Summary
Neuronale Schaltkreise sind topographisch in Funktionsräume mit spezifischen molekularen Profile organisiert. Hier bieten wir Ihnen die praktischen und technischen Schritte zur Aufdeckung globale Gehirn Topographie mit einem vielseitigen wholemount immunhistochemische Färbung Ansatz. Wir demonstrieren den Nutzen der Methode mit dem wohlverstandenen Zytoarchitektur und Schaltung des Kleinhirns.
Abstract
Die wiederholte und gut verstanden zelluläre Architektur des Kleinhirns machen es ein ideales Modellsystem für die Erkundung des Gehirns Topographie. Underlying ihrer relativ einheitlichen Zytoarchitektur ist eine komplexe Anordnung von parasagittale Bereichen Gen-und Proteinexpression. Die molekulare Kompartimentierung des Kleinhirns wird durch die anatomische und funktionelle Organisation der afferenten Fasern gespiegelt. Um volles Verständnis für die Komplexität der Kleinhirn-Organisation, die wir zuvor eine wholemount Färbung Ansatz für die Hochdurchsatz-Analyse von Mustern Defekte im Kleinhirn der Maus verfeinert. Dieses Protokoll beschreibt im Detail die Reagenzien, Instrumente und praktische Schritte, die nützlich, um erfolgreich zu enthüllen Proteinexpressionsmuster in der adulten Maus Kleinhirn mit wholemount Immunfärbung sind. Die Schritte hier hervorgehoben zeigen die Nützlichkeit dieser Methode die Expression von zebrinII / aldolaseC als Beispiel, wie die feinen Topographie des Gehirns in seiner offenbarennativen dreidimensionalen Konformation. Ebenfalls beschrieben werden Anpassungen an das Protokoll, das für die Visualisierung der Proteinexpression in afferenten Vorsprünge und große Kleinhirn für vergleichende Untersuchungen der molekularen Topographie zu ermöglichen. Um diese Anwendungen zu veranschaulichen, werden Daten aus afferenten Färbung des Rattenkleinhirn enthalten.
Protocol
1. Tierische Perfusion und Kleinhirn Dissection
- Je nach Protein kann Perfusion für erfolgreiches Färbung 1,2. Transcardiac Perfusion ist eine invasive, nicht-Überleben Prozedur, die die ordnungsgemäße Verwendung der Anästhesie erfordert. Korrekte Ausbildung, institutionelle Zulassung und Genehmigung IACUC sind alle notwendig, bevor Sie den Vorgang. Es ist immer eine gute Idee, um der Institution Tierärzte wenden, um Hilfe bei der Identifizierung und den Erwerb von experimentellen Anforderungen die richtige Ausbildung zu erhalten. Vor dem Eingriff sollte das Tier sein tief narkotisiert und nicht als Reaktion auf Reize wie Fuß oder Schwanz kneifen. Mit einer Schere einen Schnitt in der Bauchhaut und Muskel Wand und dann weiter auf den Brustkorb, indem nur die neben dem Brustbein auf jeder Seite zu öffnen. Darüber hinaus kann der Experimentator einen größeren inneren Arbeitsraum durch Schneiden des Fascia um die Membran zu schaffen. Durch Anheben der Bauch-und Brustwand SuperIOrly, wird das Herz jetzt ausgesetzt sein. Machen Sie einen kleinen Schnitt in den rechten Vorhof, um Blut zu fließen und sofort einsetzen Perfusion Nadel in die linke Herzkammer zu ermöglichen. Eine grundlegende hydrostatischen Pumpe wird bevorzugt, um die Perfusion Lösungen zu liefern (siehe Tabelle 1 für weitere Details). Zuerst spülen das Blut aus mit 0,1 M Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS, siehe Tabelle 3), bis die Flüssigkeit klar ist. Dann schalten Sie den hydrostatischen Pumpe, schnell wechseln die Lösung Zuführungsschlauch in einem Behälter mit 4% Paraformaldehyd (PFA, siehe Tabelle 3) in PBS verdünnt und dann schalten Sie die Pumpe wieder ein, um das Fixativ zu liefern. Die Verwendung einer Pumpe ist nicht erforderlich und Praxis, zwei Spritzen mit der PBS gefüllt und 4% PFA kann verwendet werden, um den gewünschten Lösungen langsam werden.
