Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Revealing Kompleksi Beyin Topografya Wholemount İmmünohistokimya

Published: April 5, 2012 doi: 10.3791/4042
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Neuroscience, Albert Einstein College of Medicine, Yeshiva University, 2Department of Cell Biology and Anatomy and the Hotchkiss Brain Institute, Faculty of Medicine, University of Calgary

Summary

Nöral devreler topografik spesifik moleküler profilleri ile fonksiyonel bölme halinde düzenlenmiştir. Burada, çok yönlü bir wholemount immünohistokimyasal yaklaşımını kullanarak global beyin topoğrafya ortaya çıkarılması için pratik ve teknik adımları sağlar. Bu iyi anlaşılmış cytoarchitecture ve beyincik devre kullanarak yöntemin yardımcı göstermektedir.

Abstract

Serebellumun tekrarlanan ve iyi anlaşılmış hücresel mimarisi beyin topoğrafya keşfetmek için ideal bir model sistem haline getirmektedir. Nispeten homojen cytoarchitecture altında yatan gen ve protein ifade parasagital etki karmaşık bir dizidir. Serebellumun moleküler kompartımanlara afferent liflerin anatomik ve fonksiyonel organizasyon tarafından yansıtılır. Tam serebellar organizasyonun karmaşıklığını anlamak için, daha önce fare serebellumda desenlendirme kusurları yüksek verimlilik analizi için wholemount boyama yaklaşım rafine. Bu protokol ayrıntılı reaktiflerin, alet ve başarıyla wholemount immun kullanarak erişkin fare beyincik protein ekspresyonu ortaya çıkarmak için yararlı olan pratik adımları açıklar. Adımları burada beyin ince topografisi ile ortaya edilebilir bir örnek olarak zebrinII / aldolaseC ifadesi kullanılarak bu yöntemin yardımcı sergilemektediryerli üç boyutlu yapı. Ayrıca açıklanan moleküler topografya karşılaştırmalı çalışmalar için afferent projeksiyonları ve büyük cerebella protein ifade görselleştirme izin protokolü için uyarlamaları vardır. Bu uygulamaları göstermek için, sıçan serebellumun afferent boyama veri dahildir.

