Summary
우리 프로토콜이 정상적으로 쉽게 생쥐의 신장에 따라 캡슐 아일 레츠이나 세포를 제공하기 위해 개발되었습니다. 세포 신장 캡슐에서 세포를 이식에 사용되는 최종 튜브에 쥐똥에 집중되어있다. 이 기법의 용이성은 세포와 마우스에 스트레스를 줄여줍니다.
Abstract
우리 프로토콜이 정상적으로 쉽게 당뇨병이나 정상적인 생쥐의 신장에 따라 캡슐 아일 레츠이나 세포를 제공하기 위해 개발되었습니다. 우리는 신장 캡슐에서 세포를 이식하는 데 사용되는 최종 배달 튜브 (PE50)에 쥐똥에 아일 레츠이나 세포를 집중하는 것이 더 쉽습 것으로 나타났습니다. 세포 또는 마우스 어떠한 부당한 스트레스를 줄이는 한편이 기술은 속도와 편의를 모두 제공합니다.
로딩 : 해결 된거 같고, 손이 아일 레츠 또는 pelleted 세포 신중하게 p200 pipetteman와 스트레이트, 얇은 벽을 피펫 팁을 사용하여 1.5 ML의 microcentrifuge 관의 하단을 aspirated있다 골랐어요. PE50 관의 길이는 작은 실리콘 어댑터 튜브를 사용하여 피펫 팁에 첨부되어 있습니다. 세포 팁에 정착하고, 다음 천천히 pipetteman를 다이얼링하여 PE50 튜브로 전송됩니다 허용됩니다. 세포 PE50 튜브의 끝에 가까이되면, 꼬임이 만들어이며 실리콘 어댑터 튜브는 꼬임을 통해 배치됩니다. PE50 관은 15 ML 포함 원뿔 절단 5 ML의 pipet로 전송되며, PE50 튜브는 centrifuging 동안 컬링 방지하기 위해 5 ML의 pipet의 측면 지워졌을 것입니다. 전지는 1,000 RPM에 도달 허용하고 중지합니다.
이식 :받는 사람의 쥐가 anesthetized 있으며, 면도하고, 청소. 작은 절개는 마우스의 좌측에서 만들어이며 신장이 노출됩니다. 신장, 지방, 그리고 조직은 정상적인 생리와 젖은 면봉 보관됩니다. PE50의 말초 끝은 실리콘 어댑터 튜브를 사용하여, 피펫 팁을 포함, 해밀턴 스크류 드라이브 주사기에 첨부되어 있습니다. 작은 별명은 큰하거나 너무 깊이도 아니라, 신장의 오른쪽 측면 사이드에 이루어집니다. PE50 관의 beveled 끝은 세포 가까운 조심스럽게 캡슐 아래에 위치, 튜브는 정상적인 생리를 보라고하면서 공간을 만들기 위해 부드럽게 주위에 이동, 건조 캡슐 쉽게 눈물하실 수 있습니다. 작은 공기 방울이 서서히 주사기 스크류 드라이브를 다이얼링하여 캡슐에 따라 제공됩니다. 아일 레츠 그런 다음 천천히 기포 뒤에 전달됩니다. 일단 아일 레츠가 배달되었습니다 신장 항상성 유지되고 장식용은 낮은 열로 불로 지졌죠 있습니다. 신장은 구멍으로 다시 배치되고 복막과 피부 봉합하고 잘라입니다. 마우스 즉시 Flunixin와 Buprenorphine 평방 대우 및 난방 패드에있는 새장에 배치됩니다.
Protocol
이식 아일 레츠의 준비 (TX)
- 거꾸로 현미경, P200 pipetman와 100mm 접시에 교양 아일 레츠에서 바로 pipet 팁을 사용하여 직접 선택할 아일 레츠.
- 카운트는 각 microcentrifuge 관 (~ 500 아일 레츠 / 튜브 / 마우스)로 시간과 전송에 100 아일 레츠.
- 아일 레츠는 microcentrifuge 튜브의 바닥에 정착하도록 허용합니다.
- 스트레이트 얇은 벽을 pipet 팁을 사용하여 P200 pipetman (130ul에서 설정) 하나의 아일릿 펠렛을 그립니다.
- 주사기 팁 통해 실리콘 튜브 어댑터를 넣으십시오. 실리콘 어댑터에 PE50 튜브의 길이를 넣습니다.
- 팁에서 아일 레츠보다 후드 벽에 PE50 튜브 높은 후드와 테이프의 측면에 pipetman을 만요. 이것은 아일 레츠는 피펫의 팁을에 정착하실 수 있습니다.
