Summary
神経回路は、地形的に特定の分子プロファイルを持つ機能的なコンパートメントに編成されています。ここでは、多彩なwholemount免疫組織化学的染色のアプローチを使用してグローバル脳の地形を明らかにするための実用的かつ技術的な手順を提供しています。我々はよく理解され細胞構築、小脳の回路を用いる方法の有用性を示しています。
Abstract
小脳の繰り返し、十分に理解細胞のアーキテクチャでは、脳の地形を探索するのに理想的なモデルシステムを確認します。比較的均一な細胞構築の基礎となると、遺伝子およびタンパク質発現の矢ドメインの複雑な配列です。小脳の分子区画は、求心性線維の解剖学的および機能的な組織によってミラーリングされています。完全に小脳組織の複雑さを理解するために我々は、以前はマウス小脳におけるパターン欠陥のハイスループット分析のためのwholemount染色アプローチを洗練された。このプロトコルは、詳細で正常にwholemount免疫染色を用いて成体マウス小脳におけるタンパク質の発現パターンを明らかにするために有用である試薬、ツール、および実用的な手順について説明します。手順はここで脳の微細な地形は、そのに明らかにすることができる方法の例としてzebrinII / aldolaseCの式を使用してこの方法の有用性を示す強調表示されたネイティブの三次元立体配座。についても説明し、分子の地形の比較研究のための求心性の予測および大型小脳におけるタンパク質発現の可視化を可能にするプロトコルへの適応があります。これらのアプリケーションを説明するために、ラット小脳の求心性染色からのデータが含まれています。
Protocol
1。動物の灌流および小脳の解剖
- 蛋白質に応じて、灌流が成功した染色1,2のために不可欠である可能性があります。経心臓的に灌流は麻酔薬の適切な使用を必要とする侵襲的、非生存の手順です。正しいトレーニング、制度の承認、およびIACUC承認はすべての手順を実行する前に必要です。それは、常に実験的な要件を識別し、適切なトレーニングを取得するにヘルプを表示するには、金融機関の獣医師に相談することをお勧めします。手順の前に、動物は、深く麻酔し、そのような足や尾のピンチのような刺激に応答しない必要があります。を使用してはさみで腹部の皮膚や筋肉の壁にカットを作成し、次にそれぞれの側で胸骨に隣接して切断することによって胸郭を開き続けています。さらに、実験者は横隔膜を囲む筋膜を切断することにより大容量の内部作業スペースを作成することができます。腹部と胸壁スペリオを持ち上げることによってRLY、心臓は現在公開されます。流出するとすぐに左心室に灌流針を挿入するための血液を可能にするために右心房に小さなカットを行います。基本的な水圧ポンプ（詳細については、 表1を参照）灌流ソリューションを提供することが好ましい。最初に、0.1Mリン酸と血液を洗い流す流体を明確に実行されるまで（PBS、 表3を参照）緩衝生理食塩水。次に、水圧ポンプをオフにしてすぐにPBSで希釈した4％パラホルムアルデヒドのコンテナ（PFA、 表3を参照）へのソリューション提供チューブを切り替えて固定を提供するために戻ってポンプを回します。ポンプの使用は必要ありません：実際に、PBSおよび4％PFAで満たされた2つのシリンジは徐々にソリューションを提供するために使用することができます。
- それは慎重に組織に任意の病変を導入することなく、頭蓋骨の脳を解剖することが重要です。解剖時の脳に小さな裂傷が徐々に目に見える岩の割れ目に展開されているトラップは、抗体と組織の処理（ 図2、例えば赤色のアスタリスク）の間に人為的な染色の原因となります。小脳の解剖のために、それは頭の真ん中に皮膚を切って、ゆっくり頭蓋骨を露出させるフラップを離れてからかうように典型的である。背側正中線に沿って、また横方向に頭蓋骨の両側に沿って前方へ後から頭蓋骨を切り取ります。これは小脳をニッキングの危険性を実行時にブレグマを超えて切断しないでください。鉗子を使用すると、そっと離れて髄膜に接続されている脳組織を離れて引き裂くないように注意して脳から頭蓋骨の前部を持ち上げます。脳の腹側の脳神経を切断する。
