Wholemount Immunhistokjemi for å avdekke Complex Brain Topografi

Summary

Nevrale kretser er topografisk organisert i funksjonelle rom med spesifikke molekylære profiler. Her gir vi de praktiske og tekniske tiltak for å avsløre globale hjerne topografi med en allsidig wholemount immunhistokjemisk farging tilnærming. Vi viser nytten av metoden ved hjelp av godt forstått cytoarchitecture og krets av lillehjernen.

Abstract

Den gjentatte og godt forstått mobilnettet arkitektur av lillehjernen gjør det til et ideelt modellsystem for å utforske hjernen topografi. Underliggende sin relativt ensartet cytoarchitecture er en kompleks rekke parasagittal domener av gen og protein uttrykk. Den molekylære compartmentalization av lillehjernen speiles av den anatomiske og funksjonelle organiseringen av afferente fibre. Å få fullt utbytte av kompleksiteten i lillehjernen organisasjon vi tidligere videreutviklet en wholemount farging tilnærming for høy gjennomstrømning analyse av mønster defekter i musen lillehjernen. Denne protokollen beskriver i detalj de reagenser, verktøy og praktiske tiltak som er nyttige for å kunne avdekke protein uttrykk mønstre i den voksne musen lillehjernen ved hjelp wholemount farging. Trinnene uthevet her demonstrere nytten av denne metoden å bruke uttrykket av zebrinII / aldolaseC som et eksempel på hvordan den fine topografien i hjernen kan bli avslørt i sininnfødt tredimensjonale konformasjon. Også beskrevet er tilpasninger til protokollen som tillater visualisering av protein uttrykk i afferente anslag og stor cerebella for komparative studier av molekylære topografi. For å illustrere disse programmene, er data fra afferent farging av rotte lillehjernen inkludert.

Protocol

1. Animal Perfusjons og lillehjernen Dissection

1. Avhengig av protein, kan perfusjons være avgjørende for vellykket farging ^1,2. Transcardiac perfusjon er en invasiv, ikke-overlevelse prosedyre som krever riktig bruk av bedøvelse. Riktig trening, institusjonelle godkjenning, og IACUC godkjenning er nødvendig før du prøver den prosedyren. Det er alltid en god idé å konsultere institusjonens veterinærer for å få hjelp til å identifisere eksperimentelle krav og skaffe riktig trening. Før prosedyren, skal dyret være dypt bedøves og ikke responderer på stimuli som munn eller hale knipe. Bruke saks foreta et kutt i buk huden og muskel vegg og deretter fortsette å åpne brystkassen ved å kutte bare ved siden av sternum på hver side. I tillegg kan eksperimentator skape en større intern arbeidsområde ved å kutte fascia rundt mellomgulvet. Ved å løfte magen og thorax vegg superiorly, vil hjertet nå bli utsatt. Lag et lite snitt i høyre atrium å tillate blodet å strømme ut og umiddelbart sette perfusjon nålen inn i venstre hjertekammer. En grunnleggende hydrostatisk pumpe er å foretrekke å levere perfusjon løsningene (se tabell 1 for detaljer). Først skylle blodet ut med 0.1m fosfatbufret saltløsning (PBS, se tabell 3) inntil væsken renner klar. Deretter slår du av hydrostatisk pumpe, raskt bytte løsningen levering røret til en beholder med 4% paraformaldehyde (PFA, se tabell 3) fortynnet i PBS og slå pumpen igjen for å levere bindemiddel. Bruk av en pumpe er ikke nødvendig: med praksis, to sprøyter fylt med PBS og 4% PFA kan brukes til å sakte levere løsningene.
2. Det er viktig å nøye dissekere hjernen ut av skallen uten å innføre noen lesjoner til vevet. Selv små flenger til hjernen under disseksjon vil gradvis utvide til synlige sprekker somfelle antistoffer og forårsake artifactual flekker under behandlingen av vev (f.eks rød stjerne i Fig. 2). For lillehjernen disseksjoner, er det typisk å kutte i huden ned midt på hodet og deretter forsiktig erte klaffene hverandre for å avsløre skallen. Skjær skallen fra fremre til bakre langs dorsal midtlinjen, og også sidelengs langs begge sider av skallen. Ikke kutt utover bregma som dette risikerer nicking lillehjernen. Bruk pinsett forsiktig løft fronten av hodeskallen vekk fra hjernen være forsiktig med å rive vekk hjernevev som er festet til hjernehinnene. Sever Hjernenerve på ventrale siden av hjernen.
3. Separasjon av lillehjernen fra resten av hjernen er viktig av to grunner. Først gir det mulighet for utforskning av uttrykk mønstre i fremre lobules, som er skjult fra visningen av colliculi in situ. Den andre er at skille vevet i mindre, isolerte regioner gir mmalm komplett fiksering, noe som kan lette flekker av noen proteiner. Gjennom dette siste disseksjon trinnet, bør man sørge for å ikke berøre lillehjernen med tuppen av tang. Sett tuppen av en pinsett inn i midten av den overlegne og underlegne colliculi. Med et ekstra sett tang sakte erte bort mindreverdig colliculi fra lillehjernen. Deretter lå lillehjernen slik at fremre side vender ned og hjernestammen peker oppover. Sett tang inn i fjerde ventrikkel mellom hjernestammen og lobules IX / X av lillehjernen. Skjær peduncles ved å knipe med tang på begge sider og deretter forsiktig løft lillehjernen bort fra hjernestammen. Når lillehjernen er isolert, post-fikse det ved nedsenkning i 4% PFA ved 4 ° C i minimum 24-48 timer. Lillehjernen kan lagres i 4% PFA for en lengre periode. Hjernehinnene bør fjernes enten før eller etter farging for bedre synlighet av uttrykket mønstre.Dersom eksperimentator velger å fjerne hjernehinnene før farging er det en sterk mulighet for at lillehjernen vil bli bretter under prosessen. Peeling bort hjernehinnene på slutten av farging prosedyren er mye enklere fordi de blir lettere å finne etter at de tilegne seg svak bakgrunn flekker og bli skrøpelig etterbehandling.

