دورة في الدقيقة ، وتوقفت.
زرع : الفئران هي تخدير المتلقي ، حلق ، وتنظيفها. يتم إجراء شق صغير في الجهة اليمنى من الماوس وتتعرض الكلى. يتم الاحتفاظ في الكلى ، والدهون ، والأنسجة رطبة مع مسحة ملحي عادي. ويرد في نهاية البعيدة للPE50 إلى محرك هاميلتون حقنة المسمار ، وتحتوي على معلومات سرية ماصة ، وذلك باستخدام أنابيب محول السيليكون. وقدم نيك صغيرة على الجانب الجهة اليمنى في الكلى ، وليس غاية ولا كبيرة عميق جدا. نهاية مشطوف من أنابيب PE50 ، أقرب الخلايا ، وضعت بعناية تحت الكبسولة ، يتم نقل الأنابيب حول بلطف لافساح المجال بينما ينظف المالحة العادية ؛ كبسولة الجافة يمكن أن تمزق بسهولة. يتم تسليم فقاعة الهواء الصغيرة تحت الكبسولة ببطء عن طريق الاتصال برقم محرك المسمار المحاقن. ثم يتم تسليم الجزر ببطء وراء فقاعة الهواء. يتم الاحتفاظ بمجرد تسليم الجزر التوازن الكلى وأكتوي من المواهب مع الحرارة المنخفضة. يتم وضع الكلى مرة أخرى في التجويف وتتم خياطة الجلد والغشاء البريتوني وتدبيس. وتعامل على الفور مع الفئران فلونيكسين والبوبرينورفين مربع وضعت في قفص على وسادة التدفئة.
Protocol
إعداد الفشوت لزرع (تكساس)
- تحت المجهر المقلوب ، ومن ناحية اختيار الجزر باستخدام pipetman P200 ومباشرة من طرف الماصة الجزر مثقف في صفيحة 100mm.
- 100 عدد الجزر في وقت واحد ونقل في كل أنبوب microcentrifuge (~ 500 الجزر / أنبوب / الماوس).
- السماح لتسوية الجزر إلى أسفل الأنابيب microcentrifuge.
- تعادل واحد في جزيرة بيليه pipetman P200 (وضعت في 130ul) باستخدام الماصة على التوالي تلميح رقيقة الجدار.
- وضع محول أنبوب السيليكون أكثر من طرف الحقنة. إدراج طول أنابيب PE50 في محول السيليكون.
- يتعطل pipetman إلى جانب غطاء المحرك والشريط الأنبوب PE50 على الحائط غطاء أعلى من الجزر الصغيرة في الطرف. وسوف تسمح هذه الجزر لتسوية فقط في غيض من ماصة.
- نقل الجزر في أنابيب PE50 عن طريق الاتصال ببطء pipetman وتحريك الجزر في أنابيب PE50 ، والحرص على عدم طرد الجزر من نهاية المباراة.
- جعل عقدة في نهاية مشطوف من أنابيب PE50. مع الحفاظ على شبك ، قطع الأنابيب محول السيليكون من pipetman وتأمين شبك مع محول السيليكون.
- وضع الجزر ، في PE50 أنابيب ، جنبا سيليكون متلوى أنابيب محول إلى أسفل ، إلى 15 مليلتر المخروطية مع مل الماصة 5 و قطع الشريط أنابيب PE50 على جانب الماصة 5 مل لمنع الشباك من أنابيب PE50 حين الطرد المركزي.
- أجهزة الطرد المركزي في conicals PE50/15mL إلى 1000 دورة في الدقيقة وإيقاف الطرد المركزي. (إعداد التحضيرات أبدا أكثر من 10 جزيرة في وقت واحد).
- أنبوب مكان على الجليد.
إعداد فأرة للزراعة
- تخدير الفئران مع isofluorane أو مع الكيتامين / Xylexene (انظر بروتوكول الإعداد).
- بعد التخدير قد اتخذت تؤثر ، حلق الجناح الأيسر من الماوس.
