Wholemount Immunhistokemi for at afsløre Complex Brain Topografi

Summary

Neurale kredsløb topografisk organiseret i funktionelle rum med specifikke molekylære profiler. Her giver vi de praktiske og tekniske skridt til at afsløre den globale hjerne topografi med et alsidigt wholemount immunhistokemisk farvning tilgang. Vi demonstrerer anvendeligheden af ​​metoden under anvendelse af velforståede cytoarchitecture og kredsløb cerebellum.

Abstract

Den gentagne og godt forstået cellulære arkitektur af lillehjernen gør det til en ideel model for at udforske hjernen topografi. Underliggende dets relativt ensartet cytoarchitecture er en kompleks række af parasagittal domæner genet og proteinekspression. Den molekylære opdeling af lillehjernen er afspejlet i den anatomiske og funktionelle organisering af afferente fibre. For fuldt ud at forstå kompleksiteten af ​​cerebellare organisation, vi tidligere har forfinet en wholemount farvning tilgang til high throughput analyse af mønstergivende fejl i musen lillehjernen. Denne protokol beskriver i detaljer de reagenser, værktøjer og praktiske skridt, som er nyttige at kunne afsløre protein ekspressionsmønstre i den voksne mus lillehjernen ved hjælp wholemount immunfarvning. Trinene fremhævet her demonstrere anvendeligheden af ​​denne metode at bruge udtryk zebrinII / aldolaseC som et eksempel på, hvordan den fine topografi i hjernen, kan blive afsløret i sinnative tredimensionelle konformation. Også beskrevet er tilpasninger til den protokol, der giver mulighed for visualisering af protein udtryk i afferente fremskrivninger og store cerebella for sammenlignende studier af molekylære topografi. For at illustrere disse ansøgninger, er data fra afferent farvning af rottecerebellum inkluderet.

Protocol

1. Dyr Perfusion og cerebellum Dissection

1. Afhængigt af proteinet, kan perfusion være afgørende for vellykket farvning ^1,2. Transcardial perfusion er en invasiv, non-overlevelse procedure, der kræver den korrekte brug af anæstetika. Korrekt uddannelse, institutionel godkendelse, og IACUC godkendelse er alle nødvendige, før du forsøger proceduren. Det er altid en god idé at konsultere institutionens dyrlæger for at få hjælp til at identificere eksperimentelle krav og erhverve den rigtige uddannelse. Før proceduren bør dyret være dybt bedøvet, og ikke reagerer på stimuli, såsom mund-eller hale knibe. Brug af saks lave et snit i den abdominale hud og muskel væggen og derefter fortsætte med at åbne brystkassen ved at skære bare tæt på sternum på hver side. Derudover kan eksperimentatoren skabe et større indre arbejdsrum ved at skære fascia omgiver membranen. Ved at løfte den abdominale og thorax væggen Superiorly vil hjertet nu blive udsat for. Lave et lille snit i højre atrium for at tillade blod at strømme ud og umiddelbart indsætte perfusionen nålen ind i den venstre ventrikel. En grundlæggende hydrostatisk pumpe foretrækkes at levere de perfusionsopløsninger (se tabel 1 for detaljer). Først skylles blodet ud med 0,1 M phosphatpufret saltopløsning (PBS, se tabel 3), indtil væsken er klart. Derefter skal du slukke den hydrostatiske pumpe, hurtigt skifte løsningen tilførselsrøret til en beholder med 4% paraformaldehyd (PFA, se tabel 3) fortyndes i PBS, og tænd pumpen igen at levere fiksativ. Anvendelse af en pumpe er ikke nødvendigt: i praksis fyldes to sprøjter med PBS og 4% PFA kan anvendes til langsomt levere de løsninger.
2. Det er vigtigt omhyggeligt at dissekere hjernen ud af skallen uden at indføre nogen læsioner i vævet. Selv små rifter til hjernen under dissektion vil gradvist udvide til synlige revner, atfælde antistoffer og forårsage kunstig farvning under behandlingen af vævet (fx rød Stjernerne i figur 2). For cerebellare dissektioner, er det typisk at skære huden ned i midten af ​​hovedet og derefter forsigtigt drille flapperne fra hinanden for at blotlægge kraniet. Skåret kraniet fra anterior til posterior langs den dorsale midtlinie, og også lateralt langs begge sider af hovedskallen. Der må ikke skæres ud i bregma, da dette risikerer at huldannelse lillehjernen. Brug pincet forsigtigt løfte den forreste del af kraniet væk fra hjernen være omhyggelig med ikke at rive væk hjernevæv, der er knyttet til meninges. Adskille de kraniale nerver på den ventrale side af hjernen.
3. Adskillelse af cerebellum fra resten af ​​hjernen er vigtig af to grunde. For det første giver mulighed for udforskning af ekspressionsmønstre i forreste lobules, der er skjult af den colliculi in situ. Den anden er at adskille væv i mindre og isolerede områder tillader mmalm fuldstændig fiksering, hvilket kan lette farvning af visse proteiner. I denne sidste dissektion skridt, bør der udvises forsigtighed for ikke at røre ved lillehjernen med spidsen af ​​tangen. Sæt spidsen af ​​en tang ind i midten af ​​de overlegne og underlegne colliculi. Med et andet sæt af tang langsomt drille væk ringere colliculi fra lillehjernen. Derefter lå lillehjernen, således at dens forreste vender nedad, og hjernestammen peger opad. Indsætte pincet i den fjerde ventrikel mellem hjernestammen og lobuli IX / X i cerebellum. Skær stilke ved at knibe med pincetten på begge sider og derefter forsigtigt løfte lillehjernen væk fra hjernestammen. Når cerebellum isoleres, post-fastgør den ved nedsænkning i 4% PFA ved 4 ° C i mindst 24-48 timer. Cerebellum kan lagres i 4% PFA i en længere tidsperiode. Meninges skal fjernes enten før eller efter farvning for bedre synlighed af ekspressionsmønstre.Hvis eksperimentatoren vælger at fjerne meninges før farvning er der stor sandsynlighed at cerebellum skal spaltes under processen. Aftrækning af meninges ved afslutningen af ​​farvningsproceduren er meget enklere, fordi de bliver lettere at finde, når de får svage baggrundsfarvning og bliver skrøbelig efterbehandling.

