Summary
Nosso protocolo foi desenvolvido para fornecer precisão e facilidade ilhotas ou células sob a cápsula renal de camundongos. Células estão concentradas em pelotas na tubulação final utilizada para o transplante de células sob a cápsula renal. A facilidade desta técnica reduz o estresse nas células e mouse.
Abstract
Nosso protocolo foi desenvolvido para fornecer precisão e facilidade ilhotas ou células sob a cápsula renal de ratos diabéticos ou normal. Descobrimos que era mais fácil concentrar as ilhotas ou células em pelotas na tubulação de entrega final (PE50) utilizado para o transplante de células sob a cápsula renal. Esta técnica fornece a velocidade e facilidade, reduzindo qualquer estresse para as células ou para o mouse.
Loading: Settled, escolhidos a dedo, ou células ilhotas peletizadas são cuidadosamente aspirado fora da parte inferior de um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL usando um pipetteman p200 e uma reta, de parede fina ponta da pipeta. Um comprimento de tubos PE50 está ligado à ponta da pipeta usando um tubo de pequeno adaptador silicone. Células estão autorizados a resolver, na ponta, e depois são transferidos para o tubo PE50 lentamente por marcar o pipetteman. Uma vez que as células estão perto do fim do tubo PE50, uma torção é feita eo adaptador de tubo de silicone é colocado sobre o kink. A tubulação PE50 é transferido para a 15 mL uma pipeta de corte cônico contendo 5 mL, e os tubos PE50 é gravado sobre o lado da pipeta de 5 mL para evitar curling durante a centrifugação. Células podem chegar a 1.000 rpm e parou.
Transplante: ratos são anestesiados destinatário, raspada e limpa. Uma pequena incisão é feita no flanco esquerdo do mouse e do rim está exposto. O rim, tecido adiposo, tecido e são mantidas úmidas com uma compressa de soro fisiológico. A extremidade distal do PE50 é anexado a uma seringa Hamilton movimentação do parafuso, contendo uma ponta de pipeta, usando o tubo adaptador silicone. Um nick pequeno é feito no lado do flanco direito do rim, não muito grande nem muito profundo. O fim chanfrada do tubo PE50, mais próximo das células, é cuidadosamente colocada sob a cápsula, a tubulação é movido suavemente para dar espaço ao mesmo tempo limpando soro fisiológico; uma cápsula seca pode rasgar facilmente. Uma pequena bolha de ar é fornecido sob a cápsula por lentamente marcação da unidade de rosca seringa. Ilhotas são entregues em seguida, lentamente por trás da bolha de ar. Homeostase renal uma vez que as ilhotas foram entregues é mantido e os knick é cauterizado com fogo baixo. O rim é colocado de volta na cavidade e do peritônio e da pele são suturados e grampeados. Ratos são imediatamente tratados com Flunixina quadrados e buprenorfina e colocado em uma jaula em uma almofada de aquecimento.
Protocol
Preparação de Ilhotas para Transplante (Tx)
- Em microscópio invertido, mão pick-ilhotas usando um Pipetman P200 e ponta da pipeta em linha reta do ilhotas cultivadas em uma placa de 100mm.
- Contagem de 100 ilhotas de cada vez e transferir para cada tubo de microcentrífuga (~ 500 ilhotas tubo / / mouse).
- Permitir ilhotas para resolver a parte inferior dos tubos de microcentrífuga.
- Desenhe uma das ilhotas pellet em um Pipetman P200 (fixado em 130ul) usando uma ponta da pipeta em linha reta de parede fina.
- Coloque um adaptador de tubo de silicone sobre a ponta da seringa. Inserir um comprimento de tubulação PE50 no adaptador silicone.
- Pendurar o Pipetman para o lado da capa e fita da tubulação PE50 à parede capô superior as ilhotas na ponta. Isso permitirá que as ilhotas de resolver apenas na ponta da pipeta.
- Transferência das ilhotas na tubulação PE50 por lentamente discar o Pipetman e movendo as ilhotas na tubulação PE50, tomando cuidado para não expulsar os ilhéus a partir do final.