- 脳の残りの部分から小脳の分離は、2つの理由から重要です。まず、in situでの丘で、ビューから隠されている前葉における発現パターンの探査が可能になります。二つ目は小さく、孤立した領域に組織を分離するmに対してできることですいくつかのタンパク質の染色を容易にすることができる鉱石を完全に固定。この最後の解剖ステップを通して、ケアは鉗子の先端を小脳に触れないように注意する必要があります。スーペリア、下丘の中央に鉗子のペアの先端を挿入します。鉗子の2番目のセットでゆっくりと小脳から下丘を離れていじめる。次に、その前方側がダウンして直面していると脳幹が上向きになるように小脳を置きます。脳幹と小脳の小葉IX / Xの間に第四脳室に鉗子を挿入します。両側に鉗子でつまんで柄をカットして、そっと離れて脳幹から小脳を持ち上げます。小脳が分離された後、24〜48時間の最低4℃で4％PFAに浸漬することにより、それをポスト修正。小脳は、長時間の4％PFAに格納することができます。髄膜の前または発現パターンの視認性のために染色後のいずれかを削除する必要があります。実験では、小脳が処理中にニックれることを強い可能性がある染色する前に、髄膜を除去するために選択した場合。彼らは弱いバックグラウンド染色を取得し、後処理虚弱になった後見つけることが容易になるので、染色手順の最後に離れて髄膜を剥離することがはるかに簡単です。
2。 Wholemount染色のための組織を処理する
wholemount染色のアプローチは、組織切片の免疫組織化学染色よりも長い時間がかかるので、（ 表2）提供されるサンプルカレンダーに示すように各実験のためにタイムラインを計画しておくと便利です。開始する前に、心に留めておくべきいくつかの重要なものがあります。 1）組織を含むマイクロチューブは、凍結/融解プロセス中を除いて、すべての回でnutator上で回転させなければなりません。 2）いくつかのソリューションは、（溶液のレシピについては、 表3を参照）、各実験のために新鮮行わなければなりません。 3）プロトコルを通じて、ソリューションを変更したときに、優しく小脳に触れないようにではなく、鉗子で小脳を除去するよりも過ごしたソリューションを注ぐ。その後、別のコンテナに新しいソリューションを混合した後、穏やかにチューブに新鮮な溶液を追加するには、ピペットを使用しています。
2.1 1日目：
- nutatorを穏やかに揺らし6-8時間室温でデントの修正3の小脳を修正します。メタノールは、抗原を破壊するである場合は、抗原の検索メソッドを使用して2.3Aを通して2.1Aステップを置き換えることを検討してください。抗原検索のために使用される熱とバッファは、抗体の浸透のための組織を準備するのに役立ちます。
- 一晩4デントのブリーチ3ブリーチ小脳℃の
2.2 2日目：
- 30分ごとに室温で100％メタノールの2回のラウンドで小脳を脱水。
- その後、件名、ソリューションの浸透を高めるために凍結/融解サイクルを一連の組織。慎重に30分間ドライアイス凍結容器にチューブを配置します。その後、チューブを取り外し、15分のためにベンチに室温で放置します。凍結/解凍の手順を4回（少なくとも）を実行する必要があります。
- 組織の融解最後の後、一晩-80℃の冷凍庫にチューブを配置します。
- 組織は、°C、すぐに凍結/融解のステップの前または後に-80℃で長期間保存することができます。それ以外の場合、プロトコルは継続すべきである。
2.3 3日目：
- 室温で60-90分ごとに、50％MeOH/50％PBSで15％MeOH/85％PBS、100％PBS、それを洗浄することにより、小脳を再水和。
- 次に、成体マウス小脳、対象2〜3分間、PBS中の10μg/mlのプロテイナーゼKによる酵素消化に対する組織のために。全く消化ステップは、若い動物の小脳（マウスでP5または以下）のために必要ではありません。長いdigestionが大きな脳のために提案されています。例えば、消化は、霊長類の脳4の5-6分のように高くなる可能性があります。
- 消化後、すぐにプロテイナーゼKを削除するには、室温で10分間ずつPBSで3回小脳を洗う
- 4℃で一晩（ 表3を参照）PMTに組織をブロック℃、それが安価であるので、ミルクパウダーは、しばしばタンパク質の作業のためのブロッキング剤を選択する最初の選択肢であり、効果的にバックグラウンド染色を低減し、通常抗体の結合または抗原へのアクセスを妨げることはありません。実験者は追加コストを認識しておく必要があり、最初の交差反応性免疫グロブリンおよび対雑音比を最適な信号を生成する能力について血清の品質をテストする必要がありますが、動物の血清はまた、使用することができます。
2.4日4-5：
- 4℃（LARGで48時間、5％DMSOを添加した光電子増倍管で希釈した一次抗体で組織をインキュベートER小脳）が増加したインキュベーション時間が必要になります。
2.5 6日目：