2. Behandling af væv til Wholemount farvning

Fordi wholemount farvning fremgangsmåde tager længere tid end immunohistokemisk farvning af vævssektioner, er det nyttigt at planlægge tidslinjen for hvert af forsøgene, som vist i eksempel kalenderen tilvejebragt (tabel 2). Før du starter, er der flere vigtige ting at huske på. 1) mikrorør indeholdende vævet skal roteres om en nutator på alle tidspunkter, med undtagelse under fryse / tø-processen. 2) Flere løsninger skal foretages frisk for hvert forsøg (se tabel 3 til løsning opskrifter). 3)I hele protokollen, når der skiftes løsninger forsigtigt hælde ud brugte løsning i stedet for at fjerne lillehjernen med pincet, for at undgå at berøre lillehjernen. Derefter, efter blanding af den nye opløsning i en anden beholder, anvende en pipette til forsigtigt tilsættes den friske opløsning til røret.

2,1 Dag 1:

1. Fastgør lillehjernen i Dent har fix ³ ved stuetemperatur i 6-8 timer vuggede blidt på nutator. Hvis methanol er ødelæggende for din antigen, overveje at udskifte trin 2.1a gennem 2.3a med et antigen metoden til at hente. Den varme og buffere anvendt til antigen hentning vil hjælpe med at forberede vævet for antistof penetration.
2. Bleach lillehjernen i Dent har Bleach ³ natten over ved 4 ° C.

2,2 Dag 2:

1. Dehydrere den cerebellum i to omgange 100% MeOH ved stuetemperatur i 30 minutter hver.
2. Derefter, til forøgelse af penetrationen af ​​opløsningerne, forudsatvævet til en serie af fryse / optøningscykler. Læg forsigtigt røret i en beholder med tøris og frys i 30 minutter. Fjern derefter røret og lade det blive ved stuetemperatur på bænken i 15 minutter. Den fryse / tø skridt bør udføres fire gange (mindst).
3. Efter den sidste optøning af vævet ved at anbringe røret i en -80 ° C fryser natten over.
4. Vævet kan opbevares i længere tidsrum ved -80 ° C, enten umiddelbart før eller efter fryse / tø trin. Ellers skal protokollen skal fortsættes.