- Es ist wichtig, genau zu sezieren das Gehirn aus dem Schädel ohne Vornahme einer Läsionen im Gewebe. Selbst kleine Risse an das Gehirn während der Präparation wird nach und nach in sichtbare Spalten erweitern, dassTrap-Antikörper und führen Artefakt Färbung während der Verarbeitung des Gewebes (zB rot Sternchen in Fig. 2). Für Kleinhirn-Dissektionen ist es typisch, um die Haut in der Mitte des Kopfes geschnitten und dann sanft zu necken die Klappen auseinander, um den Schädel freizulegen. Schneiden Sie den Schädel von vorne nach hinten entlang der dorsalen Mittellinie, und auch seitlich entlang beider Seiten des Schädels. Nicht nach dem Bregma schneiden, da dies die Gefahr von Nicking das Kleinhirn. Mit einer Pinzette vorsichtig heben Sie die Vorderseite des Schädels entfernt vom Gehirn man aufpassen, nicht losreißen Hirngewebe, die zu den Hirnhäuten angebracht ist. Sever die Hirnnerven auf der ventralen Seite des Gehirns.
- Trennung des Kleinhirns vom Rest des Gehirns ist aus zwei Gründen wichtig. Erstens erlaubt sie für die Erforschung der Expressionsmuster in den vorderen Läppchen, die aus der Sicht von der Colliculi in situ verborgen sind. Das zweite ist, dass die Trennung des Gewebes in kleineren, abgelegenen Regionen ermöglicht mErz vollständige Fixierung, die die Färbung von einigen Proteinen erleichtern können. In diesem letzten Schritt Dissektion, sollte darauf geachtet werden, nicht berühren das Kleinhirn mit den Spitzen der Pinzette werden. Legen Sie die Spitzen einer Pinzette in die Mitte der oberen und unteren Colliculi. Mit einem zweiten Satz von Pinzetten entfernt langsam necken den unteren Colliculus aus dem Kleinhirn. Dann lag das Kleinhirn, so dass seine vordere Seite nach unten zeigt und der Hirnstamm nach oben zeigt. Legen Sie die Zange in den vierten Ventrikel zwischen dem Hirnstamm und Lobuli IX / X des Kleinhirns. Schneiden Sie die Stiele durch Quetschen mit der Zange auf beiden Seiten und dann sanft heben das Kleinhirn vom Hirnstamm. Sobald das Kleinhirn isoliert, Posten-fixieren durch Eintauchen in 4% PFA bei 4 ° C für ein Minimum von 24-48 Stunden. Das Kleinhirn kann in 4% PFA für einen längeren Zeitraum gelagert werden. Die Meningen entweder vor oder nach dem Färben, zur besseren Sichtbarkeit der Expressionsmuster entfernt werden.Wenn der Experimentator dafür entscheidet, die Hirnhaut zu entfernen, bevor Färbung gibt es eine starke Möglichkeit, dass das Kleinhirn während des Prozesses wird eingekerbt werden. Abziehen der Meningen am Ende der Färbung ist viel einfacher, weil sie einfacher zu finden, nachdem sie schwache Hintergrundfärbung zu erwerben und gebrechlich geworden Post-Processing.
2. Die Verarbeitung des Tissue für Wholemount Färbung
Da die Färbung wholemount Ansatz dauert länger als immunhistochemische Färbung von Gewebeschnitten, ist es hilfreich, um die Zeitleiste für jedes der Experimente zu planen, wie im Beispiel Kalender zur Verfügung gestellt (Tabelle 2) gezeigt. Bevor Sie beginnen, gibt es mehrere wichtige Dinge im Auge zu behalten. 1) Die Mikroröhrchen, die das Gewebe sollte gedreht auf einem Kolbenpendel jederzeit, außer während der Frost / Tau-Prozess. 2) Mehrere Lösungen müssen frisch zubereitet für jedes Experiment werden (Siehe Tabelle 3 für die Lösung Rezepte). 3)Im gesamten Protokoll werden beim Wechsel Lösungen, vorsichtig gießen Sie das verbrauchte Lösung und nicht das Entfernen des Kleinhirns mit der Pinzette, um Berührungen des Kleinhirns. Dann, nach dem Mischen der neuen Lösung in einem anderen Behälter, mit einer Pipette vorsichtig fügen Sie die frische Lösung in das Röhrchen.