2. Behandling av Tissue for Wholemount Farging

Fordi wholemount farging tilnærmingen tar lengre tid enn immunhistokjemisk farging av vev seksjoner, er det nyttig å planlegge tidslinjen for hvert av de eksperimentene som vist i eksemplet kalenderen følger (tabell 2). Før du starter, er det flere viktige ting å huske på. 1) De mikrorør inneholder vevet skal roteres på en nutator til alle tider, unntatt i fryse / tine prosessen. 2) Flere løsninger må tas frisk for hvert forsøk (Se tabell 3 for løsning oppskrifter). 3)Gjennom protokollen, når du skifter løsninger, forsiktig helle ut det brukte løsningen snarere enn å fjerne lillehjernen med pinsett, for å unngå å berøre lillehjernen. Så, etter å blande den nye løsningen i en annen beholder, bruker en pipette til å forsiktig legge den friske løsning til røret.

2.1 Dag 1:

1. Fest lillehjernen i Dent oss løse ^tre i romtemperatur i 6-8 timer gynger forsiktig på nutator. Hvis metanol er ødeleggende for antigen, bør du vurdere å bytte trinn 2.1a gjennom 2.3a med en antigen hentemetode. Varmen og buffere som brukes for antigen gjenfinning vil bidra til å forberede vevet for antistoff penetrasjon.
2. Bleach lillehjernen i Dent sin Bleach ³ natten ved 4 ° C.

2.2 Dag 2:

1. Uttørrende lillehjernen i to runder med 100% MeOH ved romtemperatur i 30 min hver.
2. Deretter å øke penetrasjonen av løsningene, med forbeholdvevet til en rekke fryse / tine sykluser. Plasser røret i en beholder med tørris og fryse i 30 min. Deretter fjerner røret og la det ved romtemperatur på benken i 15 minutt. Det fryse / tine trinn skal utføres fire ganger (minst).
3. Etter den siste tining av vev, plasser røret i en -80 ° C fryseren over natten.
4. Vevet kan lagres i lengre perioder ved -80 ° C enten umiddelbart før eller etter fryse / tine trinn. Ellers skal protokollen videreføres.