- 천천히 끝에서 아일 레츠를 추방하지 pipetman를 다이얼링하고 PE50 튜브로 아일 레츠 이동, 조심 됨으로써 PE50 튜브로 아일 레츠를 전송합니다.
- PE50 관의 beveled 결국 꼬임을 만듭니다. 꼬임을 유지하면서, pipetman에서 실리콘 어댑터 튜브를 분리하고 실리콘 어댑터와 꼬임을 확보.
- 컷 5 ML의 pipet과 테이프 centrifuging 동안 PE50 튜브의 컬링 방지하기 위해 5 ML의 pipet의 측면을 통해 PE50 튜브와 원뿔 15 ML로, 아래로 PE50 튜브, kinked 실리콘 어댑터 튜브 측면에서 아일 레츠를 놓습니다.
- 1,000 RPM에 PE50/15mL conicals을 원심 분리기 및 원심 분리기를 끄십시오. (한 번에 10 개 이상의 아일릿 준비를 준비하지 마십시오.)
- 얼음 플레이스 튜브.
이식을 위해 마우스를 준비
- isofluorane 또는 케타민을 / Xylexene (준비 프로토콜을 참조)과 함께 생쥐를 마취.
- 마취가 영향을 찍은 후, 마우스의 왼쪽 측면을 면도.
- 면봉의 Povidone 요오드 면봉와 마우스의 피부 센터 아웃 후 ETOH 면봉로 닦아.
- 왼쪽 신장 (비장의 우측) 찾습니다. 복막을 노출, 피부에 작은 절개를합니다.
- 신장을 노출 복막의 작은 절개를합니다. 절개가 작고 유지하면 신장이 제기 및 노출 유지하는 데 도움이됩니다.
- 절개의 양면에 약간의 압력을 적용, 늘리거나 마우스의 신장을 열어.
- 목화와 함께 정상적인 생리를 적용하여 신장 촉촉한 유지 면봉 스쳐.
- 주사기 23 또는 25 게이지 바늘을 사용하여 신장 캡슐에 동전을 만드는, 신장의 오른쪽 측면에 작은 흠집을, 너무 깊거나 너무 크지는 않습니다.
아일 레츠의 이식
참고 : 마우스가 TX 준비되는 동안, 두 번째 사람은 해밀턴 나사 드라이브 아일릿 이식 주사기를 준비한다.
- 튜브의 꼬임을 유지하면서 천천히 PE50 튜브에서 실리콘 어댑터 튜브를 제거합니다.
- 실리콘 어댑터 튜브 및 장소 "스크류 드라이브를"유리 해밀턴 주사기에 부착된 피펫 팁에 실리콘 어댑터 튜브에 PE50 튜브의 반대 끝에 놓습니다. 천천히 제도가 누설되지 않도록하고, PE50 튜브의 꼬임을 풀어주고있다.
- "나사"메커니즘을 사용하여 PE50 튜브의 끝에 천천히 아일 레츠를 사전지만, PE50 튜브에있는 아일 레츠 전면에 작은 공기 방울을 유지.
- 별명은 신장에서 만들어진로, 신중하게 작은 주머니를 만드는 캡슐에서 PE50 튜빙을 슬라이드. 캡슐을 통해 신장이나 펑쳐링 가우지하지 정말 조심 해야해.
- 그것은 정상적인 생리 - Gentamycin 절어 목화 면봉을 밀고있는 지역과 캡슐 촉촉한을 유지하는 데 도움이, 건조 캡슐 쉽게 눈물 것입니다.
- 부드럽게 휴식 이식 아일 레츠위한 "주머니"를 만들어, 모든 방향으로 튜빙을 이동합니다. 지역 촉촉한 유지하는 추가적인 정상 생리을 다시 적용해야합니다.
- 마우스를 개설하고 누가, 신장 캡슐에서 마우스 및 해밀턴 이식 주사기를 준비 두 번째 사람, PE50 튜브를 삽입한 가지고있는 사람의 지시에 따라 천천히, "포켓"내부, 캡슐 아래 아일 레츠를 사전에합니다 PE50 관에 의해 전달되는 작은 기포 뒤에, 모든 아일 레츠까지 이식하고 있습니다.
- 천천히, PE50 튜브를 제거 마른 면봉으로 영역을 건조하고 신중하게 낮은 열로 닉 부식.
- 마른 면봉을 사용하면 모든 출혈이 멈추었 확인, 면봉을 밀고. 출혈이 중지되면, 무균 식염수에 신장을 다시 축축하게하다, 부드럽게 봉합하고 피부 스테이플로 마우스를 폐쇄하기 전에 복막에 신장을 교체하십시오.