- バインドされていない一次抗体を除去するために4℃で2-3時間でPMTごとに小脳に2〜3回洗浄します。
- その後、4℃、5％DMSO℃で一晩（大きな小脳が増加インキュベーション時間が必要な場合があります）とPMTを含む溶液中で二次抗体で組織をインキュベートします。
2.6 7日目：
- 4℃で2-3時間でPMTごとに小脳に2-3回を洗う
- 組織の1-2時間PBT（ 表3を参照）、最終的な洗浄を与えます。このステップでは、過剰な牛乳を除去し、染色の透明性を高めます。
- 最適な染色強度に達するまで、最後に、DAB（3,3 ' - ジアミノベンジジン）溶液中で組織をインキュベートします。褐色の反応生成物は約10分以内にはっきりと見えるはずです。光が析出する発色の原因としては、暗闇の中でDABを使用するのが最適ですバックグラウンド染色を増やすことができ、TE、。
2.7
最適な染色強度に達したときに、0.04％アジ化ナトリウムを含むPBS中で小脳を配置することによって反応を停止します。組織はこのソリューションでは、長期保存することができます。アジ化ナトリウムは、細菌増殖の強力な阻害剤であるが、それはまた、西洋ワサビペルオキシダーゼを阻害するとして、このステップまでは避けるべきである。
2.8オプションの増幅の手順：
通常のプロトコルに従うが、これらの手順は、上記の手順2.5B-2.7の代わりに実行する必要があります。
- 4℃で一晩組織をインキュベート℃、5％DMSOとPBSTでビオチン標識二次抗体のC（ 表3を参照）。
- 2〜3時間室温でPBST 3-4変化の各組織を洗浄します。
- 4℃で一晩小脳をインキュベートPBSTでABC複雑なソリューションのC。
- で2-3時間ごとに組織をすすぐPBSの3-4の変化で室温。
- 上記のように、新たに調製したDAB溶液中で組織をインキュベートします。
- 染色が最適である場合には、0.04％アジ化ナトリウムを含むPBSで小脳を洗浄することにより反応を停止します。
3。イメージング染色された組織
- Wholemount画像を使用してキャプチャすることができ、例えば、ライカDFC3000 FXカメラは、ライカアプリケーションスイートFXソフトウェアを実行しているライカMZ16 FAの実体顕微鏡に取り付けられた。必要に応じて、デコンボリューション顕微鏡は、各画像が鮮明な焦点にのみ、単一の小葉を持つことに、別の焦点面に複数の連続した画像を取得するために使用することができます。次に、画像は歪みを除去するためにレンダリングされた単一のスタックとソフトウェアに圧縮することができます。最終的な合成画像は、明確な焦点で表示されているすべてのパターニングと小脳の表面発現パターンを説明します。
- PBS（または与える別の媒体に浸漬しながらWholemount染色された組織を撮像する必要があります最適な屈折率）。簡単にイメージングのためのwholemountを配置するために、プラスチック製のシャーレに1％寒天ゲルを作る。ゲルに小さな穴をカットします。穴は、小脳が所望の向きに挟まれるようになります。
- 生データは、Adobe Photoshop CS4にインポートして、コントラストと明るさのレベルに調整されます。
動物
すべての動物実験は医学のアルバートアインシュタイン大学の制度のガイドラインに従って承認されたIACUC動物のプロトコルの下で行われた。男性と女性の非近交系スイスウェブスター（タコ、アルバニー、NY）マウス我々のコロニーで維持され、すべての試験に用いた。安楽死させた成体ラットは、親切に博士Bryenヨルダン（アルバート·アインシュタイン医科大学）によって提供されていました。すべての動物は、少なくとも1ヶ月であった。
4。代表的な結果
小脳は、4つの横のゾーンに分子の発現によって区画されています。前方のゾーン（A〜Z：〜葉IV）、中央ゾーン（CZ：〜葉VI-VII）、後方ゾーン（PZ：〜葉VIII-背IX）と結節ゾーン（NZ：〜葉IX腹とX 5）。各ゾーンには、矢状ストライプ1,2,5,6（ 図1）のユニークな配列が含まれています。プルキンエ細胞におけるZebrinII式では、AZとPZ（ 図2）とCZとNZ（ 図2）の均一な発現のストライプを明らかにする。プルキンエ細胞の矢状組織は求心性線維の末端フィールドの地形によってミラー化されます。コカインとアンフェタミン調節転写産物（CART）のペプチドは、登山繊維（ 図3a）のサブセットに発現していることが小脳皮質7（ 図3b）の分子層におけるプルキンエ細胞の樹状突起のストライプのプロジェクト。このような増幅7のような適切な変更と共に、wholemountプロトコルは旧姓なく、オリーブ小脳のパターンの可視化を可能にする染色組織切片（ 図3b）から骨の折れる、時間のかかる再構成のためのD。
