Summary
신경 회로는 topographically 특정 분자 프로필과 기능적 구획으로 구성되어 있습니다. 여기서는 다양한 wholemount immunohistochemical 염색법 접근 방식을 사용하여 글로벌 뇌의 지형을 드러내는을위한 실용적이고 기술적인 단계를 제공합니다. 우리는 잘 이해 cytoarchitecture과 소뇌의 회로를 사용하는 방법의 유틸리티를 보여줍니다.
Abstract
소뇌의 반복이고 잘 이해 셀룰러 아키텍처는 뇌의 지형을 탐험하는 데 이상적인 모델 시스템을 확인합니다. 그것의 비교적 균일한 cytoarchitecture 밑에는 유전자 및 단백질 표현의 parasagittal 도메인의 복잡한 배열입니다. 소뇌의 분자 compartmentalization는 수입 성의 섬유의 해부 학적 및 기능적 조직 피지만. 완전히 소뇌 조직의 복잡도를 감사하기 위해 우리는 이전에 마우스 소뇌의 patterning 결함의 높은 처리량 분석을위한 wholemount 염색법 방식을 정제. 이 프로토콜은 상세히 시약, 도구 및 성공적 wholemount immunostaining를 사용하여 성인 마우스 소뇌에서 단백질 발현 패턴을 표시하는 방법으로 유용 실용적인 단계를 설명합니다. 단계는 여기에서 뇌의 미세 지형이 그 드러날 수있는 방법의 예로 zebrinII / aldolaseC의 표현을 사용하여이 방법의 유틸리티를 입증 강조네이티브 입체 형태. 또한 설명은 분자 지형의 비교 연구를위한 수입 성의 전망 및 대형 cerebella의 단백질 표현의 시각화 수 있도록 프로토콜에 adaptations 있습니다. 이러한 응용 프로그램을 설명하기 위해 쥐의 소뇌의 수입 성의 염색법의 데이터가 포함되어 있습니다.
Protocol
1. 동물 재관류와 소뇌의 해부
- 단백질에 따라 관류는 성공적인 염색법의 1,2에 필수적인 것입니다. Transcardiac 재관류는 anesthetics의 적절한 사용을 필요로 침입이 아닌 생존 절차입니다. 올바른 교육 기관 승인 및 IACUC 승인 모든 절차를 시도하기 전에 필요합니다. 항상 실험적인 요구 사항을 식별하고 올바른 교육을 습득에 도움을받을 기관의 수의사와 상담하는 것이 좋습니다. 절차 전에 동물 깊이 anesthetized 등 도보 또는 꼬리 핀치와 같은 자극에 반응하지 있어야합니다. 이용 가위는 복부 피부와 근육 벽에 상처를 만들고 다음 각 측면에 흉골에 단지 인접 절단하여 흉곽을 열 것을 계속한다. 또한, 실험자들은 다이어프램을 둘러싼 근막을 절단하여 큰 내부 작업 공간을 만들 수 있습니다. 복부 및 흉부 벽 superio 운동으로rly, 심장이 지금 노출됩니다. 밖으로 흘러 즉시 좌심실로 관류 바늘을 삽입하기 위해 혈액을 허용하도록 오른쪽 중앙홀에 작은 절개를합니다. 기본 정압 펌프는 (자세한 내용은 표 1 참조) 재관류 솔루션을 제공하는 것을 추천한다. 첫째, 0.1M 인산과 혈액을 끌어낼 유체 분명히 실행까지 (PBS, 표 3 참조) 염분 버퍼. 그런 다음, 정압 펌프를 끌 신속 PBS에 희석 4 % paraformaldehyde의 용기 (PFA, 표 3 참조) 솔루션 납품 관을 전환할 후 정착액을 전달하기 위해 다시 펌프를 켜십시오. 펌프의 사용은 필요하지 않습니다 : 연습을 가진 두 개의 주사기는 PBS로 가득한 및 4퍼센트 PFA는 천천히 솔루션을 제공하는 데 사용할 수 있습니다.