2,1 Tag 1:
- Befestigen Sie das Kleinhirn in Dents fix 3 bei Raumtemperatur für 6-8 Stunden schaukeln sanft auf den Kolbenpendel. Wenn Methanol ist destruktiv zu Ihrem Antigen möchten, sollten Sie die Schritte durch 2.1a 2.3a mit einem Antigen-Retrieval-Methode. Die Hitze und Puffer für die Antigen-Retrieval verwendet wird zur Vorbereitung des Gewebes für die Antikörper-Penetration.
- Bleach das Kleinhirn in Dents Bleach 3 über Nacht bei 4 ° C.
2,2 Tag 2:
- Entwässern das Kleinhirn in zwei Runden von 100% MeOH bei Raumtemperatur für jeweils 30 min.
- Dann, um die Penetration der Lösungen, Sachgebietdas Gewebe zu einer Reihe von Einfrieren / Auftauen. Legen Sie das Rohr in einem Container mit Trockeneis und einfrieren für 30 min. Dann entfernen Sie den Schlauch und lassen Sie sie bei Raumtemperatur auf dem Arbeitstisch für 15 Minuten. Der Frost / Tau-Schritt sollten vier Mal (mindestens) durchgeführt werden.
- Nach dem letzten Auftauen des Gewebes, das Reagenzglas in eine -80 ° C Gefrierschrank über Nacht.
- Das Gewebe kann für längere Zeit bei -80 ° C gelagert werden entweder unmittelbar vor oder nach der Gefrier / Tau-Schritte. Ansonsten sollte das Protokoll fortgesetzt werden.
2,3 Tag 3:
- Rehydrieren das Kleinhirn durch Waschen in 50% MeOH/50% PBS, 15% MeOH/85% PBS und 100% PBS für jeweils 60-90 Minuten bei Raumtemperatur.
- Als nächstes wird für adulten Maus Kleinhirn, Sachgebiet das Gewebe enzymatische Verdauung mit Proteinase K 10μg/ml in PBS für 2-3 Minuten. Keine Verdauung Schritt ist notwendig für Kleinhirn junger Tiere (P5 oder jünger in der Maus). Längere digestion ist für größere Gehirne vorgeschlagen. Zum Beispiel könnte die Verdauung so hoch wie für 5-6 Minuten Primatengehirnen 4.
- Nach der Verdauung sofort abwaschen das Kleinhirn in PBS dreimal für jeweils 10 Minuten bei Raumtemperatur, um die Proteinase K zu entfernen
- Blockieren Sie das Gewebe in PMT (siehe Tabelle 3) über Nacht bei 4 ° C. Milchpulver ist oft die erste Wahl bei der Auswahl eines Blockierungsmittels für Protein-Arbeit, weil es billig ist, effektiv senkt Hintergrundfärbung, und führt üblicherweise nicht mit Antikörper-Bindung oder den Zugang zum Antigen stören. Tierseren können auch verwendet werden, obwohl der Experimentator sollte sich bewusst sein, der die zusätzlichen Kosten und muss zuerst der Serum-Qualität für kreuzreaktiv Immunglobuline und die Fähigkeit, ein optimales Signal-Rausch-Verhältnis zu erzeugen.
2,4 Tag 4-5:
- Inkubieren des Gewebes in Primärantikörper in PMT verdünnt mit 5% DMSO für 48 Stunden ergänzt bei 4 ° C (largER cerebella setzt eine verstärkte Inkubationszeiten).
2,5 Tag 6:
- Waschen des Kleinhirns 2-3 mal für 2-3 Stunden in PMT bei 4 ° C, um ungebundenes primären Antikörper zu entfernen.
- Dann bebrüten das Gewebe in Sekundärantikörper in einer Lösung mit PMT mit 5% DMSO bei 4 ° C über Nacht (größere Kleinhirn kann verlangen, erhöht Inkubationszeiten).
2,6 Tag 7:
- Waschen Sie das Kleinhirn 2-3 mal für 2-3 Stunden in PMT bei 4 ° C
- Geben Sie dem Gewebe eine letzte Waschung mit PBT (siehe Tabelle 3) für 1-2 Stunden. Dieser Schritt entfernt überschüssige Milch und verbessert die Klarheit der Färbung.
