Summary

Transplantatie van pancreaseilandjes Into the Kidney Capsule van diabetische muizen

Published: October 31, 2007
doi:

Summary

Ons protocol is ontwikkeld om zuiver en eenvoudig eilandjes of cellen te leveren onder de nier capsule van muizen. Cellen zijn geconcentreerd in pellets in de finale slangen worden gebruikt voor het transplanteren van de cellen onder de nier capsule. Het gemak van deze techniek vermindert de belasting van de cellen en de muis.

Abstract

Ons protocol is ontwikkeld om zuiver en eenvoudig eilandjes of cellen te leveren onder de nier capsule van diabetische of normale muizen. We vonden dat het gemakkelijker was om de eilandjes of cellen te concentreren in pellets in de laatste aflevering buis (PE50) gebruikt om de cellen onder de nier capsule transplantatie. Deze techniek biedt zowel snelheid en het gemak terwijl het verminderen van onnodige spanning op de cellen of met de muis.

Laden: afgewikkeld, met de hand geplukt, eilandjes of gepelletiseerd cellen worden zorgvuldig opgezogen uit de bodem van een 1,5 ml microcentrifugebuis met behulp van een P200 pipetteman en een rechte, dunne wand pipetpunt. Een lengte van PE50 slang is verbonden met de pipetpunt met een kleine adapter siliconen slang. Cellen zijn toegestaan, vestigen in de top, en vervolgens worden overgebracht naar de PE50 slang door langzaam het kiezen van het pipetteman. Nadat de cellen zijn in de buurt aan het einde van de PE50 slang, is een knik gemaakt en de siliconen adapter slang geplaatst over de knik. De PE50 slangen zijn overgebracht naar een 15 ml conische met een cut 5 ml pipet, en de PE50 slang geplakt over de rand van de 5 ml pipet om te voorkomen dat krullen tijdens het centrifugeren. Cellen zijn toegestaan ​​om 1.000 tpm te bereiken en gestopt.

Transplantatie: Ontvanger muizen zijn verdoofd, geschoren en gereinigd. Een kleine incisie wordt gemaakt op de linkerflank van de muis en de nieren wordt blootgesteld. De nier, vet en weefsel worden vochtig gehouden met een fysiologische zoutoplossing wattenstaafje. Het distale uiteinde van de PE50 is bevestigd aan een Hamilton schroefaandrijving spuit met een pipet tip, met behulp van de siliconen-adapter slang. Een kleine nick wordt gemaakt op de rechterflank kant van de nier, niet te groot of te diep. De schuine uiteinde van de buis PE50, het dichtst bij de cellen, zorgvuldig onder de capsule, is de slang verplaatst voorzichtig om ruimte te maken, terwijl zwabberen fysiologische zoutoplossing, een droge capsule kan gemakkelijk scheuren. Een kleine luchtbel is geleverd onder de capsule door langzaam het kiezen van de spuit schroefaandrijving. Eilandjes worden dan langzaam geleverd achter de luchtbel. Zodra de eilandjes zijn geleverd nier homeostase wordt gehandhaafd en de knick is dichtgeschroeid met een laag vuur. De nier is terug geplaatst in de holte en het buikvlies en de huid worden gehecht en geniet. Muizen worden onmiddellijk behandeld met Flunixine en Buprenorfine ² en geplaatst in een kooi op een verwarmingselement.

Protocol

Voorbereiding van de Eilandjes voor transplantatie (Tx) Onder een omgekeerde microscoop, met de hand plukken eilandjes met behulp van een P200 Pipetman en recht pipet tip van de gekweekte eilandjes in een 100mm plaat. Count eilandjes 100 per keer en overdracht in elke microcentrifugebuis (~ 500 eilandjes / buis / muis). Laat eilandjes om zich te vestigen op de bodem van de microcentrifugebuizen. Teken een eilandje pellet in een P200 Pipetman (ingesteld op 130ul) met behulp van ee…

Discussion

Dit protocol biedt een praktische en efficiënte optie voor zuiver en eenvoudig het leveren van eilandjes of cellen onder de nier capsule van diabetische of normale muizen. De techniek van het concentreren en pelleteren de eilandjes of cellen in de uiteindelijke levering buis (PE50) gebruikt om de cellen te transplanteren in de nier capsule biedt een eenvoudige en effectieve methode van het transplanteren van cellen terwijl het verminderen van onnodige spanning op de cellen of met de muis.

Acknowledgements

UCSF Diabetes Center. NIH UCSF DERC Islet Core. JDRF. LifeScan Inc Johnson & Johnson Company.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
Surgical gloves   Fisher 11-394-95(sz)  
Surgical scrub sponges   Moore medical 42940AK  
Forceps   Miltex 6-114 and 6-26 2 with teeth, 2 straight
Dissecting scissors n=2   Miltex 5-290  
Oster razor (sz. 40 blade)   Fisher 01-305-10B  
4×4 Sterile gauze pads   Moore Medical 08252AK  
Povidone Iodine pads   Moore Medical 08486AK  
Alcohol pads   Fisher 14-819-2  
Heating pad   Moore Medical 42508AK  
23G or 25G needles       1″ long
Cidex solution   Moore Medical 07535AK for cleaning/santizing instruments
PE50 polyethylene tubing   BD 427411 PE50, 0.965mm O.D. x 0.58mm I.D.
Cidex + 28 day soln   Moore 35625AK  
Silicone tubing   Spectrum Chromat. 123732 5/32”OD x 1/32” ID
Instrument sterilizing container   Moore Medical 39074AK  
Straight Pipet Tips   TipOne 1111-0810 sterile
Glass syringe w/screw-drive   Hamilton 1001  
Cauterizing tool   Roboz RS230  
Needle Holder   Moore Medical 41-067  
5-0 silk   Look 754B for suture (6-C)
Cotton tipped swab   Moore Medical    
9mm autoclip stapler   BD 7630  
9mm staples   BD 7631  
9mm staple remover   BD 7637  

References

  1. Tang, Q., Henriksen, K. J., Bi, M., Finger, E. B., Szot, G., Ye, J., Masteller, E. L., McDevitt, H., Bonyhadi, M., Bluestone, J. A. In vitro-expanded antigen-specific regulatory T cells suppress autoimmune diabetes. J Exp Med. 199, 1455-1465 (2004).
  2. Rulifson, I. C., Szot, G. L., Palmer, E., Bluestone, J. A. Inability to induce tolerance through direct antigen presentation. Am J Transplant. 2, 510-519 (2002).
  3. Lenschow, D. J., Zeng, Y., Hathcock, K. S., Zuckerman, L. A., Freeman, G., Thistlethwaite, J. R., Gray, G. S., Hodes, R. J., Bluestone, J. A. Inhibition of transplant rejection following treatment with anti-B7-2 and anti-B7-1 antibodies. Transplantation. Transplantation. 60, 1171-1178 (1995).
  4. Lenschow, D. J., Zeng, Y., Thistlethwaite, J. R., Montag, A., Brady, W., Gibson, M. G., Linsley, P. S., Bluestone, J. A. Long-term survival of xenogeneic pancreatic islet grafts induced by CTLA4lg. Science. 257, 789-792 (1992).

Play Video

Cite This Article
Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Transplantation of Pancreatic Islets Into the Kidney Capsule of Diabetic Mice. J. Vis. Exp. (9), e404, doi:10.3791/404 (2007).

View Video