Summary
Vår protokoll har utvecklats för att rent och enkelt leverera holmar eller celler i njuren kapsel möss. Celler är koncentrerade till pellets i den slutliga slangar som används för omplantering cellerna i njuren kapsel. Enkelheten i denna teknik minskar stressen till cellerna och musen.
Abstract
Vår protokoll har utvecklats för att rent och enkelt leverera holmar eller celler i njuren kapsel diabetiker eller normala möss. Vi fann att det var lättare att koncentrera insulinproducerande celler eller till pellets i den slutliga leveransen slangen (PE50) används för att transplantera celler i njuren kapsel. Denna teknik ger både snabbt och enkelt samtidigt som all onödig stress på cellerna eller till musen.
Laddar: Fast, plockade handen, holmar eller pelleterat celler noggrant aspirerade från botten av en 1,5 ml mikrocentrifugrör med en P200 pipetteman och en rak, tunnväggigt pipettspetsen. En längd på PE50 slangen är fäst vid pipettspetsen med en liten slang silikon adapter. Celler har rätt att bosätta sig i spetsen, och sedan överförs till PE50 slangen genom att långsamt slå pipetteman. När cellerna är nära slutet av PE50 rör, är en knut göras och silikon adaptern slangen placeras över knut. Den PE50 slangen förs över till en 15 ml E innehåller ett snitt 5 ml pipett och PE50 slangen är tejpade över den sida av 5 ml pipett för att förhindra curling under centrifugering. Celler är tillåtna för att nå 1000 rpm och stannade.
Transplantation: Mottagarens möss är sövda, rakade, och rengöras. Ett litet snitt görs på den vänstra flanken av musen och njurarna är utsatt. Njuren, fett och vävnad hålls fuktig med fysiologisk koksaltlösning provstickan. Den distala änden av PE50 är ansluten till en Hamilton skruv köra sprutan, som innehåller en pipettspets, med hjälp av slangen silikon adaptern. En liten nick görs på den högra flanken sida av njuren, inte för stora eller för djupt. Den avfasade änden av PE50 rör, närmast celler, noggrant placeras under kapseln är slangen flyttas runt försiktigt för att ge plats medan badda koksaltlösning, en torr kapsel kan riva lätt. En liten luftbubbla levereras under kapseln genom att långsamt slå kör sprutan skruven. Holmar är sedan långsamt levereras bakom luftbubbla. När holmar har levererats njure homeostas upprätthålls och Knick är flamberats med låg temperatur. Njuren placeras tillbaka in i hålrummet och bukhinna och hud är sys och häftas. Möss är omedelbart behandlas med Flunixin och Buprenorfin kvm och placeras i en bur på en värmedyna.
Protocol
Beredning av Islets för transplantation (Tx)
- Enligt ett inverterat mikroskop, handplocka holmar med en P200 pipetman och rak pipettspetsen från odlade holmar i en 100 mm platta.
- Räkna holmar 100 åt gången och överföring till varje mikrocentrifugrör (~ 500 holmar / rör / mus).
- Låt holmar att bosätta sig på botten av mikrocentrifugrör.
- Rita en holme pelleten i ett P200 pipetman (inställd på 130ul) med en rak tunnväggigt pipettspetsen.
- Placera en adapter silikonslang över sprutspetsen. Sätt en längd av PE50 slang i silikon adaptern.
- Häng pipetman vid sidan av huven och tejpa PE50 slangen till huven väggen högre än holmar i spetsen. Detta gör det möjligt holmar att bosätta sig bara i toppen av pipetten.
- Överför holmar i PE50 slangen genom att långsamt slå pipetman och flytta holmar i PE50 rör, försiktigt så att inte utvisa holmarna från slutet.
- Gör en knut i den avfasade änden av PE50 rör. Samtidigt som den knut, koppla slangen silikon adaptern från pipetman och säkra knut med silikon adaptern.
- Placera holmar i PE50 rör, snodd silikon adapter slang nedåt i en 15 ml konisk med ett snitt 5 ml pipett och tejpa PE50 slangen över den sida av 5 ml pipett för att förhindra curling av PE50 slangen medan centrifugering.
- Centrifugera PE50/15mL conicals till 1000 rpm och stänga av centrifugen. (Aldrig förbereda mer än 10 holme förberedelser på en gång).
- Placera röret på is.
Beredning av musen för transplantation
- Bedöva möss med isofluorane eller med ketamin / Xylexene (se förberedelse protokoll).
- Efter narkos har tagit påverka raka vänstra flanken av musen.
- Provtagningspinnen hud mus, center-out, med povidonjodid kompress och sedan torka av med en EtOH tops.
- Lokalisera den vänstra njuren (precis rätt mjälte). Gör ett litet snitt i huden, utsätta bukhinnan.
- Gör ett litet snitt i bukhinnan utsätta njurarna. Att hålla snittet små kommer att hjälpa till att hålla njurarna upp och utsatt.
- Applicera ett lätt tryck på båda sidor av snittet, höja eller pop njuren ur musen.
- Håll njure fuktiga genom att tillämpa normal saltlösning med bomull tippas tops.
- Med hjälp av en spruta 23 eller 25 gauge kanyl, göra en liten skrapa på den högra flanken av njuren, vilket skapar en nick i njurarna kapseln, inte för djupt eller för stort.
Transplantation av Islets
OBS: Även musen håller på att utarbetas för TX, bör den andra personen förbereda Hamilton skruv-drive spruta holme transplantation.
- Sakta ut slangen silikon adaptern från PE50 slangen samtidigt som knut på slangen.
- Placera den andra änden av PE50 rör i silikon adaptern slangen och placera silikon adaptern slangen på pipettspetsen bifogas "skruv-drive" glas Hamilton spruta. Sakta släppa knut i PE50 slangen, och se till att öarna inte läcka ut.