Protocol

1. Hayvan Perfüzyon ve Beyincik Diseksiyon

  1. Protein bağlı olarak, başarılı bir boyama 1,2 perfüzyon için gerekli olabilir. Transcardiac perfüzyon anesteziklerin doğru kullanımı gerektiren bir invaziv olmayan, hayatta kalma işlemdir. Doğru eğitim, kurumsal onayı ve IACUC onayı tüm prosedürü başlamadan önce gereklidir. Her zaman deneysel gereksinimleri belirlemek ve doğru eğitim edinme konusunda yardım almak için kurumun veteriner danışmak iyi bir fikirdir. İşlem öncesi, hayvan derin anestezi ve bu tür ayak veya kuyruk tutam gibi uyaranları olmamalıdır. Kullanımı makas karın cilt ve kas duvarındaki bir kesim yapmak ve daha sonra her iki tarafta sternum sadece komşu keserek göğüs kafesini açmaya devam etmektedir. Buna ek olarak, deneyci diyafram çevreleyen fasya kesim tarafından daha büyük bir iç çalışma alanı oluşturabilirsiniz. Karın ve göğüs duvarı Superio kaldırarakrly, kalp şimdi maruz kalacak. Dışarı çıkacak ve hemen sol ventrikül içine perfüzyon iğne eklemek için kan sağlamak için sağ atrium küçük bir kesim olun. Temel bir hidrostatik pompa (detaylar için bakınız Tablo 1) perfüzyon çözümleri sunmak için tercih edilir. İlk olarak, 0.1M fosfat ile kan dışarı akmasına sıvı berrak bitene kadar (PBS, bkz. Tablo 3) tamponlu tuz. Sonra, hidrostatik pompa kapatmak hızlı PBS ile sulandırılmış% 4 paraformaldehit bir konteyner (PFA, bkz. Tablo 3) çözüm teslimat tüp geçiş ve sonra fiksatif sunmak için geri pompa açın. Bir pompanın kullanılması gerekli değildir: uygulama ile, iki şırınga PBS ile doldurulur ve% 4 PFA yavaş çözümler sağlamak için kullanılabilir.
  2. Bu dikkatle dokuya herhangi bir lezyon tanıtımı olmadan kafatası beyin dışarı incelemek için çok önemlidir. Diseksiyon sırasında beyne bile küçük yaralanmalar yavaş yavaş görünür yarıklar içine genişletmek olacaktuzağı antikorlar ve doku (Şekil 2, örneğin kırmızı yıldız) ile işleme sırasında artefakt boyama neden olur. Serebellar disseksiyonlar için, başın orta aşağı cilt kesilmiş ve daha sonra yavaşça kafatası açığa kapakları dışında tease tipiktir. Dorsal orta hat boyunca posterior anterior gelen kafatası kesin, hem de yanal kafatasının her iki yanında. Bu beyincik nicklemek riskini taşır gibi bregma ötesinde kesmeyin. Forseps kullanarak hafifçe meninksler bağlı beyin dokusunun koparmak için dikkatli olmak beynin uzak kafatasının ön kısmını kaldırın. Beynin ventral tarafta kranial sinirler Sever.
  3. Beynin geri kalan kısmından ayrılması serebellum iki nedenle önemlidir. İlk olarak, yerinde colliculi tarafından görünümünden gizlidir ön lobules ifade desen keşfine izin verir. Ikinci bir küçük, izole bölgeye ayrılması doku m olanak sağlamasıdırbazı proteinlerin boyama kolaylaştırabilir cevheri tam tespit,. Bu son adım, diseksiyon boyunca bakım forseps uçları ile serebellum dokunmayın dikkat edilmelidir. Üst ve alt colliculi ortasına forseps bir çift ipuçları yerleştirin. Forseps ikinci bir set yavaş beyincik gelen inferior colliculi uzak alay ile. Onun ön tarafı aşağı bakacak ve beyin sapı yukarı bakacak şekilde Sonra, beyincik yatıyordu. Beyin sapı ve lobülleri IX / serebellumun X arasındaki dördüncü ventriküle forseps yerleştirin. Her iki tarafta forseps sıkıştırarak peduncles kesilmiş ve daha sonra yavaşça beyin sapı uzağa serebellum kaldırın. Beyincik izole edildikten sonra, 24-48 saat arasında en az 4 ° C sıcaklıkta% 4 PFA batırılarak post it-düzeltin. Beyincik uzun bir süre için% 4 PFA saklanabilir. Meninksler önce veya ifade kalıpları daha iyi görüş için boyama sonrası ya çıkarılmalıdır.Deneyci beyincik sürecinde nicked olacağını güçlü bir olasılık vardır boyama önce meninksler kaldırmak için seçerse. Onlar zayıf arka plan boyama kazanmak ve post-processing zayıf olduktan sonra bulmak daha kolay hale gelir, çünkü boyama işlemi sonunda meninksler uzakta Peeling çok daha kolaydır.

2. Wholemount Boyama için Doku İşleme

Wholemount boyama yaklaşımı artık doku kesitlerinde, immünohistokimyasal daha alır, çünkü (Tablo 2) sağlanan örnek takvimde gösterildiği gibi deneyler her biri için zaman çizelgesi planlamak için yararlıdır. Başlamadan önce, akılda tutulması gereken birkaç temel unsur vardır. 1) doku içeren mikrotüplerdeki donma / çözülme sürecinde hariç, her zaman bir nutator üzerinde rotasyona tabi tutulmalıdır. 2) Birkaç çözümleri (çözüm tarifleri için Tablo 3) Her bir deney için taze yapılmalıdır. 3)Protokol boyunca, çözümler değiştirirken, yavaşça beyincik dokunmamak için değil, forseps ile beyincik çıkarmadan daha geçirdi çözüm dökün. Daha sonra, başka bir konteynır içerisinde yeni çözüm karıştırıldıktan sonra yavaşça tüpüne taze çözeltisi eklemek için bir pipetle kullanımı.