휴관일 / 마우스의 리바이벌
- 5-0 실크 봉합에게 w / C - 6 19mm 바늘을 사용하여 실행 스티치로 복막을 닫습니다.
- 사용 포셉 함께 피부 절개의 양쪽 측면을 그립니다.
- 함께 2 ~ 3 스테이플 스테이플과 함께 피부.
- 목화를 사용하는 모든 혈액의 마우스의 피부를 청소 면봉과 살랑 스쳐E.
- 즉시 Flunixin 및 Buprenorphine의 피하 주사와 마우스를 취급.
- 마우스가 완전히 활성화 때까지 가열 패드 또는 아래 가열 램프에 위치 새장에 마우스를 놓습니다.
- 이주의 피부 스테이플을 제거합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
이 프로토콜은 깔끔하게 쉽게 당뇨병이나 정상적인 생쥐의 신장에 따라 캡슐 아일 레츠이나 세포를 전달하기위한 실용적이고 효율적인 옵션을 제공합니다. 신장 캡슐에서 세포를 이식하는 데 사용되는 최종 배달 튜브 (PE50)로 아일 레츠이나 세포를 집중하고 pelleting의 기술은 세포 또는 마우스 어떠한 부당한 스트레스를 줄이면서 세포를 이식의 간단하고 효과적인 방법을 제공합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
UCSF 당뇨병 센터. NIH UCSF DERC 아일릿 코어. JDRF. LIfeScan 주식 회사 존슨 앤 존슨 회사입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical gloves | Fisher Scientific | 11-394-95(sz) | |
| Surgical scrub sponges | Moore Medical | 42940AK | |
| Forceps | Miltex Inc. | 6-114 and 6-26 | 2 with teeth, 2 straight |
| Dissecting scissors n=2 | Miltex Inc. | 5-290 | |
| Oster razor (sz. 40 blade) | Fisher Scientific | 01-305-10B | |
| 4x4 Sterile gauze pads | Moore Medical | 08252AK | |
| Povidone Iodine pads | Moore Medical | 08486AK | |
| Alcohol pads | Fisher Scientific | 14-819-2 | |
| Heating pad | Moore Medical | 42508AK | |
| 23G or 25G needles | 1" long | ||
| Cidex solution | Moore Medical | 07535AK | for cleaning/santizing instruments |
| PE50 polyethylene tubing | BD Biosciences | 427411 | PE50, 0.965mm O.D. x 0.58mm I.D. |
| Cidex + 28 day soln | Moore Medical | 35625AK | |
| Silicone tubing | Spectrum Chromat. | 123732 | 5/32”OD x 1/32” ID |
| Instrument sterilizing container | Moore Medical | 39074AK | |
| Straight Pipet Tips | USA Scientific, Inc. | 1111-0810 | sterile |
| Glass syringe w/screw-drive | Hamilton Co | 1001 | |
| Cauterizing tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS230 | |
| Needle Holder | Moore Medical | 41-067 | |
| 5-0 silk | LOOK Surgical | 754B | for suture (6-C) |
| Cotton tipped swab | Moore Medical | ||
| 9mm autoclip stapler | BD Biosciences | 7630 | |
| 9mm staples | BD Biosciences | 7631 | |
| 9mm staple remover | BD Biosciences | 7637 |
References
- Tang, Q., Henriksen, K. J., Bi, M., Finger, E. B., Szot, G., Ye, J., Masteller, E. L., McDevitt, H., Bonyhadi, M., Bluestone, J. A. In vitro-expanded antigen-specific regulatory T cells suppress autoimmune diabetes. J Exp Med. 199, 1455-1465 (2004).
- Rulifson, I. C., Szot, G. L., Palmer, E., Bluestone, J. A. Inability to induce tolerance through direct antigen presentation. Am J Transplant. 2, 510-519 (2002).
- Lenschow, D. J., Zeng, Y., Hathcock, K. S., Zuckerman, L. A., Freeman, G., Thistlethwaite, J. R., Gray, G. S., Hodes, R. J., Bluestone, J. A. Inhibition of transplant rejection following treatment with anti-B7-2 and anti-B7-1 antibodies. Transplantation. Transplantation. 60, 1171-1178 (1995).
- Lenschow, D. J., Zeng, Y., Thistlethwaite, J. R., Montag, A., Brady, W., Gibson, M. G., Linsley, P. S., Bluestone, J. A. Long-term survival of xenogeneic pancreatic islet grafts induced by CTLA4lg. Science. 257, 789-792 (1992).