2,3 Dag 3:

1. Rehydrere cerebellum ved at vaske det i 50% MeOH/50% PBS, 15% MeOH/85% PBS, og 100% PBS i 60-90 minutter ved stuetemperatur.
2. Dernæst til voksne mus cerebella forbehold vævet enzymatisk fordøjelse med 10μg/ml proteinase K i PBS i 2-3 minutter. Ingen fordøjelsen skridt er nødvendigt for cerebella af unge dyr (P5 eller yngre i mus). Længere digestion er foreslået for større hjerner. For eksempel kan spaltning være så høj som 5-6 minutter for primat hjerner ^4.
3. Efter fordøjelse vaskes straks cerebellum i PBS tre gange i 10 minutter ved stuetemperatur for at fjerne Proteinase K.
4. Blokere væv i PMT (se tabel 3) natten over ved 4 ° C. Mælkepulver er ofte det første valg, når der vælges et blokeringsmiddel for protein arbejde, fordi det er billigt, effektivt sænker baggrundsfarvning og typisk ikke interferere med antistofbinding eller adgang til antigenet. Dyr sera kan også anvendes, skønt eksperimentatoren skal være opmærksom på de yderligere omkostninger og skal først teste serum kvalitet krydsreaktive immunoglobuliner og evne til at frembringe en optimal signal-støj-forholdet.

2,4 Dag 4-5:

1. Inkubér væv i primære antistoffer fortyndet i PMT suppleret med 5% DMSO i 48 timer ved 4 ° C (largis cerebella vil kræve øgede inkubationstider).

2,5 Dag 6:

1. Vaskes cerebellum 2-3 gange i 2-3 timer hver i PMT ved 4 ° C for at fjerne ubundne primære antistoffer.
2. Derefter inkuberes vævet i sekundære antistoffer i en opløsning indeholdende PMT med 5% DMSO ved 4 ° C natten over (større cerebella kan kræve øget inkubationstider).

2,6 Dag 7:

1. Vaskes cerebellum 2-3 gange i 2-3 timer hver i PMT ved 4 ° C.
2. Giv vævet en endelig vask med PBT (se tabel 3) i 1-2 timer. Dette trin fjerner overskydende mælk og øger klarheden i farvningen.
3. Endelig inkuberes vævet i DAB (3,3 '-diaminobenzidin)-opløsning, indtil den optimale farvningsintensitet er nået. Den brune reaktionsprodukt skal være tydeligt synlige i ~ 10 minutter. Det er bedst at bruge DAB i mørke som lys får kromogen til nedbørte, der kan forøge baggrundsfarvning.

2,7

Når den optimale farvningsintensitet er nået, standses reaktionen ved at placere cerebellum i PBS med 0,04% natriumazid. Vævet kan opbevares længere sigt i denne opløsning. Natriumazid er en potent inhibitor af bakterievækst, men bør undgås, indtil dette trin, da det også inhiberer peberrodsperoxidase.

2,8 Valgfrit amplifikation procedure:

følge normal protokol, men disse trin skal udføres i stedet for trin 2.5b-2.7 ovenfor.

1. Inkuber vævet natten over ved 4 ° C i biotin-konjugerede sekundære antistoffer i PBST (se tabel 3) med 5% DMSO.
2. Skyl vævet i 2-3 timer hver 3-4 ændringer i PBST ved stuetemperatur.
3. Inkuber cerebellum natten over ved 4 ° C i ABC kompleks opløsning i PBST.
4. Skyl vævet i 2-3 timer hver vedstuetemperatur i 3-4 ændringer af PBS.
5. Inkubér væv friskfremstillet DAB-opløsning, som beskrevet ovenfor.
6. Når farvningen er optimal, standse reaktionen ved vask af cerebellum i PBS med 0,04% natriumazid.

