Summary

Transplante de ilhotas pancreáticas para a cápsula renal de ratos diabéticos

Published: October 31, 2007
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Summary

Nosso protocolo foi desenvolvido para fornecer precisão e facilidade ilhotas ou células sob a cápsula renal de camundongos. Células estão concentradas em pelotas na tubulação final utilizada para o transplante de células sob a cápsula renal. A facilidade desta técnica reduz o estresse nas células e mouse.

Abstract

Nosso protocolo foi desenvolvido para fornecer precisão e facilidade ilhotas ou células sob a cápsula renal de ratos diabéticos ou normal. Descobrimos que era mais fácil concentrar as ilhotas ou células em pelotas na tubulação de entrega final (PE50) utilizado para o transplante de células sob a cápsula renal. Esta técnica fornece a velocidade e facilidade, reduzindo qualquer estresse para as células ou para o mouse.

Loading: Settled, escolhidos a dedo, ou células ilhotas peletizadas são cuidadosamente aspirado fora da parte inferior de um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL usando um pipetteman p200 e uma reta, de parede fina ponta da pipeta. Um comprimento de tubos PE50 está ligado à ponta da pipeta usando um tubo de pequeno adaptador silicone. Células estão autorizados a resolver, na ponta, e depois são transferidos para o tubo PE50 lentamente por marcar o pipetteman. Uma vez que as células estão perto do fim do tubo PE50, uma torção é feita eo adaptador de tubo de silicone é colocado sobre o kink. A tubulação PE50 é transferido para a 15 mL uma pipeta de corte cônico contendo 5 mL, e os tubos PE50 é gravado sobre o lado da pipeta de 5 mL para evitar curling durante a centrifugação. Células podem chegar a 1.000 rpm e parou.

Transplante: ratos são anestesiados destinatário, raspada e limpa. Uma pequena incisão é feita no flanco esquerdo do mouse e do rim está exposto. O rim, tecido adiposo, tecido e são mantidas úmidas com uma compressa de soro fisiológico. A extremidade distal do PE50 é anexado a uma seringa Hamilton movimentação do parafuso, contendo uma ponta de pipeta, usando o tubo adaptador silicone. Um nick pequeno é feito no lado do flanco direito do rim, não muito grande nem muito profundo. O fim chanfrada do tubo PE50, mais próximo das células, é cuidadosamente colocada sob a cápsula, a tubulação é movido suavemente para dar espaço ao mesmo tempo limpando soro fisiológico; uma cápsula seca pode rasgar facilmente. Uma pequena bolha de ar é fornecido sob a cápsula por lentamente marcação da unidade de rosca seringa. Ilhotas são entregues em seguida, lentamente por trás da bolha de ar. Homeostase renal uma vez que as ilhotas foram entregues é mantido e os knick é cauterizado com fogo baixo. O rim é colocado de volta na cavidade e do peritônio e da pele são suturados e grampeados. Ratos são imediatamente tratados com Flunixina quadrados e buprenorfina e colocado em uma jaula em uma almofada de aquecimento.

Protocol

Preparação de Ilhotas para Transplante (Tx) Em microscópio invertido, mão pick-ilhotas usando um Pipetman P200 e ponta da pipeta em linha reta do ilhotas cultivadas em uma placa de 100mm. Contagem de 100 ilhotas de cada vez e transferir para cada tubo de microcentrífuga (~ 500 ilhotas tubo / / mouse). Permitir ilhotas para resolver a parte inferior dos tubos de microcentrífuga. Desenhe uma das ilhotas pellet em um Pipetman P200 (fixado em 130ul) usando uma ponta da pipeta e…

Discussion

Este protocolo fornece uma opção prática e eficiente para fornecer precisão e facilidade ilhotas ou células sob a cápsula renal de ratos diabéticos ou normal. A técnica de concentração e as ilhotas de granulação ou células ao tubo de final (PE50) utilizado para o transplante de células sob a cápsula renal oferece um método fácil e eficaz de transplante de células, reduzindo qualquer estresse para as células ou para o mouse.

Acknowledgements

UCSF Diabetes Center. NIH UCSF DERC Núcleo Islet. JDRF. LifeScan Inc. Johnson & Johnson Company.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
Surgical gloves   Fisher 11-394-95(sz)  
Surgical scrub sponges   Moore medical 42940AK  
Forceps   Miltex 6-114 and 6-26 2 with teeth, 2 straight
Dissecting scissors n=2   Miltex 5-290  
Oster razor (sz. 40 blade)   Fisher 01-305-10B  
4×4 Sterile gauze pads   Moore Medical 08252AK  
Povidone Iodine pads   Moore Medical 08486AK  
Alcohol pads   Fisher 14-819-2  
Heating pad   Moore Medical 42508AK  
23G or 25G needles       1″ long
Cidex solution   Moore Medical 07535AK for cleaning/santizing instruments
PE50 polyethylene tubing   BD 427411 PE50, 0.965mm O.D. x 0.58mm I.D.
Cidex + 28 day soln   Moore 35625AK  
Silicone tubing   Spectrum Chromat. 123732 5/32”OD x 1/32” ID
Instrument sterilizing container   Moore Medical 39074AK  
Straight Pipet Tips   TipOne 1111-0810 sterile
Glass syringe w/screw-drive   Hamilton 1001  
Cauterizing tool   Roboz RS230  
Needle Holder   Moore Medical 41-067  
5-0 silk   Look 754B for suture (6-C)
Cotton tipped swab   Moore Medical    
9mm autoclip stapler   BD 7630  
9mm staples   BD 7631  
9mm staple remover   BD 7637  

References

  1. Tang, Q., Henriksen, K. J., Bi, M., Finger, E. B., Szot, G., Ye, J., Masteller, E. L., McDevitt, H., Bonyhadi, M., Bluestone, J. A. In vitro-expanded antigen-specific regulatory T cells suppress autoimmune diabetes. J Exp Med. 199, 1455-1465 (2004).
  2. Rulifson, I. C., Szot, G. L., Palmer, E., Bluestone, J. A. Inability to induce tolerance through direct antigen presentation. Am J Transplant. 2, 510-519 (2002).
  3. Lenschow, D. J., Zeng, Y., Hathcock, K. S., Zuckerman, L. A., Freeman, G., Thistlethwaite, J. R., Gray, G. S., Hodes, R. J., Bluestone, J. A. Inhibition of transplant rejection following treatment with anti-B7-2 and anti-B7-1 antibodies. Transplantation. Transplantation. 60, 1171-1178 (1995).
  4. Lenschow, D. J., Zeng, Y., Thistlethwaite, J. R., Montag, A., Brady, W., Gibson, M. G., Linsley, P. S., Bluestone, J. A. Long-term survival of xenogeneic pancreatic islet grafts induced by CTLA4lg. Science. 257, 789-792 (1992).

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Cite This Article
Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Transplantation of Pancreatic Islets Into the Kidney Capsule of Diabetic Mice. J. Vis. Exp. (9), e404, doi:10.3791/404 (2007).

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