2.1 1. Gün:

  1. 6-8 saat nutator hafifçe sallanan için oda sıcaklığında Dent düzeltme 3 serebellum sabitlemek. Metanol sizin antijen için yıkıcı ise, antijen alımı yöntemi ile 2.3a ile 2.1a adımları yerine düşünün. Antijen alımı için kullanılan ısı ve tamponlar antikor penetrasyon için doku hazırlamanıza yardımcı olacaktır.
  2. 4 gece boyunca Dent Bleach 3 Bleach serebellum ° C

2.2 2. Gün:

  1. 30 dk için oda sıcaklığında% 100 MeOH iki turda serebellum kurutmak.
  2. Sonra, konu, çözümlerin penetrasyonu arttırmak içindonma / çözülme döngüsü bir dizi doku. 30 dakika boyunca kuru buz ve dondurma ile bir kapta tüp dikkatlice yerleştirin. Sonra, tüpü çıkarın ve 15 dakika boyunca yedek kulübesinde oda sıcaklığında bekletin. Donma / çözülme adım dört kez (en az) yapılmalıdır.
  3. Dokusunda çözülme son sonra, bir gecede -80 ° C derin dondurucuya yerleştirilir.
  4. Doku -80 azından uzun süre saklanabilir ° C hemen önce veya donma / çözülme adım sonra ya. Aksi takdirde, protokolü devam ettirilmelidir.

2.3 3. Gün:

  1. 50% in yıkayarak serebellum rehidre MeOH/50% PBS,% 15 MeOH/85% PBS ve 60-90 dakika oda sıcaklığında her biri için 100% PBS.
  2. Sonraki, yetişkin fare cerebella, konu 2-3 dakika PBS içinde 10μg/ml Proteinaz K ile enzimatik sindirimi için doku için. Hayır sindirim adım genç hayvanların cerebella (fare P5 veya genç) için gereklidir. Uzun digestion daha büyük beyinler için önerilmektedir. Örneğin, sindirim primat beyinleri 4 için 5-6 dakika kadar yüksek olabilir.
  3. Sindiriminden sonra, hemen Proteinaz K kaldırmak için oda sıcaklığında 10 dakika için, her üç defa PBS içinde serebellum yıkayıp
  4. 4 gece boyunca (bkz. Tablo 3) PMT içinde doku Blok ° C Ucuzdur, çünkü Süt tozu genellikle protein çalışmaları için engelleyici bir ajan seçiminde ilk seçenektir, etkin bir arka plan boyama düşürür ve genellikle antikor bağlayıcı veya antijen erişim engel değildir. Deneyi eklendi maliyet farkında olmalıdır ve birinci çapraz-reaktif imünoglobülinler ve parazit oranı optimal bir sinyal üretmek için yeteneği serum kalitesini test gerekse de hayvan serumlar da kullanılabilir.

2.4 Gün 4-5:

  1. 4 ° C (larg azından 48 saat boyunca% 5 DMSO ile desteklenmiş PMT içinde seyreltilmiş Primer antikor olarak doku inkübeer cerebella) artış inkübasyon sürelerinde gerektirecektir.

2.5 6. Gün:

  1. Ilişkisiz Primer antikor kaldırmak için 4 ° C'de 2-3 saat PMT in her biri için serebellum 2-3 kez yıka.
  2. Sonra, 4 azından% 5 DMSO ile PMT ihtiva eden bir çözelti içinde sekonder antikor olarak doku inkübe ° C de bir gece (daha büyük cerebella gerektirebilir artış inkübasyon kez).

2.6 7. Gün:

  1. 4 ° C'de 2-3 saat PMT in her biri için serebellum 2-3 kez yıka
  2. Doku 1-2 saat boyunca PBT (bakınız Tablo 3) ile bir son yıkama verir. Bu adım, fazla süt kaldırır ve boyama netliğini artırır.
  3. Optimum leke yoğunluğu elde edilinceye kadar son olarak, DAB (3,3 '-diaminobenzidin) çözelti içinde doku inkübe edilir. Kahverengi reaksiyon ürünü ~ 10 dakika içinde açıkça görülür olmalıdır. Hafif yağış için kromojen neden olarak karanlıkta DAB kullanmak en iyisidirarka plan boyama artırabilir te.

2.7

Optimum leke yoğunluğu ulaşıldığında,% 0.04 sodyum azid ile PBS içinde serebellum yerleştirerek reaksiyonu durdurmak. Doku bu çözüm, uzun vadeli saklanabilir. Sodyum azid bakteri büyümesini güçlü bir inhibitörü olan, ancak, aynı zamanda yaban turpu peroksidaz inhibe eden bu adım kadar kaçınılmalıdır.

2.8 Opsiyonel amplifikasyon prosedürü:

Normal protokol izleyin ama bu adımları Yukarıdaki adımları 2.5b-2.7 yerine yapılmalıdır.