- Schließlich Inkubation des Gewebes in DAB (3,3 '-Diaminobenzidin)-Lösung, bis die optimale Färbeintensität erreicht ist. Das braune Reaktionsprodukt muss deutlich sichtbar sein innerhalb von ~ 10 Minuten. Am besten ist es DAB in der Dunkelheit nutzen als Licht bewirkt, dass das Chromogen in Niederte, die Hintergrundfärbung erhöhen können.
2,7
Wenn die optimale Färbeintensität erreicht ist, wird die Reaktion gestoppt, indem das Kleinhirn in PBS mit 0,04% Natriumazid. Das Gewebe kann langfristig aufbewahrt werden in dieser Lösung. Natriumazid ist ein potenter Inhibitor von Bakterienwachstum sondern bis zu diesem Schritt vermieden werden, da es hemmt auch Meerrettichperoxidase.
2,8 Optional Amplifikationsprozeß:
folgen normale Protokoll aber diese Schritte sollten anstelle der Schritte 2.5b-2.7 oben durchgeführt werden.
- Inkubieren Sie das Gewebe über Nacht bei 4 ° C in Biotin-konjugierten sekundären Antikörpern in PBST (siehe Tabelle 3) mit 5% DMSO.
- Spülen des Gewebes für 2-3 Stunden jeweils in 3-4 Veränderungen PBST bei Raumtemperatur.
- Inkubieren Sie das Kleinhirn über Nacht bei 4 ° C in ABC-Komplex-Lösung in PBST.
- Spülen Sie das Gewebe für 2-3 Stunden jeweils beiRaumtemperatur in 3-4 Wechseln von PBS.
- Inkubieren des Gewebes in frisch zubereitete DAB-Lösung, wie oben beschrieben.
- Wenn die Färbung optimal ist, stoppen Sie die Reaktion durch Waschen des Kleinhirns in PBS mit 0,04% Natriumazid.
3. Imaging der gefärbten Gewebeschnitten
- Wholemount Bilder unter Verwendung zum Beispiel erfasst werden kann, montiert ein Leica DFC3000 FX Kamera auf einem Stereomikroskop Leica MZ16 FA laufen Leica Application Suite Software FX. Falls gewünscht, kann Dekonvolutionsmikroskopie verwendet werden, um mehrere aufeinander folgende Bilder in verschiedenen Fokalebenen zu erhalten, wobei jedes Bild mit nur einem einzigen Lobulus exakten Fokus werden. Dann können die Bilder in einem einzigen Stapel-und Software gerendert, um Verzerrungen zu beseitigen komprimiert werden. Die endgültige zusammengesetzte Bild wird Kleinhirnoberfläche Expressionsmuster mit allen sichtbaren Mustern in klaren Fokus zu illustrieren.
- Wholemount gefärbten Gewebeschnitten sollten abgebildet, während in PBS getaucht werden (oder ein anderes Medium, das ein geben wirdoptimalen Brechungsindex). Um eine leichte Positionierung der wholemount zum Abbilden, eine 1% Agar-Gel in einer Kunststoff-Petrischale. Schneiden Sie kleine Löcher in das Gel. Die Löcher ermöglichen das Kleinhirn in der gewünschten Orientierung geklemmt werden.
- Rohdaten werden in Adobe Photoshop CS4 importiert und bereinigt um die Kontrast-und Helligkeitswerte.
Tiere
Alle Tierversuche wurden im Rahmen einer genehmigten IACUC Tier-Protokoll nach den Richtlinien des Instituts am Albert Einstein College of Medicine durchgeführt. Männliche und weibliche outbred Swiss Webster (Taconic, Albany, NY) wurden die Mäuse in unserer Kolonie Wartung und bei allen Studien. Eingeschläfert erwachsenen Ratten wurden freundlicherweise von Dr. Bryen Jordan (Albert Einstein College of Medicine) zur Verfügung gestellt. Alle Tiere waren mindestens einen Monat alt.