- المسحة جلد الفأر ، ومركز التدريجي ، مع مسحة بوفيدون اليود ثم تمحو مع مسحة ETOH.
- موقع الكلية اليسرى (الحق فقط للطحال). إجراء شق صغير في الجلد ، مما يعرض في الغشاء البريتوني.
- إجراء شق صغير في الصفاق تعريض الكلى. والحفاظ على شق صغير يساعد في الحفاظ على الكلى وأثار المكشوفة.
- تطبيق ضغط خفيف على جانبي الشق ، ورفع البوب أو الكلى من الماوس.
- الحفاظ على رطوبة الكلى عن طريق تطبيق المالحة طبيعية مع مسحة من القطن يميل.
- باستخدام الحقنة 23 أو 25 إبرة قياس ، وجعل خدش صغير على الجهة اليمنى في الكلى ، وخلق نك في كبسولة الكلى ، ليست عميقة جدا أو كبيرة جدا.
زرع الفشوت
ملاحظة : في حين يجري حاليا إعداد الماوس لتكساس ، والشخص الثاني يجب إعداد جزيرة هاملتون زرع المسمار محرك المحاقن.
- إزالة الأنبوب ببطء محول السيليكون من أنابيب PE50 مع الحفاظ على شبك في الأنابيب.
- مكان الطرف الآخر من الأنبوب PE50 في سيليكون أنابيب محول ووضع أنابيب محول سيليكون على طرف ماصة تعلق على "المسمار محرك" هاملتون الزجاج المحاقن. الافراج عن ببطء شبك في أنابيب PE50 ، والتأكد من أن الجزر لا يتسرب.
- تقدم الجزر ببطء لغيض من أنابيب PE50 باستخدام "المسمار" آلية ، ولكن تبقى فقاعة الهواء الصغيرة في الجزء الأمامي من الجزر في أنابيب PE50.
- في النك المحرز في الكلى ، والشريحة بعناية في أنابيب تحت PE50 الكبسولة ، مما يجعل جيب صغيرة. يكون حريصا جدا على ألا مجوب الكلى أو من خلال ثقب الكبسولة.
- أنها تساعد على إبقاء المنطقة رطبة وكبسولة مع القطن المالحة الجنتاميسين العادي يميل مسحة غارقة ؛ كبسولة الجافة سوف يتمزق بسهولة.
- تحرك بلطف الأنابيب في كل الاتجاهات ، وخلق "جيب" لزرع جزيرات للراحة. تذكر أن تطبيق المالحة العادي إضافية للحفاظ على المنطقة رطبة.
- وبتوجيه من الشخص الذي فتح الفأرة والذي وضع أنابيب تحت PE50 كبسولة الكلى ، والشخص الثاني ، الذي أعد الماوس وهاملتون حقنة الزرع ، يتقدم ببطء الجزر تحت الكبسولة ، في داخل "جيب" ، وراء فقاعة الهواء الصغيرة التي ألقاها أنابيب PE50 ، حتى في الجزر كلها المزروعة.
- إزالة الأنبوب ببطء PE50 وجافة في منطقة ذات المسحة الجافة ويكوي بعناية النك مع الحرارة المنخفضة.
- باستخدام قطعة من القطن الجاف يميل المسحة ، تأكد من جميع النزيف قد توقف. بمجرد توقف النزيف ، وإعادة ترطيب الكلى مع المالحة عقيمة ، واستبدالها بلطف الكلى البريتوني في قبل إغلاق الفأر مع خياطة الجلد والمواد الغذائية.
إغلاق / إحياء ماوس
- إغلاق الصفاق مع غرزة باستخدام خيوط الحرير تشغيل 5-0 ث / إبرة C - 6 19mm.
- ملقط باستخدام رسم جانبي شق الجلد معا.
- التيلة الجلد مع 2 أو 3 من السلع الاساسية.
- تنظيف البشرة من الفأرة من أي دم ، وذلك باستخدام قطعة من القطن المسحة ويميل ساليه.