  1. 4 gece boyunca doku inkübe °% 5 DMSO ile PBST biotin-konjuge sekonder antikorlar (bkz. Tablo 3) C.
  2. 2-3 saat için oda sıcaklığında PBST 3-4 değişiklikler her biri için doku çalkalayın.
  3. 4 gece beyincik inkübe ° C PBST ABC karmaşık çözüm.
  4. 2-3 saat için her bir doku durulamaPBS 3-4 değişiklikler oda sıcaklığında.
  5. Yukarıda açıklandığı gibi, taze hazırlanmış DAB çözelti içinde dokusu, inkübe.
  6. Boyama uygun olduğunda,% 0.04 sodyum azid ile PBS içinde serebellum yıkanarak reaksiyonu durdurmak.

3. Görüntüleme Vitray Doku

  1. Wholemount görüntüleri örneğin kullanılarak yakalanan olabilir, bir Leica DFC3000 FX kamera Leica Application Suite FX yazılımı çalıştıran bir Leica MZ16 FA stereomikroskop üzerine monte edilmiş. Eğer istenirse, Dekonvolüsyonun mikroskopi her görüntünün kesin odak yalnızca tek bir lobülü sahip olacak şekilde farklı düzlemlerde çoklu fokal ardışık görüntü elde etmek için kullanılabilir. Sonra görüntüleri tek bir yığın ve bozulma kaldırmak için oluşturulan yazılım içine sıkıştırılmış olabilir. Son kompozit görüntü net odak Görünür tüm desenlendirme ile serebellar yüzey ekspresyonu örneklerle gösterecek.
  2. PBS dalmış iken Wholemount boyanan doku (veya verecek başka bir ortama yansıması olmalıdırOptimal refraktif indeks). Kolay görüntüleme için wholemount konumlandırmak için, bir plastik Petri kabındaki% 1 agar jel olun. Jel içine küçük delikler kesilir. Delikler beyincik istenen yönelim içine sıkışmış izin verir.
  3. Ham veri Adobe Photoshop CS4 ithal ve kontrast ve parlaklık seviyeleri için ayarlanır.

Hayvanlar

Tüm hayvan çalışmaları Albert Einstein Tıp Koleji kurumsal yönergelere göre onaylanmış bir IACUC hayvan protokol çerçevesinde gerçekleştirilmiştir. Erkek ve kadın outbred İsviçre Webster (Taconic, Albany, NY) farelerde bizim koloni bakımı ve tüm çalışmaları için kullanıldı. Ötenazi yetişkin sıçan nazik Dr Bryen Ürdün (Albert Einstein Tıp Koleji) tarafından sağlandı. Tüm hayvanlarda, en az bir aylık edildi.

4. Temsilcisi Sonuçlar

Beyincik dört enine bölgeye moleküler ifade tarafından bölümlere edilir:ön bölgesi (AZ: ~ lobülleri IV), merkez bölge (CZ: ~ lobüller VI-VII), posterior bölge (PZ: ~ lobülleri VIII-dorsal IX) ve nodüler bölge (NZ: ~ lobülleri IX ventral ve X ) 5. Her bir bölge parasagital çizgili 1,2,5,6 (Şekil 1) eşsiz bir dizisini içerir. Purkinje hücrelerinde ifadesi ZebrinII AZ ve PZ (Şekil 2) ve CZ ve NZ (Şekil 2) üniform ifade çizgili ortaya koymaktadır. Purkinje hücrelerinin parasagital organizasyonu afferent liflerin terminal saha topografyası tarafından yansıtılır. Kokain ve amfetamin-düzenlenmiş transkript (CART) peptid tırmanma lifleri (Şekil 3a) alt kümeleri ile ifade edilen bir serebellar korteks 7 (Şekil 3b) moleküler tabakasında Purkinje hücre dendritlerin şeritler proje. Gibi amplifikasyon 7 gibi uygun değişiklikleri ile, wholemount protokolü nee olmadan olivocerebellar desen görselleştirme sağlarboyama doku kesitlerinde (Şekil 3b) bir zahmetli, zaman alıcı rekonstrüksiyon için d.

Şekil 1
Şekil 1. A. ZebrinII / aldolaseC ifade beyincik enine bölümlerinde sagital bantları ortaya koymaktadır. Ölçek çubuğu = 500 mikron. B. ZebrinII / aldolaseC Purkinje hücre somata ve dendritler münhasıran ifade edilir. Ölçek çubuğu = 150μm (gl = granüler tabaka; pcl = Purkinje hücre tabakası; ml = moleküler tabaka).