図1：A. ZebrinII / aldolaseC式では、小脳の横断面における矢状バンドを明らかにする。スケールバー= 500μmである。B. ZebrinII / aldolaseCは、プルキンエ細胞の細胞体と樹状突起で排他的に発現している。スケールバー=150μmの（GL =顆粒層、PCL =プルキンエ細胞層、ML =分子層）。
図2。ZebrinII / aldolaseCが前方（AZ）、中央（CZ）、小脳の後部（PZ）のゾーンの画像にプルキンエ細胞のストライプを表示するために染色wholemount小脳。ここで我々はまた、小脳をニッキングの負の結果の例を示します。得られた人工染色が示されている赤いアスタリスク（*）である。スケールバー= 1ミリメートル（LS =単小葉、PML =傍小葉、COP =コピュラpyramidis）。
図3 A. CARTは、分子層の光ファイバ端末の登山で表されます。スケールバー= 100μmである。（ML =分子層、PCL =プルキンエ細胞層、GL =顆粒層）NZでCARTの発現B. Wholemount免疫組織化学。スケールバー= 2ミリメートル（COP =コピュラpyramidis、PML =傍小葉、PFL = paraflocculus、FL =片葉）。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
我々の開発および成人の脳内タンパク質の発現を明らかにするための多彩な免疫組織化学的アプローチを用いて成功したwholemount染色するために必要な技術的な詳細を説明してきました。このアプローチを使用することにより、複雑な分子の発現パターンを解析することができ、脳の地形は、手間と時間がかかり、組織切片の手順を必要とせずに感謝しています。
このプロトコルは、大人の1,2,8,9と早期生後マウスの小脳10,11,12の両方で、いくつかのプルキンエ細胞タンパク質発現のパターンを明らかにするために使用されています。当社独自の研究はまた、顆粒細胞抗原の発現1〜250μmの顆粒層の軟膜表面下に存在する順向性にトレースされた苔状繊維2を調べるためのwholemountアプローチの有用性を実証した。さらに、いくつかの研究は、タンパク質の正常な染色のためにオリジナルのプロトコルに変更を加えたIn個のプルキンエ細胞1,13（抗原検索）と求心性線維7,14（信号の増幅; 図2）。また、wholemount免疫組織化学染色は、複数の哺乳類の4,15の小脳および神経変性疾患18,19のマウスモデルでマップパターンプルキンエ細胞の消失に使用される鳥類の16,17種に適用され、心臓20、肺を染色するために変更されました21、脳神経22と角膜の神経23。 wholemount方法1,2の以前の説明から、現在のプロトコルの主要な出発は、ここでは組織との解剖、優れた成功のために更新された詳細の手順を使用してだけでなく、組織を固定するための完全ガイドではありませんだけを提供することである技術の深さビデオのイラスト。
wholemount染色のいくつかの制限があります。まず、表面だけのパターンが代表的な性能です。自動的さらに解剖し、染色せずに、または組織が抗体でインキュベートされている時間の長さを増大させることなく可視化。それは葉層1,2のために隠されている場合、さらに、染色は、皮質の奥深くに到達しません。しかし、wholemount染色された組織は、組織内の1,2より深い細胞の発現プロファイルを明らかにするために、同じ抗体または別のと、処理とrestained後、切片にすることができます。第二に、基本的なwholemount染色プロトコルが長いです。我々は、各実験者が実験的にそれらの抗体の染色効率を決定するとポストの固定時間を短縮し、洗浄の回数と長さを短くし、および/または一次抗体のインキュベーションの長さを短くすることをお勧めします。これらの調整とプロトコルは、かなり短い時間で完了することができます。第三に、大規模な小脳のためwholemount染色プロトコルが限定されたクオンツに高価な、そして/または、のみ利用することができます抗体溶液を大量に必要とities。しかし、-20℃で溶液を凍結することによって、各実行後に一次抗体を節約することが可能です各実験は、それが再使用される前にそれらの抗体は凍結に耐えることができるかどうかを判断する必要があります。我々は正常zebrinIIの以前に凍結アリコートを用いて組織を染色しています。第四に、すべての抗体は、基本的なwholemountのアプローチと互換性がありません。たとえば、一般的に小さな熱ショックタンパク質、HSP25の縞模様の発現を検出するために使用される抗体は、組織が 最初に抗原回復13に処理されている必要があります。かかわらず、組織切片を染色するために、トラブルシューティング、抗体 - 抗原結合には、従来の方法でもwholemount染色を最適化するために有用であることが証明されています。