3. Billeddannelse af farvede væv

1. Wholemount billeder kan indfanges ved hjælp af for eksempel en Leica DFC3000 FX kamera er monteret på en Leica MZ16 FA stereomikroskop kører Leica Application Suite FX software. Hvis det ønskes, kan dekonvolution mikroskopi anvendes til at opnå flere på hinanden følgende billeder i forskellige fokusplaner, med hvert billede har kun en enkelt lille lap i skarp fokusering. Derefter kan billederne skal komprimeres til en enkelt stak, og softwaren gjort for at fjerne forvrængning. Den endelige sammensat billede vil illustrere cerebellare overfladekoncentration mønstre med alt synligt mønster i klart fokus.
2. Wholemount farvede væv bør afbildes under nedsænket i PBS (eller et andet medium, der vil give enoptimal brydningsindeks). For let at positionere wholemount til billeddannelse, at en 1% agar-gel i en plast Petri-skål. Skær små huller i gelen. Hullerne vil tillade cerebellum at blive kilet ind i den ønskede orientering.
3. Rådata er indført i Adobe Photoshop CS4 og korrigeret for kontrast og lysstyrke niveauer.

Dyr

Alle dyr blev udført i henhold til en godkendt IACUC dyr protokol i henhold til de institutionelle retningslinjer på Albert Einstein College of Medicine. Mandlige og kvindelige udavl Schweiziske Webster (Taconic, Albany, NY) mus blev holdt i vores koloni og anvendt til alle undersøgelser. Eutaniseret voksne rotter blev venligst tilvejebragt af Dr. Bryen Jordan (Albert Einstein College of Medicine). Alle dyr var mindst en måned gamle.

4. Repræsentative resultater

Cerebellum er sektionsopdelt ved molekylær ekspression i fire tværgående zoner:den forreste zone (AZ: ~ lobuli IV), den centrale zone (CZ: ~ lobuli VI-VII), den posteriore zone (PZ: ~ lobuli VIII-dorsale IX) og nodulær zone (NZ: ~ lobuli IX ventrale og X ) 5. Hver zone indeholder en unik række parasagittal striber ^1,2,5,6 (fig. 1). ZebrinII ekspression i Purkinje-celler afslører striber i AZ og PZ (fig. 2) og ensartet ekspression i CZ og NZ (fig. 2). Den parasagittal organisation Purkinjeceller afspejles af terminalen området topografi afferente fibre. Kokain-og amfetamin-reguleret transkript (CART) peptidet udtrykkes i delmængder af klatring fibre (fig. 3a), der projekt til striber af Purkinje celle dendritter i den molekylære lag af cerebellum cortex ⁷ (fig. 3b). Med passende modifikationer, såsom amplifikation ^7, tillader wholemount protokol for visualisering af olivocerebellar mønstre uden Need for en besværlig, tidskrævende rekonstruktioner fra farvning af vævssnit (fig. 3b).

Figur 1. A. ZebrinII / aldolaseC ekspression viser sagittale bånd i tværsnit af cerebellum. Målestokken = 500 um. B. ZebrinII / aldolaseC udtrykkes udelukkende i Purkinje celle somata og dendritter. Målestok = 150 um (gl = granulære lag; PCL = Purkinje cellelag; ml = molekylær lag).

Figur 2. En wholemount lillehjernen farves for ZebrinII / aldolaseC viser Purkinje celle striber i billeder af den forreste (AZ), central (CZ), og bageste (PZ) zoner i lillehjernen. Her viser også et eksempel på negativ konsekvens af huldannelse cerebellum. Den resulterende kunstig farvning er angivetmed røde asterisker. Skala bar = 1 mm (LS = lobulus simplex, PML = paramedian lille lap; COP = copula pyramidis).

Figur 3. A. CART udtrykkes i klatring fiber terminaler i den molekylære lag. Skala bar = 100 um. (Ml = molekylær lag; PCL = Purkinje cellelag; gl = granulære lag) B. Wholemount immunhistokemi af CART udtryk i NZ. Målestok = 2 mm (COP = copula pyramidis; PML = paramedian lille lap; PFL = paraflocculus; FL = flocculus).

Discussion

Vi har beskrevet de tekniske detaljer, der er nødvendige for en vellykket wholemount farvning ved hjælp af en alsidig immunhistokemisk tilgang til afslørende protein-ekspression i udviklende og voksne hjerne. Ved hjælp af denne fremgangsmåde, kan komplekse molekylære ekspressionsmønstre skal analyseres, og hjernen topografi værdsat uden behov for besværlige og tidskrævende væv koblinger procedurer.