- Advance holmarna långsamt till toppen av PE50 rör med "skruv" mekanismen, men behålla en liten luftbubbla i framsidan av holmar i PE50 slangen.
- Into the nick gjorde i njuren, skjut försiktigt PE50 slangen i kapseln, vilket gör en liten ficka. Var mycket noga med att inte trycka ut njurarna eller punktera genom kapseln.
- Det hjälper till att hålla området och kapsel fuktigt med vanlig koksaltlösning-Gentamycin indränkt bomull tippas tops, en torr kapsel kommer att riva lätt.
- Rör försiktigt slangen i alla riktningar, vilket skapar en "ficka" för transplantation av insulinproducerande att vila. Kom ihåg att ansöka på nytt ytterligare fysiologisk koksaltlösning för att hålla området fuktigt.
- Under ledning av den person som har öppnat musen och vem som har placerat PE50 slangen under njure kapseln, den andra personen, som utarbetat musen och Hamilton transplantation spruta, kommer långsamt förväg skär i kapseln, inne i "fickan", bakom en liten luftbubbla som levererats av PE50 slang, är tills alla holmar transplanterade.
- Sakta ut PE50 rör, torka området med en torr tops och försiktigt bränna bort de nick med låg temperatur.
- Använd en torr bomull tippas tops, se till att alla har slutat blöda. När blödningen har slutat, åter fukta njurarna med steril koksaltlösning, och försiktigt byta ut njuren i bukhinnan före stängning musen med suturen och häftklammer hud.
Stängning / Revival av Mouse
- Stäng bukhinnan med en rakstygn med 5-0 siden suturer W / A C-6 19mm nål.
- Använd pincett dra båda sidor av huden snittet tillsammans.
- Häfta ihop huden med 2 eller 3 häftklamrar.
- Rengör huden på möss av något blod, med hjälp av ett bomull tippas tops och Saline.
- Omedelbart behandla musen med en subkutan injektion av Flunixin och buprenorfin.
- Placera musen i en bur, som är placerad på en värmedyna eller under en värme lampa, tills musen är fullt aktiv.
- Ta bort skinnet häftklammer i 2 veckor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll ger ett praktiskt och effektivt alternativ för snyggt och enkelt leverera holmar eller celler i njuren kapsel diabetiker eller normala möss. Tekniken att koncentrera och pelletering av insulinproducerande celler eller i den slutliga leveransen slangen (PE50) används för att transplantera celler i njurarna kapsel erbjuder en enkel och effektiv metod att transplantera celler samtidigt som all onödig stress på cellerna eller till musen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
UCSF Diabetes Center. NIH UCSF DERC Islet Core. JDRF. LifeScan Inc. Johnson & Johnson-företag.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical gloves | Fisher Scientific | 11-394-95(sz) | |
| Surgical scrub sponges | Moore Medical | 42940AK | |
| Forceps | Miltex Inc. | 6-114 and 6-26 | 2 with teeth, 2 straight |
| Dissecting scissors n=2 | Miltex Inc. | 5-290 | |
| Oster razor (sz. 40 blade) | Fisher Scientific | 01-305-10B | |
| 4x4 Sterile gauze pads | Moore Medical | 08252AK | |
| Povidone Iodine pads | Moore Medical | 08486AK | |
| Alcohol pads | Fisher Scientific | 14-819-2 | |
| Heating pad | Moore Medical | 42508AK | |
| 23G or 25G needles | 1" long | ||
| Cidex solution | Moore Medical | 07535AK | for cleaning/santizing instruments |
| PE50 polyethylene tubing | BD Biosciences | 427411 | PE50, 0.965mm O.D. x 0.58mm I.D. |
| Cidex + 28 day soln | Moore Medical | 35625AK | |
| Silicone tubing | Spectrum Chromat. | 123732 | 5/32”OD x 1/32” ID |
| Instrument sterilizing container | Moore Medical | 39074AK | |
| Straight Pipet Tips | USA Scientific, Inc. | 1111-0810 | sterile |
| Glass syringe w/screw-drive | Hamilton Co | 1001 | |
| Cauterizing tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS230 | |
| Needle Holder | Moore Medical | 41-067 | |
| 5-0 silk | LOOK Surgical | 754B | for suture (6-C) |
| Cotton tipped swab | Moore Medical | ||
| 9mm autoclip stapler | BD Biosciences | 7630 | |
| 9mm staples | BD Biosciences | 7631 | |
| 9mm staple remover | BD Biosciences | 7637 |
References
- Tang, Q., Henriksen, K. J., Bi, M., Finger, E. B., Szot, G., Ye, J., Masteller, E. L., McDevitt, H., Bonyhadi, M., Bluestone, J. A. In vitro-expanded antigen-specific regulatory T cells suppress autoimmune diabetes. J Exp Med. 199, 1455-1465 (2004).
- Rulifson, I. C., Szot, G. L., Palmer, E., Bluestone, J. A. Inability to induce tolerance through direct antigen presentation. Am J Transplant. 2, 510-519 (2002).
- Lenschow, D. J., Zeng, Y., Hathcock, K. S., Zuckerman, L. A., Freeman, G., Thistlethwaite, J. R., Gray, G. S., Hodes, R. J., Bluestone, J. A. Inhibition of transplant rejection following treatment with anti-B7-2 and anti-B7-1 antibodies. Transplantation. Transplantation. 60, 1171-1178 (1995).
- Lenschow, D. J., Zeng, Y., Thistlethwaite, J. R., Montag, A., Brady, W., Gibson, M. G., Linsley, P. S., Bluestone, J. A. Long-term survival of xenogeneic pancreatic islet grafts induced by CTLA4lg. Science. 257, 789-792 (1992).