我々は現在、蛍光標識二次抗体で使用するために私たちのwholemountプロトコルを適応させる可能性を模索しています。イメージの異なる色fluorop能力を備えた適切な顕微鏡低消費電力の下horesは、1つは、同じ動物に複数のプルキンエ細胞マップの組織を分析しないことができるだけでなく、プルキンエ細胞のストライプパターンと三次元のWGA-アレクサラベル求心性線維の地形との関係を調べたい2,4.7,24。さらに、大規模な遺伝子発現データベースの最近の可用性（アレン脳アトラス、Genepaint、脳遺伝子発現マップ）脳全体の分子の地形を調べるための全ゲノム解析と当社の高スループットwholemountアプローチをマージするための新しい道を開いた。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
我々は、開示することは何もありません。
Acknowledgments
RVSはイェシーバー大学のアルバート·アインシュタイン医科大学からのスタートアップ資金を新たな捜査官でサポートされています。
References
- Sillitoe, R. V., Hawkes, R. Whole-mount Immunohistochemistry: A high-throughput screen for patterning defects in the mouse cerebellum. J. Histochem. Cytochem. 50, 235-244 (2002).
- Kim, S. -H., Che, P., Chung, S. -H., Doorn, D., Hoy, M., Larouche, M., Marzban, H., Sarna, J., Zahedi, S., Hawkes, R.
- Dent, J. A., Polson, A. G., Klymkowsky, M. W. A whole-mount immunocytochemical analysis of the expression of the intermediate filament protein vimentin in Xenopus. Development. 105, 61-74 (1989).
- Sillitoe, R. V., Malz, C. R., Rockland, K., Hawkes, R. Antigenic compartmentation of the primate and tree shrew cerebellum: a common topography of zebrin II in Macaca mulatta and Tupaia belangeri. J. Anat. 204, 257-269 (2004).
- Ozol, K., Hayden, J. M., Oberdick, J., Hawkes, R. Transverse zones in the vermis of the mouse cerebellum. J. Comp. Neurol. 412, 95-111 (1999).
- Apps, R., Hawkes, R. Cerebellar cortical organization: a one-map hypothesis. Nat. Rev. Neurosci. 10, 670-681 (2009).
- Reeber, S. L., Sillitoe, R. V. Patterned expression of a cocaine- and amphetamine-regulated transcript peptide reveals complex circuit topography in the rodent cerebellar cortex. J. Comp. Neurol. 519, 1781-1796 (2011).