- 그것은 신중하게 조직에 어떠한 병변을 소개하지 않고 두개골의 두뇌를 해부하는 데 매우 중요합니다. 해부 동안 뇌로 비록 작은 상처가 서서히 눈에 띄는 구석으로 확대할 것이다트랩 항체가 및 조직 (그림 2의 예를 들어 빨간색 별표)을 처리하는 동안 artifactual 염색법의 원인이됩니다. 소뇌 절개의 경우는 머리의 중간에서 내려 피부를 자르고 나서 부드럽게 두개골을 노출 펄럭를 분리 괴롭혀 일반적입니다. 지느러미 중간선을 따라 사후 위해 앞부분에서 두개골을 잘라, 또한 laterally 두개골의 양쪽을 따라. 이 소뇌를 nicking의 위험을 실행으로 bregma 넘어 끄지 마. 집게를 사용하면 부드럽게 meninges에 첨부되어 뇌 조직을 떠날하지 않도록 조심하는 두뇌에서 떨어져 두개골 전면 리프트. 두뇌의 복부 측면에 두개골 신경을 끊다.
- 두뇌의 나머지 부분에서 소뇌의 분리는 두 가지 이유로 중요하다. 첫째, 그것은 원래의 장소에 colliculi으로보기에서 숨겨진 앞쪽에 lobules에 표현 패턴의 탐험을 허용합니다. 두 번째는 작고 고립된 지역에 조직을 분리하는 것은 m을 허용한다는일부 단백질 염색법을 용이하게 수 광석 완전 고정. 이 최종 해부 단계 동안주의가 포셉의 조언과 소뇌를 만지지로 연결됩니다. 우수와 열등 colliculi의 중간에 포셉 한 켤레의 끝을를 삽입합니다. 집게의 두 번째 집합이 천천히 소뇌에서 열등 colliculi 멀리 애타게 함께. 그 앞쪽에 면이 아래로 향하게되고 brainstem가 위쪽으로 가리키는 있도록 다음, 소뇌 서봐. brainstem 및 lobules IX / 소뇌의 X 사이에 네 번째 뇌실로 포셉를 넣습니다. 양쪽에 집게로 곤란하여 peduncles 잘라 후 부드럽게 brainstem에서 떨어져 소뇌 리프트. 소뇌가 격리되면 24-48시간의 최소 ° C ~ 4에 4퍼센트 PFA에 침수하여 게시 - 수리. 소뇌는 오랜 기간 동안 4퍼센트 PFA에 저장할 수 있습니다. meninges는 앞이나 표현 패턴 나은 가시성을 위해 더럽히는 것 전이나 후에 제거해야합니다.실험자들은 소뇌는 과정에서 다친 것이라고 강한 가능성이있다 염색법 전에 meninges를 제거하도록 선택하면. 그들이 약한 배경 염색법을 습득하고 후처리 연약한을 받고 나면 위치를 쉽게되기 때문에 염색법 절차의 끝에 meninges 멀리 필링 것이 훨씬 쉽습니다.
2. Wholemount 염색법을위한 조직 처리
wholemount 염색법 접근 방식은 더 이상 조직 섹션의 immunohistochemical 염색법 이상 소요되기 때문에 그것은 (표 2) 제공된 예제 달력 그림과 같이 실험을 각각의 타임 라인을 계획하는 데 도움이됩니다. 시작하기 전에 염두에 두어야 할 몇 가지 중요한 것들이 있습니다. 1) 조직을 포함하는 microtubes은 동결 / 해동 과정을 제외하고 항상 nutator에서 회전한다. 2) 여러 솔루션 (솔루션 조리법에 대한 표 3 참조) 각 실험에 대한 신선한하셔야합니다. 3)프로토콜을 통해 솔루션을 변경할 때, 부드럽게 소뇌에 닿지 않도록, 오히려 포셉와 소뇌를 제거하는 것보다 지출 솔루션을 쏟다. 그런 다음 다른 용기에 새로운 솔루션을 혼합 후, 부드럽게 튜브에 새로운 솔루션을 추가하는 피펫을 사용합니다.