- Faça uma torção no final chanfrada do tubo PE50. Mantendo a torção, desconecte o tubo adaptador de silicone do Pipetman e segura a torção com o adaptador silicone.
- Coloque as ilhotas, no PE50 tubulação dobrada lado de silicone, tubo adaptador para baixo, em um 15 ml cônico com uma pipeta mL cortar 5 e tape o tubo PE50 sobre o lado da pipeta de 5 mL para evitar curling da tubulação PE50 enquanto centrifugação.
- Centrifugar a conicals PE50/15mL a 1000 rpm e desligar centrífuga. (Nunca prepare mais de 10 preparações das ilhotas de uma só vez).
- Coloque o tubo no gelo.
Preparação de mouse para Transplante
- Anestesiar os ratos com isofluorano ou com Ketamina / Xylexene (ver protocolo de preparação).
- Após anestesia tomou afeto, raspar o flanco esquerdo do mouse.
- Swab pele de rato, centro-out, com swab iodopovidona e depois limpe com um algodão embebido em álcool etílico.
- Localizar o rim esquerdo (logo à direita do baço). Fazer uma pequena incisão na pele, expondo o peritônio.
- Fazer uma pequena incisão no peritônio expor o rim. Mantendo a pequena incisão irá ajudar na manutenção do rim levantadas e expostas.
- Aplique uma leve pressão para ambos os lados da incisão, aumentar ou pop do rim para fora do mouse.
- Manter a umidade do rim através da aplicação de soro fisiológico com um algodão com ponta cotonete.
- Usando uma seringa de 23 ou 25 agulha, faça um pequeno arranhão no flanco direito do rim, a criação de um nick na cápsula renal, não muito profundas ou muito grande.
Transplante de ilhotas
Nota: Enquanto o mouse está sendo preparado para Tx, a segunda pessoa deve preparar o Hamilton parafuso drive-seringa transplante de ilhotas.
- Lentamente, retirar a mangueira do adaptador de silicone do tubo PE50, mantendo o kink na tubulação.
- Coloque a extremidade oposta do tubo PE50 no tubo adaptador de silicone e colocar o tubo adaptador de silicone na ponta da pipeta anexado à seringa de vidro "parafuso-drive" Hamilton. Lentamente, liberte o kink na tubulação PE50, certificando-se que as ilhas não vazar.
- Avançar a ilhotas lentamente até a ponta do tubo PE50 usando o "parafuso" mecanismo, mas manter uma pequena bolha de ar na frente das ilhotas na tubulação PE50.
- Para o nick fez no rim, deslize cuidadosamente o tubo PE50 sob a cápsula, fazendo uma pequena bolsa. Tenha muito cuidado para não arrancar o rim ou punção através da cápsula.
- Ela ajuda a manter a área e úmido de algodão cápsula com solução salina Gentamicina normais embebido ponta cotonete; uma cápsula seca vai rasgar facilmente.
- Mova cuidadosamente o tubo em todas as direções, criando uma "bolsa" para as ilhotas transplantadas para descansar. Lembre-se de reaplicar o soro fisiológico adicional para manter a área úmida.
- Sob a direção da pessoa que abriu o mouse e que tem colocado o tubo PE50 sob a cápsula renal, a segunda pessoa, que preparou o mouse e Hamilton seringa transplante, lentamente vai avançar ilhéus sob a cápsula, dentro do "bolso", atrás de uma pequena bolha de ar emitido pela tubulação PE50, até que todas as ilhotas são transplantadas.
- Lentamente, retirar a mangueira PE50, seque a área com um cotonete seco e cuidadosamente cauterizar o nick em lume brando.
- Usando um cotonete de algodão seco ponta, certifique-se todas as sangramento parou. Uma vez que o sangramento parou, re-umedecer o rim com solução salina estéril, e gentilmente substituir o rim para o peritônio antes do fechamento do mouse com grampos de sutura e pele.
Fechamento / Revival of Mouse
- Fechar o peritônio com um ponto em execução usando seda 5-0 w / a agulha C-6 19mm.
- Forceps desenhar usando ambos os lados da incisão na pele junto.