- Sarna, J. R., Marzban, H., Watanabe, M., Hawkes, R. Complementary stripes of phospholipase Cbeta3 and Cbeta4 expression by Purkinje cell subsets in the mouse cerebellum. J. Comp. Neurol. 496, 303-313 (2006).
- Demilly, A., Reeber, S. L., Gebre, S. A., Sillitoe, R. V. Neurofilament heavy chain expression reveals a unique parasagittal stripe topography in the mouse cerebellum. Cerebellum. 10, 409-421 (2011).
- Larouche, M., Hawkes, R. From clusters to stripes: the developmental origins of adult cerebellar compartmentation. Cerebellum. 5, 77-88 (2006).
- Marzban, H., Chung, S., Watanabe, M., Hawkes, R. Phospholipase Cbeta4 expression reveals the continuity of cerebellar topography through development. J. Comp. Neurol. 502, 857-871 (2007).
- Blank, M. C., Grinberg, I., Aryee, E., Laliberte, C., Chizhikov, V. V., Henkelman, R. M., Millen, K. J. Multiple developmental programs are altered by loss of Zic1 and Zic4 to cause Dandy-Walker malformation cerebellar pathogenesis. Development. 138, 1207-1216 (2011).
- Sawada, K., Sakata-Haga, H., Fukui, Y. Alternating array of tyrosine hydroxylase and heat shock protein 25 immunopositive Purkinje cell stripes in zebrin II-defined transverse zone of the cerebellum of rolling mouse. Nagoya. Brain Res. 1343, 46-53 (2010).
- Sawada, K., Fukui, Y., Hawkes, R. Spatial distribution of corticotropin-releasing factor immunopositive climbing fibers in the mouse cerebellum: Analysis by whole mount immunohistochemistry. Brain Res. 1222, 106-117 (2008).
- Marzban, H., Hawkes, R. On the architecture of the posterior zone of the cerebellum. Cerebellum. 10, 422-434 (2011).
- Pakan, J. M., Graham, D. J., Wylie, D. R. Organization of visual mossy fiber projections and zebrin expression in the pigeon vestibulocerebellum. J. Comp. Neurol. 518, 175-198 (2010).
- Iwaniuk, A. N., Marzban, H., Pakan, J. M., Watanabe, M., Hawkes, R., Wylie, D. R. Compartmentation of the cerebellar cortex of hummingbirds (Aves: Trochilidae) revealed by the expression of zebrin II and phospholipase C beta 4. J. Chem. Neuroanat. 37, 55-63 (2009).
- Sarna, J. R., Larouche, M., Marzban, H., Sillitoe, R. V., Rancourt, D. E., Hawkes, R. Patterned Purkinje cell degeneration in mouse models of Niemann-Pick type C disease. J. Comp. Neurol. 456, 279-291 (2003).
- Sarna, J. R., Hawkes, R. Patterned Purkinje cell loss in the ataxic sticky mouse. Eur. J. Neurosci. 34, 79-86 (2011).
- El-Bizri, N., Guignabert, C., Wang, L., Cheng, A., Stankunas, K., Chang, C. P., Mishina, Y., Rabinovitch, M. SM22alpha-targeted deletion of bone morphogenetic protein receptor 1A in mice impairs cardiac and vascular development, and influences organogenesis. Development. 135, 2981-2991 (2008).
- Mondrinos, M. J., Koutzaki, S., Lelkes, P. I., Finck, C. M. A tissue-engineered model of fetal distal lung tissue. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 293, 639-650 (2007).
- Coppola, E., Rallu, M., Richard, J., Dufour, S., Riethmacher, D., Guillemot, F., Goridis, C., Brunet, J. F. Epibranchial ganglia orchestrate the development of the cranial neurogenic crest. Proc. Nat. Acad. Sci. 107, 2066-2071 (2010).
- Kubilus, J. K., Linsenmayer, T. F. Developmental guidance of embryonic corneal innervation: roles of Semaphorin3A and Slit2. Dev. Biol. 344, 172-184 (2010).
- Reeber, S. L., Gebre, S. A., Sillitoe, R. V. Fluorescence mapping of afferent topography in three dimensions. Brain Struct. Funct. 216, 159-169 (2011).
- Davis, C. A.