2.3 Dag 3:

1. Rehydrate lillehjernen ved å vaske den i 50% MeOH/50% PBS, 15% MeOH/85% PBS, og 100% PBS for 60-90 minutter hver ved romtemperatur.
2. Neste, for voksen mus cerebella, underlagt vevet til enzymatisk fordøyelse med 10μg/ml Proteinase K i PBS i 2-3 minutter. Ingen fordøyelsen trinnet er nødvendig for cerebella av unge dyr (P5 eller yngre i mus). Lengre digestion er foreslått for større hjerner. For eksempel kan fordøyelsen bli så høy som 5-6 minutter for primate hjerner ^4.
3. Etter fordøyelse, vask straks lillehjernen i PBS tre ganger i 10 minutter hver i romtemperatur for å fjerne Proteinase K.
4. Blokker vevet i PMT (se tabell 3) over natten ved 4 ° C. Melkepulver er ofte førstevalget når du velger en blokkerende middel for protein arbeid fordi det er billig, senker effektivt bakgrunn flekker, og vanligvis ikke forstyrrer antistoffbinding eller tilgang til antigen. Animal serumer kan også brukes, selv om eksperimentator bør være klar over den ekstra kostnaden, og må først teste serum kvalitet for kryss-reaktive immunglobuliner og evne til å produsere en optimal signal til støyforhold.

2.4 Dag 4-5:

1. Inkuber vev i primære antistoffer utvannet i PMT supplert med 5% DMSO i 48 timer ved 4 ° C (largER cerebella vil kreve økte inkubasjonstider).

2.5 Dag 6:

1. Vask lillehjernen 2-3 ganger i 2-3 timer hver i PMT ved 4 ° C for å fjerne ubundet primære antistoffer.
2. Deretter inkuber vevet i sekundære antistoffer i en løsning som inneholder PMT med 5% DMSO ved 4 ° C over natten (større cerebella kan kreve økte inkubasjonstider).

2.6 Dag 7:

1. Vask lillehjernen 2-3 ganger i 2-3 timer hver i PMT ved 4 ° C.
2. Gi vevet en endelig vask med PBT (se tabell 3) i 1-2 timer. Dette trinnet fjerner overflødig melk og forbedrer klarheten i farging.
3. Endelig inkuber vevet i DAB (3,3 '-diaminobenzidine) løsning til optimal farging intensitet er nådd. Den brune reaksjon produktet skal være godt synlig i løpet av ~ 10 minutter. Det er best å bruke DAB i mørket som lyset får kromogenløsningen til precipitaTe, noe som kan øke bakgrunn farging.

2.7

Når optimal farging intensitet er nådd, stopper reaksjonen ved å plassere lillehjernen i PBS med 0,04% natriumazid. Vevet kan oppbevares langsiktig i denne løsningen. Natriumazid er en potent hemmer av bakterievekst, men bør unngås før dette trinnet som også hemmer pepperrot peroksidase.

2,8 Valgfritt forsterkning prosedyre:

følge normal protokoll, men disse trinnene skal utføres i stedet for trinn 2.5b-2.7 ovenfor.

1. Inkuber vev over natten ved 4 ° C i biotin-konjugerte sekundære antistoffer i PBST (se tabell 3) med 5% DMSO.
2. Skyll vevet i 2-3 timer hver i 3-4 endringer av PBST ved romtemperatur.
3. Inkuber lillehjernen natten ved 4 ° C i ABC kompleks løsning i PBST.
4. Skyll vevet i 2-3 timer hver påromtemperatur i 3-4 endringer av PBS.
5. Inkuber vev i ferskt preparert DAB-løsning, som beskrevet ovenfor.
6. Når farging er optimal, stoppe reaksjonen ved å vaske lillehjernen i PBS med 0,04% natriumazid.