- Pele o grampo, juntamente com 2 ou 3 grampos.
- Limpe a pele do mouse de qualquer sangue, usando um cotonete de algodão com ponta e saline.
- Imediatamente tratar o mouse com uma injeção subcutânea de Flunixina e buprenorfina.
- Posicione o mouse em uma gaiola, que é colocada sobre uma almofada de aquecimento ou abaixo de uma lâmpada de aquecimento, até que o mouse é totalmente ativo.
- Remova os grampos de pele em duas semanas.
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Discussion
Este protocolo fornece uma opção prática e eficiente para fornecer precisão e facilidade ilhotas ou células sob a cápsula renal de ratos diabéticos ou normal. A técnica de concentração e as ilhotas de granulação ou células ao tubo de final (PE50) utilizado para o transplante de células sob a cápsula renal oferece um método fácil e eficaz de transplante de células, reduzindo qualquer estresse para as células ou para o mouse.
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Acknowledgments
UCSF Diabetes Center. NIH UCSF DERC Núcleo Islet. JDRF. LifeScan Inc. Johnson & Johnson Company.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical gloves | Fisher Scientific | 11-394-95(sz) | |
| Surgical scrub sponges | Moore Medical | 42940AK | |
| Forceps | Miltex Inc. | 6-114 and 6-26 | 2 with teeth, 2 straight |
| Dissecting scissors n=2 | Miltex Inc. | 5-290 | |
| Oster razor (sz. 40 blade) | Fisher Scientific | 01-305-10B | |
| 4x4 Sterile gauze pads | Moore Medical | 08252AK | |
| Povidone Iodine pads | Moore Medical | 08486AK | |
| Alcohol pads | Fisher Scientific | 14-819-2 | |
| Heating pad | Moore Medical | 42508AK | |
| 23G or 25G needles | 1" long | ||
| Cidex solution | Moore Medical | 07535AK | for cleaning/santizing instruments |
| PE50 polyethylene tubing | BD Biosciences | 427411 | PE50, 0.965mm O.D. x 0.58mm I.D. |
| Cidex + 28 day soln | Moore Medical | 35625AK | |
| Silicone tubing | Spectrum Chromat. | 123732 | 5/32”OD x 1/32” ID |
| Instrument sterilizing container | Moore Medical | 39074AK | |
| Straight Pipet Tips | USA Scientific, Inc. | 1111-0810 | sterile |
| Glass syringe w/screw-drive | Hamilton Co | 1001 | |
| Cauterizing tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS230 | |
| Needle Holder | Moore Medical | 41-067 | |
| 5-0 silk | LOOK Surgical | 754B | for suture (6-C) |
| Cotton tipped swab | Moore Medical | ||
| 9mm autoclip stapler | BD Biosciences | 7630 | |
| 9mm staples | BD Biosciences | 7631 | |
| 9mm staple remover | BD Biosciences | 7637 |
References
- Tang, Q., Henriksen, K. J., Bi, M., Finger, E. B., Szot, G., Ye, J., Masteller, E. L., McDevitt, H., Bonyhadi, M., Bluestone, J. A. In vitro-expanded antigen-specific regulatory T cells suppress autoimmune diabetes. J Exp Med. 199, 1455-1465 (2004).
- Rulifson, I. C., Szot, G. L., Palmer, E., Bluestone, J. A. Inability to induce tolerance through direct antigen presentation. Am J Transplant. 2, 510-519 (2002).
- Lenschow, D. J., Zeng, Y., Hathcock, K. S., Zuckerman, L. A., Freeman, G., Thistlethwaite, J. R., Gray, G. S., Hodes, R. J., Bluestone, J. A. Inhibition of transplant rejection following treatment with anti-B7-2 and anti-B7-1 antibodies. Transplantation. Transplantation. 60, 1171-1178 (1995).
- Lenschow, D. J., Zeng, Y., Thistlethwaite, J. R., Montag, A., Brady, W., Gibson, M. G., Linsley, P. S., Bluestone, J. A. Long-term survival of xenogeneic pancreatic islet grafts induced by CTLA4lg. Science. 257, 789-792 (1992).
