Transplantatie van pancreaseilandjes Into the Kidney Capsule van diabetische muizen
Summary
Ons protocol is ontwikkeld om zuiver en eenvoudig eilandjes of cellen te leveren onder de nier capsule van muizen. Cellen zijn geconcentreerd in pellets in de finale slangen worden gebruikt voor het transplanteren van de cellen onder de nier capsule. Het gemak van deze techniek vermindert de belasting van de cellen en de muis.
Abstract
Ons protocol is ontwikkeld om zuiver en eenvoudig eilandjes of cellen te leveren onder de nier capsule van diabetische of normale muizen. We vonden dat het gemakkelijker was om de eilandjes of cellen te concentreren in pellets in de laatste aflevering buis (PE50) gebruikt om de cellen onder de nier capsule transplantatie. Deze techniek biedt zowel snelheid en het gemak terwijl het verminderen van onnodige spanning op de cellen of met de muis.
Laden: afgewikkeld, met de hand geplukt, eilandjes of gepelletiseerd cellen worden zorgvuldig opgezogen uit de bodem van een 1,5 ml microcentrifugebuis met behulp van een P200 pipetteman en een rechte, dunne wand pipetpunt. Een lengte van PE50 slang is verbonden met de pipetpunt met een kleine adapter siliconen slang. Cellen zijn toegestaan, vestigen in de top, en vervolgens worden overgebracht naar de PE50 slang door langzaam het kiezen van het pipetteman. Nadat de cellen zijn in de buurt aan het einde van de PE50 slang, is een knik gemaakt en de siliconen adapter slang geplaatst over de knik. De PE50 slangen zijn overgebracht naar een 15 ml conische met een cut 5 ml pipet, en de PE50 slang geplakt over de rand van de 5 ml pipet om te voorkomen dat krullen tijdens het centrifugeren. Cellen zijn toegestaan om 1.000 tpm te bereiken en gestopt.
Transplantatie: Ontvanger muizen zijn verdoofd, geschoren en gereinigd. Een kleine incisie wordt gemaakt op de linkerflank van de muis en de nieren wordt blootgesteld. De nier, vet en weefsel worden vochtig gehouden met een fysiologische zoutoplossing wattenstaafje. Het distale uiteinde van de PE50 is bevestigd aan een Hamilton schroefaandrijving spuit met een pipet tip, met behulp van de siliconen-adapter slang. Een kleine nick wordt gemaakt op de rechterflank kant van de nier, niet te groot of te diep. De schuine uiteinde van de buis PE50, het dichtst bij de cellen, zorgvuldig onder de capsule, is de slang verplaatst voorzichtig om ruimte te maken, terwijl zwabberen fysiologische zoutoplossing, een droge capsule kan gemakkelijk scheuren. Een kleine luchtbel is geleverd onder de capsule door langzaam het kiezen van de spuit schroefaandrijving. Eilandjes worden dan langzaam geleverd achter de luchtbel. Zodra de eilandjes zijn geleverd nier homeostase wordt gehandhaafd en de knick is dichtgeschroeid met een laag vuur. De nier is terug geplaatst in de holte en het buikvlies en de huid worden gehecht en geniet. Muizen worden onmiddellijk behandeld met Flunixine en Buprenorfine ² en geplaatst in een kooi op een verwarmingselement.
Protocol
Discussion
Dit protocol biedt een praktische en efficiënte optie voor zuiver en eenvoudig het leveren van eilandjes of cellen onder de nier capsule van diabetische of normale muizen. De techniek van het concentreren en pelleteren de eilandjes of cellen in de uiteindelijke levering buis (PE50) gebruikt om de cellen te transplanteren in de nier capsule biedt een eenvoudige en effectieve methode van het transplanteren van cellen terwijl het verminderen van onnodige spanning op de cellen of met de muis.
Acknowledgements
UCSF Diabetes Center. NIH UCSF DERC Islet Core. JDRF. LifeScan Inc Johnson & Johnson Company.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Surgical gloves | Fisher | 11-394-95(sz) | ||
| Surgical scrub sponges | Moore medical | 42940AK | ||
| Forceps | Miltex | 6-114 and 6-26 | 2 with teeth, 2 straight | |
| Dissecting scissors n=2 | Miltex | 5-290 | ||
| Oster razor (sz. 40 blade) | Fisher | 01-305-10B | ||
| 4×4 Sterile gauze pads | Moore Medical | 08252AK | ||
| Povidone Iodine pads | Moore Medical | 08486AK | ||
| Alcohol pads | Fisher | 14-819-2 | ||
| Heating pad | Moore Medical | 42508AK | ||
| 23G or 25G needles | 1″ long | |||
| Cidex solution | Moore Medical | 07535AK | for cleaning/santizing instruments | |
| PE50 polyethylene tubing | BD | 427411 | PE50, 0.965mm O.D. x 0.58mm I.D. | |
| Cidex + 28 day soln | Moore | 35625AK | ||
| Silicone tubing | Spectrum Chromat. | 123732 | 5/32”OD x 1/32” ID | |
| Instrument sterilizing container | Moore Medical | 39074AK | ||
| Straight Pipet Tips | TipOne | 1111-0810 | sterile | |
| Glass syringe w/screw-drive | Hamilton | 1001 | ||
| Cauterizing tool | Roboz | RS230 | ||
| Needle Holder | Moore Medical | 41-067 | ||
| 5-0 silk | Look | 754B | for suture (6-C) | |
| Cotton tipped swab | Moore Medical | |||
| 9mm autoclip stapler | BD | 7630 | ||
| 9mm staples | BD | 7631 | ||
| 9mm staple remover | BD | 7637 |
References
- Tang, Q., Henriksen, K. J., Bi, M., Finger, E. B., Szot, G., Ye, J., Masteller, E. L., McDevitt, H., Bonyhadi, M., Bluestone, J. A. In vitro-expanded antigen-specific regulatory T cells suppress autoimmune diabetes. J Exp Med. 199, 1455-1465 (2004).
- Rulifson, I. C., Szot, G. L., Palmer, E., Bluestone, J. A. Inability to induce tolerance through direct antigen presentation. Am J Transplant. 2, 510-519 (2002).
- Lenschow, D. J., Zeng, Y., Hathcock, K. S., Zuckerman, L. A., Freeman, G., Thistlethwaite, J. R., Gray, G. S., Hodes, R. J., Bluestone, J. A. Inhibition of transplant rejection following treatment with anti-B7-2 and anti-B7-1 antibodies. Transplantation. Transplantation. 60, 1171-1178 (1995).
- Lenschow, D. J., Zeng, Y., Thistlethwaite, J. R., Montag, A., Brady, W., Gibson, M. G., Linsley, P. S., Bluestone, J. A. Long-term survival of xenogeneic pancreatic islet grafts induced by CTLA4lg. Science. 257, 789-792 (1992).