Denne protokol er blevet anvendt til at afsløre den mønstrede ekspressionen af adskillige Purkinje celleproteiner i både voksne ^1,2,8,9-og tidlige postnatale mus cerebellum ^10,11,12. Vores oprindelige undersøgelser viste også anvendeligheden af wholemount tilgang til at undersøge granula celle antigen ekspression ¹ og anterogradely spores mosagtige fibre ^2, som bor ~ 250 um under pial overflade i granulære lag. Desuden har adskillige undersøgelser foretaget ændringer i den oprindelige protokol for vellykket farvning af proteiner in Purkinjeceller ^1,13 (antigen genfinding) og afferente fibre ^7,14 (signalforstærkning, fig 2).. Desuden har wholemount immunohistokemisk farvning også blevet anvendt til cerebella af flere pattedyr ^4,15 og aviære ^16,17 arter, der anvendes til kort mønstrede Purkinje celletab i musemodeller af neurodegenerative sygdomme ^18,19, og modificeret til farvning hjerte ^20, lunge ^21, kraniale nerver ²² og hornhinden nerver ^23. Den store afgang af den nuværende protokol fra tidligere beskrivelser af wholemount metode ^1,2 er, at vi her giver ikke kun opdaterede oplysninger for bedre succes ved brug af proceduren, men også en komplet guide til fiksering af væv, dissekere den væv og en dybde video illustration af teknikken.

Der er adskillige begrænsninger wholemount farvning. Første overfladebehandlede mønstre er typisktisk visualiseret uden yderligere dissektion og farvning eller uden at øge den tid, at vævet inkuberes i antistoffer. Endvidere vil farvning ikke nå dybt inde i cortex, hvis det er skjult på grund løvspring ^1,2. Imidlertid kan wholemount farvede væv være snit efter forarbejdning og restained med det samme antistof eller en anden, for at afsløre cellulære ekspressionssystemer profiler dybere i vævet ^1,2. Andet grundlæggende wholemount farvningsprotokol er lang. Vi foreslår, at hver eksperimentator empirisk bestemme farvning effektiviteten af ​​deres antistoffer og afkorte den post-fiksering tid afkorte antallet og længden af ​​vask og / eller afkorte længden af ​​inkubation i de primære antistoffer. Med disse justeringer protokollen kan være afsluttet i en betydeligt kortere tid. Tredje for stor cerebella den wholemount farvningsprotokol kræver store mængder af antistof opløsninger, som kan være dyre og / eller kun i begrænset kvantteter. Det er imidlertid muligt at spare de primære antistoffer efter hver kørsel ved at fryse opløsningen ved -20 ° C. Hver forsøgslederen bliver nødt til at afgøre, om deres antistof kan tåle frysning, før det genbruges. Har vi med succes farvet væv under anvendelse af tidligere frosne alikvoter af zebrinII. Fjerde ikke alle antistoffer er kompatible med den grundlæggende wholemount fremgangsmåde. For eksempel kræver antistof almindeligvis anvendes til at detektere den stribede ekspressionen af den lille varmechokprotein, HSP25, at vævet først behandlet for antigen hentning ^13. Uanset, som for farvning vævssnit, har traditionelle fejlfinding antistof-antigen-binding også vist sig nyttig til optimering wholemount farvning.

Vi er i øjeblikket undersøger muligheden for at tilpasse vores wholemount protokol til brug med fluorescerende-mærkede sekundære antistoffer. Med det passende mikroskop udstyret med evnen til at afbilde forskellige farver fluoropHores under lav-effekt, vil man være i stand til ikke alene analysere organiseringen af ​​flere Purkinje celle kort i samme dyr, men også undersøge forholdet mellem Purkinje celle stribe mønstre og topografi af WGA-Alexa mærket afferente fibre i tre dimensioner ^2,4.7,24. Desuden har den nylige tilgængeligheden af ​​store genekspressions databaser (Allen Brain Atlas, Genepaint, Brain Gene Expression kortet) har åbnet nye muligheder for sammenlægning vores high throughput wholemount tilgang med hele genomet analyser for at undersøge den molekylære topografi hele hjernen.