4. Repräsentative Ergebnisse
Das Kleinhirn wird durch molekulare Ausdruck in vier Zonen quer abgeteilt:der vordere Zone (AZ: ~ Lobuli IV), die zentrale Zone (CZ: ~ Lobuli VI-VII), die hintere Zone (PZ: ~ Lobuli VIII-IX dorsal) und die knotige Zone (NZ: ~ Lobuli IX und X ventralen ) 5. Jede Zone enthält eine einzigartige Auswahl an parasagittale Streifen 1,2,5,6 (Abb. 1). ZebrinII Expression in Purkinje-Zellen zeigt, Streifen in der AZ und PZ (Abb. 2) und einheitlichen Ausdruck in der CZ und NZ (Abb. 2). Die parasagittale Organisation der Purkinje-Zellen wird durch die Terminal-Bereich Topographie der afferenten Fasern gespiegelt. Kokain-und Amphetamin-regulierte Transkript (CART)-Peptid wird in Teilmengen von Klettern Fasern (Abb. 3a) zum Ausdruck gebracht, dass Projekt zu Streifen von Purkinje-Dendriten in der Molekularschicht der Kleinhirnrinde 7 (Abb. 3b). Mit den entsprechenden Änderungen, wie zum Beispiel Verstärkung 7, kann der wholemount Protokoll für die Visualisierung von olivocerebellar Muster ohne need für eine mühsame, zeitraubende Rekonstruktionen aus Gewebeschnitten Färbung (Abb. 3b).
Abbildung 1. A. ZebrinII / aldolaseC Ausdruck zeigt sagittale Bänder im Querschnitt des Kleinhirns. Maßstab = 500 um. B. ZebrinII / aldolaseC wird ausschließlich in Purkinjezelle Somata und Dendriten zum Ausdruck gebracht. Maßstab = 150 um (gl = Körnerschicht; PCL = Purkinje-Zellschicht; ml = molekulare Schicht).
Abbildung 2. Ein wholemount Kleinhirn für ZebrinII / aldolaseC zeigt Purkinjezelle Streifen in Bilder des vorderen (AZ), zentrale (CZ) und posterioren (PZ) Zonen des Kleinhirns gefärbt. Hier zeigen wir ein Beispiel der negative Folge Nicking das Kleinhirn. Das erhaltene Artefakt Färbung angegebenmit roten Sternchen. Maßstab = 1 mm (LS = Lobulus simplex; PML = paramedian Lobulus; COP = Kopula pyramidis).
Abbildung 3. A. CART wird im Klettern Faser-Terminals in der molekularen Schicht ausgedrückt. Maßstab = 100 um. (Ml = molekulare Schicht; PCL = Purkinje-Zellschicht; gl = Körnerschicht) B. Wholemount Immunhistochemie von CART-Expression in der NZ. Maßstab = 2 mm (COP = Kopula pyramidis; PML = paramedian Lobulus; PFL = paraflocculus, FL = Flocculus).
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Discussion
Wir haben die technischen Details für eine erfolgreiche wholemount Färbung mit einem vielseitigen Ansatz für immunhistochemische aufschlussreich Protein-Expression im sich entwickelnden und adulten Gehirn benötigt beschrieben. Durch diesen Ansatz lassen sich komplexe molekulare Expressionsmuster analysiert und Gehirn Topographie, ohne dass umständlich und zeitaufwendig Gewebe Schnitte Verfahren geschätzt.
Dieses Protokoll wurde verwendet, um die gemusterte Expression verschiedener Proteine Purkinje-Zelle sowohl in der erwachsenen 1,2,8,9 und frühen postnatalen Maus-Cerebellum 10,11,12 offenbaren. Das klassische Studien zeigten auch die Nützlichkeit des wholemount Ansatz für die Prüfung Körnerzellen Antigenexpression 1 und anterograd zurückgeführt Moosfasern 2, die ~ 250 um unter der Pia-Oberfläche im Körnerschicht befinden. Darüber hinaus haben mehrere Studien Änderungen an dem ursprünglichen Protokoll für eine erfolgreiche Färbung von Proteinen gemacht in Purkinjezellen 1,13 (Antigen-Retrieval) und afferenten Fasern 7,14 (Signalverstärkung; Abb. 2.). Darüber hinaus hat wholemount immunhistochemische Färbung auch auf die Kleinhirn der an mehreren Säugern und Vögeln 4,15 16,17 Arten verwendet werden, um Karte gemusterten Purkinjezelle Verlust in Mausmodellen neurodegenerativer Erkrankungen 18,19 angewandt worden, und modifiziert, um Herz 20, Lungen-Fleck 21, 22 und Hirnnerven Hornhautnerven 23. Die wesentliche Abweichung des aktuellen Protokolls der letzten Zeit Beschreibungen der Verfahren wholemount 1,2 ist, dass wir hier nicht nur aktualisierte Details für mehr Erfolg bei der Verwendung des Verfahrens, sondern auch eine komplette Anleitung zum Fixieren des Gewebes liefern, Sezieren des Gewebes und eine in Tiefe Video-Darstellung der Technik.