2.1 일 1 :
- 6~8시간가 nutator에 부드럽게 출렁 이는 동안 실온에서 덴트의 픽스 3 소뇌를 고정한다. 메탄올 당신의 항원에 대한 파괴적인 경우 항원 검색 방식을 통해 2.3a 2.1a 단계를 교체하는 것을 고려하십시오. 항원 검색에 사용되는 열 및 버퍼는 항체 침투를 위해 조직을 준비하는 데 도움이됩니다.
- 4에 하룻밤 덴트의 블리치 3 블리치 소뇌 ° C.
2.2 일 2 :
- 30 분 각각 실온에서 100 % MeOH의 두 라운드에서 소뇌를 탈수.
- 그런 다음, 주제, 솔루션의 침투를 강화하는동결 / 해동 사이클의 연속으로 조직. 30 분 용 드라이 아이스와 동결과 함께 용기에 튜브를 조심스럽게 넣으십시오. 그런 다음 튜브를 제거하고 15 잠시 벤치에 상온에서 둡니다. 동결 / 해동 단계는 네 번 (최소)을 수행하여야한다.
- 조직 해동 지난 후 하룻밤 -80 ° C 냉동실에 튜브를 넣습니다.
- 조직은 -80에서 시간 연장 기간 동안 저장할 수 ° C 즉시 이전 또는 동결 / 해동 단계 이후 중. 그렇지 않으면, 프로토콜은 계속되어야합니다.
2.3 일 3 :
- 50 %를 세척하여 소뇌를 Rehydrate MeOH/50 % PBS 15 % MeOH/85 % PBS, 그리고 60-90분 실온에서 각각 100 % PBS.
- 다음으로, 성인 마우스 cerebella, 주제 2-3분위한 PBS에서 10μg/ml Proteinase K로 효소 소화에 대한 조직입니다. 어떤 소화 단계는 젊은 동물 cerebella (마우스의 P5 세 이하)에 대한 필요가 없습니다. 긴 digestioN은 더 큰 두뇌를 위해 추천됩니다. 예를 들어, 소화는 영장류 두뇌 4 5-6분만큼 높은가 될 수 있습니다.
- 소화 후 즉시 Proteinase K '를 제거하기 위해 상온 10 분마다 PBS 세 번에서 소뇌를 씻어
- 4에서 하룻밤 (표 3 참조) PMT에서 조직을 차단 ° C. 그것이 저렴하기 때문에 분유 종종 단백질 일에 차단 에이전트를 선택하는 첫 번째 선택, 효과적으로 배경 염색법을 절감하고, 일반적으로 항체 바인딩이나 항원에 대한 액세스를 방해하지 않습니다. 실험자들이 추가 비용을 알고 있어야하고 처음 교차 반응 면역 글로불린 및 노이즈 비율로 최적의 신호를 생산할 수있는 능력에 대한 혈청 품질을 테스트해야합니다 비록 동물 serums 또한, 사용하실 수 있습니다.
2.4 일 4-5 :
- 4 ° C (larg에서 48 시간 동안 5 % DMSO와 보충 PMT에 희석 일차 항체의 조직을 품어어 cerebella)은 증가 부화 시간을 요구합니다.
2.5 일 6 :
- 언바운드 일차 항체를 제거하려면 4 ° C에서 2~3시간 PMT의 각 소뇌에게 3 배 더 씻으십시오.
- 그런 다음, 4에서 5 % DMSO와 PMT를 포함하는 용액에 이차 항체의 조직을 품어 ° C에서 하룻밤 (큰 cerebella가 필요할 수 있습니다 증가 부화 시간).
2.6 일 7 :
- 4 ° C.에 2-3시간 PMT의 각 소뇌에게 3 배 더 씻으십시오
- 조직에게 1~2시간위한 PBT (표 3 참조)와 최종 세차주세요. 이 단계는 과잉 우유를 제거하고 염색법의 선명도를 향상시킵니다.