Şekil 2
Şekil 2. ZebrinII / aldolaseC anterior (AZ), santral (CZ) ve beyincik posterior (PZ) bölgelerinin görüntüleri Purkinje hücre çizgiler gösteren boyanan bir wholemount beyincik. Burada da serebellum nicklemek olumsuz sonucu bir örneğini gösterir. Sonuçta elde edilen artefakt boyama belirtilirkırmızı yıldız ile. Ölçek çubuğu = 1 mm (LS = lobulus simpleks; PML = paramedian lobül; COP = copula'sı pyramidis).

Şekil 3


Şekil 3. A. CART moleküler tabaka fiber terminalleri tırmanma olarak ifade edilir. Ölçek çubuğu = 100 mikron. (Ml = moleküler tabaka; pcl = Purkinje hücre tabakası; gl = granüler tabaka) NZ CART ifade B. Wholemount immünhistokimya. Ölçek bar = 2 mm (COP = copula'sı pyramidis; PML = paramedian lobül; PFL = paraflokkulusun; FL = Flokulus).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Biz gelişmekte olan ve yetişkin beyninde açığa protein ekspresyonu için çok yönlü bir immunohistokimyasal yaklaşımı kullanarak başarılı wholemount boyanması için gerekli teknik detayları tarif var. Bu yaklaşım kullanılarak, karmaşık moleküler salgılanma modellerini analiz edilebilir ve beyin topografisi zahmetli ve zaman alıcı bir doku kesit prosedürler için gerek olmaksızın takdir.

Bu protokol, yetişkin 1,2,8,9 ve erken doğum sonrası fare serebellum 10,11,12 hem birkaç Purkinje hücre proteinlerinin ifadesini desenli ortaya çıkarmak için kullanılmıştır. Bizim orijinal çalışmalar da granüler tabakada pial yüzeyden ~ 250 mikron ikamet granül hücresi antijen ifadesi 1 ve anterogradely takip yosunlu lifler 2, incelenmesi için wholemount yaklaşımın yarar göstermiştir. Buna ek olarak, çeşitli çalışmalar proteinlerin başarılı boyanması için orijinal protokolüne modifikasyonlar yapmış in Purkinje hücreleri 1,13 (antijen alımı) ve afferent lifleri 7,14 (sinyal amplifikasyon; Şekil 2).. Ayrıca, wholemount immünohistokimyasal da birden fazla memeli 4,15 arasında cerebella ve nörodejeneratif hastalıkların 18,19 fare modellerinde haritası desenli Purkinje hücre kaybı için kullanılan kuş 16,17 türleri, uygulanan ve 20 kalp, akciğer leke modifiye edilmiştir 21, kranial sinirler 22 ve kornea sinirleri 23. Wholemount yöntemi 1,2 önceki açıklamaları ile mevcut protokolün başlıca ayrılış burada biz doku ve diseksiyon, daha iyi bir başarı için güncellenmiş bilgi prosedürü kullanarak, aynı zamanda doku sabitlemek için tam bir kılavuz sadece sağlamak olduğunu teknik derinliği Video resimde.

Wholemount boyama çeşitli sınırlamalar bulunmaktadır. İlk olarak, yalnızca yüzey kalıpları tipik ola olduğuCally fazla diseksiyon ve lekelenme olmadan ya da doku antikorlar inkübe olduğu süresini artırmadan görüntülendi. Bu foliasyon 1,2 nedeniyle gizliyse Ayrıca, boyama korteks içinde derin ulaşamayacaktır. Ancak, wholemount boyanan doku doku 1,2 içindeki derin hücresel ifade profilleri ortaya çıkarmak için, aynı veya başka bir antikor ile, işleme sonrası kesitli olması ve Debufflanır olabilir. İkinci olarak, bazik wholemount boyama protokolü uzundur. Her deneyci ampirik kendi antikor boyama etkinliğini belirlemek ve post-fiksasyon süresini kısaltacak, sayısı ve uzunluğu yıkama ve / veya kısaltabilir birincil antikorlar kuluçka süresini kısaltmak öneririz. Bu ayarlamalar ile protokol oldukça kısa sürede tamamlanabilir. Üçüncü olarak, büyük cerebella için wholemount boyama protokolü sınırlı quant pahalı ve / veya sadece mevcut olabilir antikor çözeltileri büyük miktarlar, gerektirirdahil etmeye çalışan. Bununla birlikte, -20 ° C'de çözelti dondurarak her bir çalışma sonra primer antikor kaydetmek mümkündür Her deneyci yeniden kullanılmadan önce kendi antikor dondurma dayanabilir belirlemek zorunda kalacak. Biz başarıyla zebrinII daha önce dondurulmuş alikotları kullanarak doku boyandı var. Dördüncü olarak, tüm antikorlar bazik wholemount yaklaşımı ile uyumludur. Örneğin, genellikle küçük bir ısı şoku proteini, HSP25 arasında çizgili ifadesi tespit etmek için kullanılan antikorlar, doku birinci antijeni alma 13 için işlenmiş olmasını gerektirir. Ne olursa olsun, boyama doku kesitlerinde olduğu gibi, sorun giderme antikor-antijen bağlama geleneksel yöntemleri de wholemount boyama optimize etmek için faydalı olduğu kanıtlanmıştır.