3. Imaging den Stained Tissue

1. Wholemount bilder kan tas ved hjelp av for eksempel montert en Leica DFC3000 FX kameraet på en Leica MZ16 FA stereomikroskop kjører Leica Application Suite FX programvare. Om ønskelig kan deconvolution mikroskopi benyttes til å erverve flere etterfølgende bilder i ulike fokus fly, med hvert bilde har bare en eneste lobule i skarp fokus. Deretter kan bildene komprimeres i én bunke og programvare gjengis for å fjerne forvrengning. Den endelige sammensatte bildet vil illustrere lillehjernen overflate uttrykk mønstre med alle synlige mønstre i tydelig fokus.
2. Wholemount beiset vev skal avbildes mens midt i PBS (eller et annet medium som vil gi enoptimal brytningsindeks). For å enkelt plassere wholemount for bildebehandling, lage en 1% agar gel i en plast petriskål. Skjær små hull inn i gel. Hullene vil tillate lillehjernen å bli klemt inn i ønsket retning.
3. Rådata er importert til Adobe Photoshop CS4 og justert for kontrast og lysstyrke nivåer.

Dyr

Alle dyrestudier ble utført under en godkjent IACUC dyr protokollen i henhold til de institusjonelle retningslinjer ved Albert Einstein College of Medicine. Mann og kvinne outbred sveitsiske Webster (Taconic, Albany, NY) mus ble opprettholdt i kolonien vårt og brukes for alle studier. Euthanized voksne rotter ble vennlig levert av Dr. Bryen Jordan (Albert Einstein College of Medicine). Alle dyr var minst en måned gammel.

4. Representative Resultater

Lillehjernen er compartmentalized av molekylær uttrykk i fire tverrgående soner:anterior sone (AZ: ~ lobules IV), den sentrale sonen (CZ: ~ lobules VI-VII), den bakre sonen (PZ: ~ lobules VIII-dorsal IX) og nodulær sone (NZ: ~ lobules IX ventral og X ) 5. Hver sone inneholder et unikt utvalg av parasagittal stripene ^1,2,5,6 (Fig. 1). ZebrinII uttrykk i Purkinje celler avslører striper i AZ og PZ (Fig. 2) og enhetlig uttrykk i CZ og NZ (Fig. 2). Den parasagittal Organiseringen av Purkinje celler speiles ved terminalen feltet topografien afferente fibre. Kokain-og amfetamin-regulert karakterutskrift (CART) peptid uttrykkes i undergrupper av klatring fibre (Fig. 3a) som prosjekt til striper av Purkinje celle dendritter i den molekylære laget av lillehjernen cortex ⁷ (Fig. 3b). Med de riktige endringene, som for eksempel forsterkning ^7, tillater wholemount protokollen for visualisering av olivocerebellar mønstre uten need for et møysommelig og tidkrevende ombygginger mot misfarging vevsdelene (Fig. 3b).

Figur 1. A. ZebrinII / aldolaseC uttrykket avslører sagittal band i tverrgående deler av lillehjernen. Scale bar = 500 mikrometer. B. ZebrinII / aldolaseC er uttrykt utelukkende i Purkinje celle somata og dendritter. Scale bar = 150μm (gl = kornet lag; PCL = Purkinje celle laget; ml = molekylær lag).

Figur 2. En wholemount lillehjernen farges for ZebrinII / aldolaseC viser Purkinje celle striper i bildene av fremre (AZ), sentral (CZ), og posterior (PZ) soner av lillehjernen. Her viser vi også et eksempel på den negative konsekvensen av nicking lillehjernen. Den resulterende artifactual farging er indisertmed røde stjerner. Skala bar = 1 mm (LS = lobulus simplex; PML = paramedian lobule; COP = copula pyramidis).

Figur 3. A. CART er uttrykt i klatring fiber terminaler i molekylær laget. Scale bar = 100 mikrometer. (Ml = molekylært lag; PCL = Purkinje celle laget; gl = kornet lag) B. Wholemount immunhistokjemi av CART uttrykk i NZ. Scale bar = 2 mm (COP = copula pyramidis; PML = paramedian lobule; PFL = paraflocculus; FL = flocculus).

Discussion

Vi har beskrevet de tekniske detaljene som kreves for vellykket wholemount farging med en allsidig immunhistokjemisk tilnærming for avslørende protein uttrykk i utviklingsland og voksne hjernen. Ved å bruke denne tilnærmingen, kan kompliserte molekylære uttrykk mønstre bli analysert og hjerne topografi verdsatt uten behov for arbeidskrevende og tidkrevende vev utsnitt prosedyrer.