- 최적의 염색법 강도에 도달할 때까지 마지막으로, DAB (3,3 '-diaminobenzidine) 용액에 조직을 품어. 갈색 반응 생성물은 ~ 10 분 이내에 명확하게 표시합니다. 빛이 precipita에 chromogen의 원인으로 그것은 어둠 속에서 DAB를 사용하는 것이 가장 좋습니다배경 염색법을 높일 수 있습니다 테.
2.7
최적의 염색법 강도에 도달하면 0.04 %의 나트륨 azide와 PBS에서 소뇌를 배치하여 반응을 중지합니다. 조직은이 솔루션에 장기간 저장할 수 있습니다. 나트륨 azide은 세균 성장의 강력한 억제제이다뿐만 아니라 양고추냉이 퍼옥시데이즈을 억제으로이 단계까지 피해야한다.
2.8 선택적 증폭 절차 :
정상적인 프로토콜을 따르지만,이 단계는 단계 위의 2.5b-2.7을 대신하여 수행되어야한다.
- 4에서 하룻밤 조직을 품어 ° 5 % DMSO와 PBST에서 비오틴 - 복합 이차 항체 (표 3 참조)에서 C #.
- 2~3시간 상온에서 PBST 중 3-4 변화의 각 조직을 씻어.
- 4에서 하룻밤 소뇌를 품어 ° C를 PBST에서 ABC의 복잡한 솔루션.
- 에서 2-3시간 각 조직을 씻어PBS의 3-4 변경 상온.
- 위에서 설명한 갓 준비한 DAB 솔루션의 조직을, 알을 품다.
- 염색법 최적의 경우 0.04 %의 나트륨 azide와 PBS에서 소뇌를 세척하여 반응을 중지합니다.
3. 이미징 얼룩진 조직
- Wholemount 이미지 예를 들어, 사용하여 캡처할 수, Leica DFC3000 FX 카메라는 Leica 애플 리케이션 스위트 FX 소프트웨어를 실행 Leica MZ16 FA의 stereomicroscope에 장착된. 원하는 경우 deconvolution 현미경은 각 이미지가 선명하고 초점에서 단 하나의 lobule을 먹고, 서로 다른 초점 비행기에서 여러 개의 연속적인 이미지를 확보하는 데 사용할 수 있습니다. 다음 이미지는 하나의 스택과 왜곡을 제거하는 렌더링 소프트웨어로 압축 할 수 있습니다. 최종 합성 이미지는 분명 초점의 모든 보이는 patterning과 소뇌 표면 표현 패턴을 설명합니다.
- PBS에 열중하면서 Wholemount 스테인드 조직 (또는를 줄 것이다 다른 미디어 군데해야최적의 굴절률). 쉽게 이미지에 대한 wholemount을 배치하기 위해서는 플라스틱 배양 접시에 1 %의 한천 젤합니다. 겔에 작은 구멍을 잘라 버릴거야. 구멍은 소뇌가 원하는 방향으로 끼여 수 있도록합니다.
- 원시 데이터는 어도비 포토샵 CS4로 가져올 및 대비 및 밝기 수준으로 조정됩니다.
동물
모든 동물의 연구는 의학의 알버트 아인슈타인 대학에서 제도적 지침에 따라 승인된 IACUC 동물 프로토콜 하에서 수행되었다. 남성과 여성 outbred 스위스 웹스터 (Taconic, 알바니, 뉴욕) 생쥐는 우리 식민지 유지 및 모든 연구를 위해 사용되었습니다. Euthanized 성인 쥐가 친절 박사 Bryen 요르단 (의학 알버트 아인슈타인 대학)에 의해 제공되었다. 모든 동물은 한 달쯤 있었다.