- علاج فورا الماوس مع الحقن تحت الجلد من فلونيكسين والبوبرينورفين.
- ضع الماوس في قفص ، التي يتم وضعها على وسادة التدفئة أو تحت مصباح التدفئة ، حتى الماوس نشط بشكل كامل.
- إزالة الجلد من السلع الاساسية في 2 أسابيع.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هذا البروتوكول يوفر خيار عملي وفعال لإيصال نظيفة بسهولة والجزر أو الخلايا تحت الكبسولة الكلى السكري أو من الفئران العادية. أسلوب التركيز والتكوير الجزر أو الخلايا في أنابيب التسليم النهائي (PE50) تستخدم لزرع الخلايا تحت الكبسولة الكلى توفر طريقة سهلة وفعالة لزرع الخلايا مع الحد من أي ضغوط لا داعي لها على الخلايا أو الماوس.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
UCSF مركز السكري. NIH UCSF الأساسية DERC جزيرة. JDRF. ايفسكان شركة جونسون آند جونسون الشركة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical gloves | Fisher Scientific | 11-394-95(sz) | |
| Surgical scrub sponges | Moore Medical | 42940AK | |
| Forceps | Miltex Inc. | 6-114 and 6-26 | 2 with teeth, 2 straight |
| Dissecting scissors n=2 | Miltex Inc. | 5-290 | |
| Oster razor (sz. 40 blade) | Fisher Scientific | 01-305-10B | |
| 4x4 Sterile gauze pads | Moore Medical | 08252AK | |
| Povidone Iodine pads | Moore Medical | 08486AK | |
| Alcohol pads | Fisher Scientific | 14-819-2 | |
| Heating pad | Moore Medical | 42508AK | |
| 23G or 25G needles | 1" long | ||
| Cidex solution | Moore Medical | 07535AK | for cleaning/santizing instruments |
| PE50 polyethylene tubing | BD Biosciences | 427411 | PE50, 0.965mm O.D. x 0.58mm I.D. |
| Cidex + 28 day soln | Moore Medical | 35625AK | |
| Silicone tubing | Spectrum Chromat. | 123732 | 5/32”OD x 1/32” ID |
| Instrument sterilizing container | Moore Medical | 39074AK | |
| Straight Pipet Tips | USA Scientific, Inc. | 1111-0810 | sterile |
| Glass syringe w/screw-drive | Hamilton Co | 1001 | |
| Cauterizing tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS230 | |
| Needle Holder | Moore Medical | 41-067 | |
| 5-0 silk | LOOK Surgical | 754B | for suture (6-C) |
| Cotton tipped swab | Moore Medical | ||
| 9mm autoclip stapler | BD Biosciences | 7630 | |
| 9mm staples | BD Biosciences | 7631 | |
| 9mm staple remover | BD Biosciences | 7637 |
References
- Tang, Q., Henriksen, K. J., Bi, M., Finger, E. B., Szot, G., Ye, J., Masteller, E. L., McDevitt, H., Bonyhadi, M., Bluestone, J. A. In vitro-expanded antigen-specific regulatory T cells suppress autoimmune diabetes. J Exp Med. 199, 1455-1465 (2004).
- Rulifson, I. C., Szot, G. L., Palmer, E., Bluestone, J. A. Inability to induce tolerance through direct antigen presentation. Am J Transplant. 2, 510-519 (2002).
- Lenschow, D. J., Zeng, Y., Hathcock, K. S., Zuckerman, L. A., Freeman, G., Thistlethwaite, J. R., Gray, G. S., Hodes, R. J., Bluestone, J. A. Inhibition of transplant rejection following treatment with anti-B7-2 and anti-B7-1 antibodies. Transplantation. Transplantation. 60, 1171-1178 (1995).
- Lenschow, D. J., Zeng, Y., Thistlethwaite, J. R., Montag, A., Brady, W., Gibson, M. G., Linsley, P. S., Bluestone, J. A. Long-term survival of xenogeneic pancreatic islet grafts induced by CTLA4lg. Science. 257, 789-792 (1992).