Es gibt mehrere Einschränkungen von wholemount Färbung. Erstens sind nur typische Oberflächenstrukturentisch visualisiert ohne weitere Zerlegung und Färbung oder ohne die Länge der Zeit, dass das Gewebe Antikörper inkubiert wird. Darüber hinaus wird Färbung nicht erreichen tief in der Hirnrinde, wenn es aufgrund Schieferung 1,2 verborgen ist. Jedoch kann wholemount gefärbten Gewebes nach der Verarbeitung geschnitten und umgefärbt, mit dem gleichen Antikörper oder einem anderen, um zelluläre Expressionsprofile tieferen offenbaren innerhalb des Gewebes 1,2. Zweitens ist die grundlegende wholemount Färbeprotokoll lang. Wir schlagen vor, dass jeder Experimentator empirisch bestimmen die Effizienz ihrer Färbung Antikörper und verkürzen die Zeit nach der Fixierung, verkürzen die Anzahl und Länge der Wäschen und / oder einer Verkürzung der Länge der Inkubation in den primären Antikörpern. Mit diesen Anpassungen kann das Protokoll in wesentlich kürzerer Zeit abgeschlossen sein. Drittens, die für große Kleinhirn wholemount Färbung Protokoll erfordert umfangreiche Mengen von Antikörper-Lösungen, was teuer und / oder nur in begrenzten Quantkeiten. Es ist jedoch möglich, die primären Antikörper nach jedem Durchlauf zu sparen, indem das Einfrieren der Lösung bei -20 ° C Jeder Experimentator müssen, um festzustellen, ob ihre Antikörper kann gefrierfestes, bevor es wieder verwendet werden. Wir haben erfolgreich Gewebe gefärbt unter Verwendung zuvor eingefrorenen Aliquots zebrinII. Viertens sind nicht alle Antikörper mit dem bei der wholemount Ansatz. Zum Beispiel erfordert der Antikörper häufig verwendet, um die gestreifte Expression des kleinen Hitzeschockprotein, HSP25 erkennen, dass das Gewebe zunächst für Antigen-Retrieval 13 verarbeitet werden. Egal, wie zum Färben von Gewebeschnitten, haben die traditionellen Methoden der Fehlersuche Antikörper-Antigen-Bindung auch als nützlich erwiesen für die Optimierung wholemount Färbung.
Wir prüfen derzeit die Möglichkeit einer Anpassung unserer wholemount Protokoll für die Verwendung mit Fluoreszenz-markierten Sekundärantikörper. Mit der geeigneten Mikroskops mit der Fähigkeit, Bilder in verschiedenen Farben ausgestattet fluorophores unter low-power, würde man in der Lage, nicht nur analysieren die Organisation mehrerer Purkinjezelle Karten in der gleichen Tier, aber auch auf die Beziehung zwischen Purkinjezelle Streifenmuster und die Topographie der WGA-Alexa beschriftet afferenten Fasern in drei Dimensionen 2,4.7,24. Zudem hat die kürzliche Verfügbarkeit von großen Datenbanken Genexpression (Allen Brain Atlas, GenePaint, Brain Gene Expression Map) haben neue Wege für die Verschmelzung unserer hohen Durchsatz wholemount Ansatz mit ganzen Genom-Analysen zur Untersuchung der molekularen Topographie des gesamten Gehirns eröffnet.
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Disclosures
Wir haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
RVS wird durch neue Ermittler Anschubfinanzierung von Albert Einstein College of Medicine der Yeshiva University unterstützt.
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