Summary

Diyabetik Fare Böbrek Kapsül içine, Pankreas Islets Nakli

Published: October 31, 2007
doi:

Summary

Protokolü, temiz ve kolay bir adacık veya hücreleri farelerin böbrek kapsülü altında sunmak için geliştirildi. Hücreler, böbrek kapsül altında hücrelerinin nakli için kullanılan son tüp pelet içine yoğunlaşmıştır. Bu tekniğin kolaylığı hücreleri ve fare stresi azaltır.

Abstract

Protokolü, temiz ve kolay bir şekilde diyabetik veya normal farelerin böbrek kapsülü altında adacıklar veya hücreleri sunmak için geliştirildi. Biz böbrek kapsülü altında hücre nakli için kullanılan son teslim boru (PE50) pelet içine adacıklar veya hücrelerin konsantre kolay olduğu bulundu. Bu teknik, hücrelere ya da fare herhangi bir aşırı stres azaltırken hem hız ve kolaylık sağlar.

Yükleme: oturanlar, el adacıklar veya tohum hücreleri dikkatle P200 pipetteman ve düz, ince duvar pipet kullanarak 1,5 mL mikrosantrifüj tüp alt aspire, aldı. PE50 boru uzunluğu, küçük bir silikon adaptörü tüp kullanarak pipet ucu takılır. Hücreler ucu, yerleşmeye ve sonra yavaş yavaş pipetteman arama PE50 boru aktarılır izin verilir. PE50 boru sonuna yakın hücrelerin sonra, bir bükülme yapılır ve silikon adaptör boru kink üzerine yerleştirilir. PE50 tüp 15 ml içeren konik bir kesim 5 ml pipetlemeyin aktarılır ve PE50 tüp santrifüj sırasında kıvrık önlemek için 5 ml pipetlemeyin yan üzerinde bantlanmış. Hücreler 1.000 rpm ulaşmak için izin ve durdu.

Nakli: Alıcı fareler anestezi, traş ve temizlenmelidir. Farenin sol kanadında küçük bir kesi yapılır ve böbrek maruz kalmaktadır. Böbrek, yağ ve doku normal tuzlu çubukla nemli tutulmalıdır. PE50 distal ucu silikon adaptörü boru kullanarak, pipet içeren, Hamilton vidalı tahrik şırınga eklenir. Küçük bir nick çok büyük ne de çok derin değil, böbrek sağ kanadında yan üzerinde yapılır. PE50 boru kesik uç, hücrelerin en yakın dikkatle kapsül altına yerleştirilir, tüp normal salin sürüntü sırasında yer açmak için hafifçe dolaştı; kuru bir kapsülü kolayca yırtılabilir. Kapsül altında küçük bir hava kabarcığı, yavaş yavaş şırınga vida sürücü arama tarafından teslim edilir. Adacıklar sonra yavaş yavaş hava kabarcığı arkasında teslim edilir. Adacıklar teslim edilmiştir böbrek homeostazı korunur ve ıvır düşük ısı ile koterize. Böbrek boşluğuna yerleştirilir ve periton ve cilt sütüre ve zımbalanmış. Fare hemen Flunixin ve Buprenorfin ² ile tedavi edilen ve bir ısıtma yastığı bir kafes yerleştirilir.

Protocol

Nakli için Islets hazırlanması (Tx) Inverted mikroskop altında, P200 Pipetman ve 100mm plaka kültür adacıkları düz pipetlemeyin ucu kullanarak el almak adacıklar. Kont, her mikrosantrifüj tüp (~ 500 adacık / tüp / fare) bir zaman ve transfer 100 adacık. Adacıklar mikrosantrifüj tüplerin altına yerleşmek için izin ver. Düz bir ince duvar pipetlemeyin ucunu kullanarak P200 Pipetman (130ul ayarlanır) içine bir adacık pelet çizin. Şırınga ucu ü…

Discussion

Bu protokol, temiz ve kolay bir şekilde diyabetik veya normal farelerin böbrek kapsülü altında adacıklar veya hücreleri sunmak için pratik ve etkili bir seçenek sunmaktadır. Hücrelere herhangi bir aşırı stres ya da fare azaltırken hücrelerin nakli, böbrek kapsül altında hücre nakli için kullanılan son teslim boru (PE50) adacıklar veya hücreleri zenginleştirme ve peletleme tekniği kolay ve etkili bir yöntem sunmaktadır.

Acknowledgements

UCSF Diyabet Merkezi. NIH UCSF DERC Islet Core. JDRF. LIFESCAN A.Ş. Johnson & Johnson Company.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
Surgical gloves   Fisher 11-394-95(sz)  
Surgical scrub sponges   Moore medical 42940AK  
Forceps   Miltex 6-114 and 6-26 2 with teeth, 2 straight
Dissecting scissors n=2   Miltex 5-290  
Oster razor (sz. 40 blade)   Fisher 01-305-10B  
4×4 Sterile gauze pads   Moore Medical 08252AK  
Povidone Iodine pads   Moore Medical 08486AK  
Alcohol pads   Fisher 14-819-2  
Heating pad   Moore Medical 42508AK  
23G or 25G needles       1″ long
Cidex solution   Moore Medical 07535AK for cleaning/santizing instruments
PE50 polyethylene tubing   BD 427411 PE50, 0.965mm O.D. x 0.58mm I.D.
Cidex + 28 day soln   Moore 35625AK  
Silicone tubing   Spectrum Chromat. 123732 5/32”OD x 1/32” ID
Instrument sterilizing container   Moore Medical 39074AK  
Straight Pipet Tips   TipOne 1111-0810 sterile
Glass syringe w/screw-drive   Hamilton 1001  
Cauterizing tool   Roboz RS230  
Needle Holder   Moore Medical 41-067  
5-0 silk   Look 754B for suture (6-C)
Cotton tipped swab   Moore Medical    
9mm autoclip stapler   BD 7630  
9mm staples   BD 7631  
9mm staple remover   BD 7637  

References

  1. Tang, Q., Henriksen, K. J., Bi, M., Finger, E. B., Szot, G., Ye, J., Masteller, E. L., McDevitt, H., Bonyhadi, M., Bluestone, J. A. In vitro-expanded antigen-specific regulatory T cells suppress autoimmune diabetes. J Exp Med. 199, 1455-1465 (2004).
  2. Rulifson, I. C., Szot, G. L., Palmer, E., Bluestone, J. A. Inability to induce tolerance through direct antigen presentation. Am J Transplant. 2, 510-519 (2002).
  3. Lenschow, D. J., Zeng, Y., Hathcock, K. S., Zuckerman, L. A., Freeman, G., Thistlethwaite, J. R., Gray, G. S., Hodes, R. J., Bluestone, J. A. Inhibition of transplant rejection following treatment with anti-B7-2 and anti-B7-1 antibodies. Transplantation. Transplantation. 60, 1171-1178 (1995).
  4. Lenschow, D. J., Zeng, Y., Thistlethwaite, J. R., Montag, A., Brady, W., Gibson, M. G., Linsley, P. S., Bluestone, J. A. Long-term survival of xenogeneic pancreatic islet grafts induced by CTLA4lg. Science. 257, 789-792 (1992).

Play Video

Cite This Article
Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Transplantation of Pancreatic Islets Into the Kidney Capsule of Diabetic Mice. J. Vis. Exp. (9), e404, doi:10.3791/404 (2007).

View Video