4. 대표 결과
소뇌은 네 가로 구역으로 분자 표현으로하게 구분됩니다 :앞부분 영역 (AZ : ~ lobules IV), 중앙 영역 (CZ : ~ lobules VI-VII), 후부 영역 (PZ : ~ lobules VIII-IX 지느러미)와 마디가있는 영역 (NZ : ~ lobules IX 복부와 X ) 5. 각 영역 parasagittal 줄무늬 1,2,5,6 (그림 1)의 독특한 배열을 포함하고 있습니다. Purkinje 세포의 ZebrinII 표현은 AZ와 PZ (그림 2)와 CZ와 뉴질랜드 (그림 2) 유니폼을 표현의 줄무늬를 나타내고있다. Purkinje 세포의 parasagittal 조직은 수입 성의 섬유의 터미널 현장 지형 피지만. 코카인과 암페타민 - 규제 성적 증명서 (카트)이 펩타이드는 등산 섬유 (그림 3A)의 하위 집합으로 표현되는 소뇌 피질 7 (그림 3B)의 분자 층의 Purkinje 세포 dendrites의 줄무늬로 프로젝트. 같은 증폭 7 등 적절한 수정, 함께 wholemount 프로토콜은 옛 성은없이 olivocerebellar 패턴 시각화을 허용더럽히는 것 티슈 섹션 (그림 3B)에서 힘드는 시간이 소요 reconstructions위한 D.
그림 1. A. ZebrinII / aldolaseC 표현은 소뇌의 가로 섹션에 화살 밴드를 보여준다. 크기 조정 막대 = 500 μm의가. B. ZebrinII / aldolaseC은 Purkinje 세포 somata과 dendrites에만 표시됩니다. 스케일 바 = 150μm (GL = 세분화된 계층; PCL = Purkinje 세포 계층, ML = 분자 층).
그림 2. ZebrinII / aldolaseC는 앞부분 (AZ), 중앙 (CZ), 그리고 소뇌의 후부 (PZ) 영역의 이미지에서 Purkinje 세포 줄무늬를 보여주는 동안 물들일 wholemount 소뇌. 여기에서 우리는 또한 소뇌를 nicking의 부정적인 결과의 예를 보여줍니다. 결과 artifactual 염색법이 표시됩니다빨간색 별표가있는. 스케일 바 = 1mm (LS = lobulus의 심플, PML = paramedian lobule; COP = 연결사 pyramidis).
그림 3. A. 카트는 분자 층으로 섬유 터미널을 등산에 표시됩니다. 스케일 막대 = 100 μm의. (ML = 분자 층; PCL = Purkinje 세포 계층, GL = 세분화된 계층) 뉴질랜드에서 카트를 표현 B. Wholemount의 immunohistochemistry. 스케일 바 = 2mm (COP = 연결사 pyramidis; PML = paramedian lobule; PFL = paraflocculus; FL = 괴상).
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Discussion
우리는 개발과 성인 두뇌의 의미 심장한 단백질 발현을위한 다목적 immunohistochemical 접근법을 사용해서 성공 wholemount의 염색법에 필요한 기술적인 세부 사항을 설명했습니다. 이 접근법을 사용하여 복잡한 분자 발현 패턴 분석 수 있으며 뇌 지형이 힘드는 시간이 소요되는 조직 sectioning 절차없이 평가.
이 프로토콜은 성인 1,2,8,9 및 조기 출생 후의 마우스 소뇌 10,11,12 모두에서 여러 Purkinje 세포 단백질의 패턴 표현식을 나타내기 위해 사용되었습니다. 우리의 원래의 연구는 또한 세분화된 레이어 pial 지표면 아래 ~ 250 μm의를 상주 과립 세포 항원 표현 1과 anterogradely 추적 이끼 낀 섬유 2, 검사를위한 wholemount 접근 방식의 유틸리티를 보여주었다. 또한, 여러 연구는 단백질의 성공적인 염색법을 위해 원래의 프로토콜에 수정을 만들었 전N Purkinje 세포 1,13 (항원 검색) 및 수입 성의 섬유 7,14 (신호 증폭, 그림 2.). 또한, wholemount immunohistochemical 염색법은 또한 여러 포유류의 4,15의 cerebella 및 neurodegenerative 질병 18,19의 마우스 모델에서지도 패턴 Purkinje 세포의 손실에 익숙해 조류 16,17 종에 적용하고, 심장 20, 폐를 얼룩이 수정되었습니다 21, 두개골 신경은 22 각막 신경 23. wholemount 방법 1,2의 이전 설명에서 현재 프로토콜의 주요 출발 현재 우리의 조직과 해부 해 더 나은 성공에 대한 업데이트된 세부 절차를 사용뿐만 아니라, 조직을 고정을위한 완벽한 가이드뿐만 아니라 제공하는 것입니다 기술의 깊이 영상 일러스트.