Şu anda floresan etiketli sekonder antikor ile kullanım için bizim wholemount protokol adapte olasılığını araştırıyor. Görüntü farklı renkli fluorop yeteneği ile donatılmış uygun bir mikroskop iledüşük güç altında hortumları, biri sadece aynı hayvanda birden Purkinje hücre haritaların organizasyonu analiz değil, muktedir değil, aynı zamanda Purkinje hücre çizgili desenler ve WGA-Alexa topografyasını üç boyutlu olarak afferent lifler etiketli arasındaki ilişkiyi inceleyecek 2,4.7,24. Ayrıca, büyük ölçekli gen ekspresyonu veritabanlarının son durumu (Allen Beyin Atlas, Genepaint, Beyin Gen Haritası) tüm beynin moleküler topografyası incelenmesi için tüm genom analizleri ile yüksek verimlilik wholemount yaklaşımı birleştirmek için yeni yollar açtık.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgments

RVS Yeshiva Üniversitesi Albert Einstein Tıp Koleji start-up fonları yeni araştırmacı tarafından desteklenmektedir.

References

  1. Sillitoe, R. V., Hawkes, R. Whole-mount Immunohistochemistry: A high-throughput screen for patterning defects in the mouse cerebellum. J. Histochem. Cytochem. 50, 235-244 (2002).
  2. Kim, S. -H., Che, P., Chung, S. -H., Doorn, D., Hoy, M., Larouche, M., Marzban, H., Sarna, J., Zahedi, S., Hawkes, R. Whole-Mount Immunohistochemistry of the Brain. Current Protocols in Neuroscience. , (2006).
  3. Dent, J. A., Polson, A. G., Klymkowsky, M. W. A whole-mount immunocytochemical analysis of the expression of the intermediate filament protein vimentin in Xenopus. Development. 105, 61-74 (1989).
  4. Sillitoe, R. V., Malz, C. R., Rockland, K., Hawkes, R. Antigenic compartmentation of the primate and tree shrew cerebellum: a common topography of zebrin II in Macaca mulatta and Tupaia belangeri. J. Anat. 204, 257-269 (2004).
  5. Ozol, K., Hayden, J. M., Oberdick, J., Hawkes, R. Transverse zones in the vermis of the mouse cerebellum. J. Comp. Neurol. 412, 95-111 (1999).
  6. Apps, R., Hawkes, R. Cerebellar cortical organization: a one-map hypothesis. Nat. Rev. Neurosci. 10, 670-681 (2009).
  7. Reeber, S. L., Sillitoe, R. V. Patterned expression of a cocaine- and amphetamine-regulated transcript peptide reveals complex circuit topography in the rodent cerebellar cortex. J. Comp. Neurol. 519, 1781-1796 (2011).
  8. Sarna, J. R., Marzban, H., Watanabe, M., Hawkes, R. Complementary stripes of phospholipase Cbeta3 and Cbeta4 expression by Purkinje cell subsets in the mouse cerebellum. J. Comp. Neurol. 496, 303-313 (2006).
  9. Demilly, A., Reeber, S. L., Gebre, S. A., Sillitoe, R. V. Neurofilament heavy chain expression reveals a unique parasagittal stripe topography in the mouse cerebellum. Cerebellum. 10, 409-421 (2011).
  10. Larouche, M., Hawkes, R. From clusters to stripes: the developmental origins of adult cerebellar compartmentation. Cerebellum. 5, 77-88 (2006).
  11. Marzban, H., Chung, S., Watanabe, M., Hawkes, R. Phospholipase Cbeta4 expression reveals the continuity of cerebellar topography through development. J. Comp. Neurol. 502, 857-871 (2007).
  12. Blank, M. C., Grinberg, I., Aryee, E., Laliberte, C., Chizhikov, V. V., Henkelman, R. M., Millen, K. J. Multiple developmental programs are altered by loss of Zic1 and Zic4 to cause Dandy-Walker malformation cerebellar pathogenesis. Development. 138, 1207-1216 (2011).