Denne protokollen har blitt brukt til å avsløre den mønstrede uttrykket av flere Purkinje-proteiner i både den voksne ^1,2,8,9 og tidlig postnatal mus lillehjernen ^10,11,12. Våre originale studier også vist nytten av wholemount tilnærming for å undersøke granule celle antigen uttrykk ¹ og anterogradely spores mosegrodde fibre ^2, som bor ~~~HEAD=NNS 250 mikrometer under pial overflaten i kornet lag. I tillegg har flere studier gjort endringer i den opprinnelige protokollen for vellykket farging av proteiner in Purkinje celler ^1,13 (antigen henting) og afferente fibre ^7,14 (signal amplifisering, Fig. 2.). Videre har wholemount immunhistokjemisk farging også blitt brukt til cerebella av flere pattedyr ^4,15 og avian ^16,17 arter, som brukes til kart mønstret Purkinje celle tap i musemodeller av nevrodegenerative sykdommer ^18,19, og modifisert for å farge hjerte ^20, lunge ^21, Hjernenerve ²² og hornhinnen nerver ^23. Den store avgang av dagens protokollen fra tidligere beskrivelser av wholemount metoden ^1,2 er at vi her gir ikke bare oppdaterte detaljer for bedre å lykkes når du bruker prosedyren, men også en komplett guide for feste vevet, dissekere vevet og en i dybde video illustrasjon av teknikken.

Det er flere begrensninger wholemount farging. Først bare overflaten mønstre er typitisk visualisert uten videre disseksjon og flekker eller uten å øke lengden på tiden at vevet inkuberes i antistoffer. Videre vil farging ikke nå dypt inne i hjernebarken hvis det er skjult på grunn av foliasjon ^1,2. Imidlertid kan wholemount beiset vev være seksjonert etter behandling og restained, med samme antistoff eller en annen, for å avsløre cellulære uttrykk profiler dypere i vevet ^1,2. For det andre er det grunnleggende wholemount farging protokollen lang. Vi foreslår at hver eksperimentator empirisk bestemme farging effektiviteten av sine antistoffer og forkorte post-fiksering tid, redusere antall og lengde på vask, og / eller korte ned lengden på inkubering i de primære antistoffer. Med disse justeringene protokollen kan gjennomføres i en betydelig kortere tid. Tredje, for stor cerebella den wholemount farging protokollen krever store mengder av antistoffet løsninger, som kan være dyrt og / eller kun tilgjengelig i et begrenset Quantteter. Det er imidlertid mulig å redde de primære antistoffer etter hvert løp ved å fryse løsningen ved -20 ° C. Hver eksperimentator må avgjøre om deres antistoff tåler frysing før det blir gjenbrukt. Vi har med hell farget vev ved hjelp av tidligere frosset alikvoter av zebrinII. Fjerde, ikke alle antistoffer er forenlig med grunnleggende wholemount tilnærming. For eksempel krever antistoffet vanligvis brukes til å oppdage den stripete uttrykk for den lille varme sjokk protein, HSP25, at vevet blir første behandlet for antigen gjenfinning ^13. Uansett, som til farging vevsdelene, har tradisjonelle metoder for feilsøking antistoff-antigen-bindende også vist seg nyttig for å optimalisere wholemount farging.

Vi er for tiden utforsker muligheten for å tilpasse vår wholemount protokoll for bruk med fluorescent-taggede sekundære antistoffer. Med riktig mikroskop utstyrt med evnen til bildet ulikfarget fluorophores henhold lavt strømforbruk, ville man kunne ikke bare analysere organiseringen av flere Purkinje celle kart i samme dyr, men også undersøke forholdet mellom Purkinje celle stripemønsteret og topografien av WGA-Alexa merket afferente fibre i tre dimensjoner ^2,4.7,24. Videre nylig tilgjengeligheten av store genekspresjon databaser (Allen Brain Atlas, Genepaint, Brain Gene Expression Map) har åpnet nye veier for å slå sammen våre høy gjennomstrømming wholemount tilnærming med hele genomet analyser for å undersøke den molekylære topografien i hele hjernen.