wholemount 염색법의 여러 가지 한계가 있습니다. 첫째, 전용 표면 패턴 typi 있습니다캘리 추가로 해부하고 염색법없이 또는 조직 항체에 incubated되는 시간의 길이를 증가하지 않고 시각. 그것이 foliation 1,2로 인해 숨겨져있는 경우 또한 염색법은 피질 내에서 깊이에 도달하지 않습니다. 그러나 wholemount 스테인드 조직은 조직 1,2 내에 깊이 세포 표현 프로필을 나타내기 위해, 동일한 항체 또는 다른으로 처리 이후 sectioned이어야하며 restained 수 있습니다. 둘째, 기본적인 wholemount의 염색법 프로토콜은 길다. 우리는 각각의 실험자들이 경험적으로 자신의 항체의 염색법의 효율성을 결정하고 이후 고정 시간을 단축 번호와 길이 세차장의, 및 / 줄이거나 일차 항체의 인큐베이션의 길이를 단축하는 것이 좋습니다. 이러한 조정을 통해 프로토콜은 상당히 짧은 시간에 완료할 수 있습니다. 셋째, 대형 cerebella 위해 wholemount 염색법 프로토콜은 제한된 양의에서 값비싼 및 / 또는에서만 사용할 수 항체 솔루션의 큰 볼륨을 필요로ities. 그러나, 그것은 -20 ° C.에 솔루션을 동결하여 각 실행 후 일차 항체를 저장하는 것이 가능 각 실험자들은 그것을 다시 사용하기 전에 항체가 얼어 견딜 수 있는지 여부를 확인해야합니다. 우리는 성공적으로 zebrinII의 이전에 냉동 aliquots를 사용하여 조직을 묻다했습니다. 넷째, 모든 항체는 기본 wholemount 접근 방식과 호환됩니다. 예를 들어, 일반적으로 작은 열 충격 단백질, HSP25의 줄무늬 표현을 감지하는 데 사용되는 항체는 조직이 처음 항원 검색 13 처리될 것을 요구합니다. 에 관계없이, 더럽히는 것 조직 섹션에 관해서는 문제 해결 항체 - 항원 결합의 전통적인 방법도 wholemount 염색법을 최적화하기위한 유용한 입증했습니다.
현재 형광 - 태그가 이차 항체와 함께 사용하기 위해 우리의 wholemount 프로토콜을 적응하는 가능성을 모색하고 있습니다. 이미지를 각기 다른 색깔의 fluorop 수있는 능력을 갖춘 적절한 현미경으로저전력 이하 hores, 한 단지 같은 동물에서 여러 Purkinje 세포지도의 조직을 분석하지 수있을뿐만 아니라, Purkinje 세포 스트 라이프 패턴 및 WGA-알렉사의 지형은 세 차원에서 도입 성의 섬유 레이블 사이의 관계를 조사 것이다 2,4.7,24. 또한, 대규모 유전자 발현 데이터베이스의 최근 가용성 (앨런 뇌 아틀라스, Genepaint, 뇌 유전자 발현지도) 전체 뇌의 분자 지형을 조사에 대한 전체 게놈 분석으로 우리의 높은 처리량 wholemount 접근 방식을 접목을위한 새로운 길을 열었습니다.
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Disclosures
우리는 공개 할게 없다.
Acknowledgments
RVS는 예시바 대학 의과 알버트 아인슈타인 대학에서 창업 자금을 새로운 조사에 의해 지원됩니다.
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