  13. Sawada, K., Sakata-Haga, H., Fukui, Y. Alternating array of tyrosine hydroxylase and heat shock protein 25 immunopositive Purkinje cell stripes in zebrin II-defined transverse zone of the cerebellum of rolling mouse. Nagoya. Brain Res. 1343, 46-53 (2010).
  14. Sawada, K., Fukui, Y., Hawkes, R. Spatial distribution of corticotropin-releasing factor immunopositive climbing fibers in the mouse cerebellum: Analysis by whole mount immunohistochemistry. Brain Res. 1222, 106-117 (2008).
  15. Marzban, H., Hawkes, R. On the architecture of the posterior zone of the cerebellum. Cerebellum. 10, 422-434 (2011).
  16. Pakan, J. M., Graham, D. J., Wylie, D. R. Organization of visual mossy fiber projections and zebrin expression in the pigeon vestibulocerebellum. J. Comp. Neurol. 518, 175-198 (2010).
  17. Iwaniuk, A. N., Marzban, H., Pakan, J. M., Watanabe, M., Hawkes, R., Wylie, D. R. Compartmentation of the cerebellar cortex of hummingbirds (Aves: Trochilidae) revealed by the expression of zebrin II and phospholipase C beta 4. J. Chem. Neuroanat. 37, 55-63 (2009).
  18. Sarna, J. R., Larouche, M., Marzban, H., Sillitoe, R. V., Rancourt, D. E., Hawkes, R. Patterned Purkinje cell degeneration in mouse models of Niemann-Pick type C disease. J. Comp. Neurol. 456, 279-291 (2003).
  19. Sarna, J. R., Hawkes, R. Patterned Purkinje cell loss in the ataxic sticky mouse. Eur. J. Neurosci. 34, 79-86 (2011).
  20. El-Bizri, N., Guignabert, C., Wang, L., Cheng, A., Stankunas, K., Chang, C. P., Mishina, Y., Rabinovitch, M. SM22alpha-targeted deletion of bone morphogenetic protein receptor 1A in mice impairs cardiac and vascular development, and influences organogenesis. Development. 135, 2981-2991 (2008).
  21. Mondrinos, M. J., Koutzaki, S., Lelkes, P. I., Finck, C. M. A tissue-engineered model of fetal distal lung tissue. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 293, 639-650 (2007).
  22. Coppola, E., Rallu, M., Richard, J., Dufour, S., Riethmacher, D., Guillemot, F., Goridis, C., Brunet, J. F. Epibranchial ganglia orchestrate the development of the cranial neurogenic crest. Proc. Nat. Acad. Sci. 107, 2066-2071 (2010).
  23. Kubilus, J. K., Linsenmayer, T. F. Developmental guidance of embryonic corneal innervation: roles of Semaphorin3A and Slit2. Dev. Biol. 344, 172-184 (2010).
  24. Reeber, S. L., Gebre, S. A., Sillitoe, R. V. Fluorescence mapping of afferent topography in three dimensions. Brain Struct. Funct. 216, 159-169 (2011).
  25. Davis, C. A. Whole-mount immunohistochemistry. Methods Enzymol. 225, 502-516 (1993).

Tags

Nörobilim Sayı 62 Gen ekspresyonu antikorlar kompartımanlara beyin topografya devre
Revealing Kompleksi Beyin Topografya Wholemount İmmünohistokimya
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

White, J. J., Reeber, S. L., Hawkes, … More

White, J. J., Reeber, S. L., Hawkes, R., Sillitoe, R. V. Wholemount Immunohistochemistry for Revealing Complex Brain Topography. J. Vis. Exp. (62), e4042, doi:10.3791/4042 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter