Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Zebrafish लार्वा में गैर इनवेसिव कैंडिडिआसिस फैलाया इमेजिंग

Published: July 30, 2012 doi: 10.3791/4051
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular and Biomedical Sciences, University of Maine

Summary

तेजी से विकास, छोटे आकार और zebrafish की पारदर्शिता सहज प्रतिरक्षा संक्रमण के नियंत्रण के अध्ययन के लिए काफी लाभ कर रहे हैं

Protocol

संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) प्रोटोकॉल A2009-11-01 के तहत सभी zebrafish देखभाल प्रोटोकॉल और प्रयोगों प्रदर्शन किया गया.

1. Morpholino और लारवल इंजेक्शन व्यंजन

प्रायोगिक अवधि: * (10-15 मिनट)

कठिनाई के डिग्री: *

  1. अंडा इंजेक्शन के लिए बाँझ पानी और माइक्रोवेव में 2% agarose समाधान तैयार. जब समाधान एक अतिरिक्त गहरी पेट्री डिश (फिशर साइंटिफिक) में इसके बारे में कुछ डालना ठंडा है जब तक यह आधा भरा है. बर्फ पर शांत और यकीन है कि प्लेट स्तर है.
  2. एक बार पकवान ठंडा है, एक 15 एमएल agarose 2% के ऊपर परत डालना. एक अंडा एक स्प्रे बोतल से बाँझ पानी के साथ प्लास्टिक मोल्ड (अनुकूली विज्ञान उपकरण) अंडाकार इंजेक्शन स्प्रे. ध्यान से गर्म agarose में ढालना नाली पक्ष नीचे जगह है. जब agarose ठंडा है, एक धातु फ्लैट रंग का उपयोग करें (VWR वैज्ञानिक) आगा से मोल्ड अलग कर देनागुलाब. धीरे धीरे agarose से ग्रिड को हटा दें. लपेटें भ्रूण Parafilm में इंजेक्शन व्यंजन (VWR वैज्ञानिक) और दुकान 4 डिग्री सेल्सियस पर औंधा
  3. मछली लार्वा इंजेक्शन के लिए, एक 2% agarose के रूप में वर्णित समाधान तैयार. एक मानक आकार पेट्री डिश (VWR वैज्ञानिक) में समाधान डालो और जब तक यह solidifies, अलग सेट. लपेटें लार्वा इंजेक्शन व्यंजन Parafilm और दुकान में 4 डिग्री सेल्सियस पर औंधा

2. फफूंद संस्कृति तैयार

प्रायोगिक अवधि: ** (30 मिनट)

कठिनाई के डिग्री: **

  1. खमीर तैयार (YPD) निकालने peptone द्रक्षौज अगर प्लेट: 10 ग्राम / लीटर खमीर निकालने, 20 ग्राम / लीटर peptone, 20 ग्राम / लीटर dextrose, और 20 आटोक्लेव और में अगर ग्राम / लीटर है. YPD तरल के लिए 10 ग्राम / लीटर खमीर निकालने, 20 ग्राम / लीटर peptone, 20 ग्राम / लीटर द्रक्षौज और 121 में आटोक्लेव 20-30 मिनट डिग्री सेल्सियस तैयार
  2. दो मछली संक्रमण के पहले दिन जमी से एक लकीर की थाली तैयारYPD अगर पर Candida albicans के संस्कृतियों की स्टॉक एकल कालोनियों के प्राप्त करने के लिए.
  3. 37 ° रात भर सी सेते हैं.
  4. 16 x 150 मिमी संस्कृति ट्यूब (VWR वैज्ञानिक) में 5 एमएल YPD शोरबा रखो.
  5. मछली संक्रमण से पहले दिन एक लकड़ी dowel (VWR साइंटिफिक) के साथ YPD अगर एक छोटी सी कॉलोनी लेने. संस्कृति ट्यूब और ज़ुल्फ़ में YPD तरल में फिर से निलंबित कॉलोनी के आसपास छड़ी रखो.
  6. 37 ° C पर टीसी-7 टिशू कल्चर रोलर एक परीक्षण 14 इंच ट्यूब पहिया (नई ब्राउनश्विक वैज्ञानिक) के साथ सुसज्जित ड्रम पर रातोंरात आगे बढ़ें.
  7. अगले दिन, एक 1.7 एमएल ट्यूब (Axygen) के में 1 मिनट के लिए संस्कृति की 1 एमएल स्पिन 14000x जी. निकालें सतह पर तैरनेवाला और अवशिष्ट तरल VWR वैज्ञानिक vortexing में द्वारा गोली resuspend के हैं.
  8. 1 एमएल 1x फास्फेट जोड़ें खारा (VWR वैज्ञानिक) बफर और स्पिन के रूप में पहले से वर्णित है.
  9. पीबीएस धोने 3 बार दोहराएँ.
  10. 1x पीबीएस में 1:100 (990 μL 1x पी में 10 μL धोया सी. albicans के कमजोर पड़ने पतला) बी एस.
  11. एक Hemocytometer VWR वैज्ञानिक पर भरोसा रखो.
  12. 10 7 कोशिकाओं / एमएल पतला.

3. Zebrafish संक्रमण

प्रायोगिक अवधि: **** (1-3 घंटे)

कठिनाई के डिग्री: ****

  1. धारा 5 और अंडे पानी में दुकान, 60 मिलीग्राम / एल बाँझ विआयनीकृत पानी में तत्काल सागर लवण (फिशर साइंटिफिक) के अनुसार भ्रूण लीजिए.
  2. ओलिंप ओलिंप () SZ61, संक्रमण दिन dechorionate भ्रूण के रूप में एक विदारक माइक्रोस्कोप का उपयोग करना. चिप्स का एक पैकेट खोलने, या जरायु में बंद की स्थिति में धीरे चिमटी प्रहार और फिर धीरे से उन्हें खोलने की तरह 27 जरायु अलग खींच Dumont Dumoxel चिमटी (VWR वैज्ञानिक) का उपयोग करें. मछली सही में जरायु के बाहर पॉप चाहिए.
  3. अतिरिक्त गहरी पेट्री डिश भंवर पकवान की केंद्र में मछली चाल पर ढक्कन के साथ. मछली पकवान की ढकने के लिए स्थानांतरण. अंडे का पानी निकालें औरताजा मीडिया के साथ की जगह. मीडिया को मछली जोड़ें.
  4. गर्म लार्वा पर 28 एक मशीन में इंजेक्शन व्यंजन डिग्री सेल्सियस Tricaine मीथेन (पश्चिमी रासायनिक इंक) 200 / μg मछली anesthetizing के लिए एमएल कमजोर पड़ने सल्फ़ोनेट तैयार.
  5. बाहर संक्रमण (20-50 मछली) के लार्वा की वांछित संख्या गिनती. Tricaine मीथेन सल्फ़ोनेट समाधान में मछली रखो और 1-2 मिनट तक प्रतीक्षा करें जब तक वे आगे बढ़ बंद करो.
  6. MPPI - 3 इंजेक्शन इकाई (एप्लाइड वैज्ञानिक उपकरण) पर बारी. सुनिश्चित करें कि दबाव स्विच पर "पल्स" है और "स्पंद अवधि" 3 backpressure इकाई के लिए साई के साथ 9 के लिए सेट कर दिया जाता है. नाइट्रोजन टैंक वाल्व खोलें जब तक इंजेक्शन इकाई पर दबाव 30 साई पढ़ता है.
  7. लोड और 1x10 7 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता में 5 μL vortexed Candida albicans के साथ एक खींच 28 micropipette. Micropipette धारक (एप्लाइड वैज्ञानिक उपकरण) में micropipette रखें. पानी के साथ एक खाली अतिरिक्त गहरी पेट्री डिश भरें. मैं micropipette टिप तक ले जाएँदेखने के भीतर बस खुर्दबीन और उपयोग Dumont Dumoxel चिमटी (VWR वैज्ञानिक) विदारक खींच पिपेट की नोक से 3mm के बारे में सुई क्लिप के माध्यम से पानी की सतह को छू.
  8. प्रेस पैर (एप्लाइड वैज्ञानिक उपकरण) स्विच करने के लिए सुई काटा गया है सत्यापित. तुम देखना चाहिए फैलाने के तरल अगर आप सफल थे. तरल सांस की व्यास रस्मी 25 zebrafish लार्वा की पुतली (0.21 मिमी, 4.9 nl की मात्रा में एक क्षेत्र उपज) के व्यास से भी बड़ा होना चाहिए. दबाव समायोजित तदनुसार अगर तरल सांस में बहुत बड़ी या बहुत छोटी है.
  9. Tricaine मीथेन सल्फ़ोनेट में मछली (200 / μg एमएल) चतनाशून्य करना. एक बार मछली चलती ज़ुल्फ़, जब तक मछली केंद्र में हैं पर ढक्कन के साथ पकवान बंद कर दिया है. 50 हस्तांतरण विंदुक (फिशर साइंटिफिक) का उपयोग कर मछली लीजिए. टिप की ओर मछली व्यवस्थित पिपेट की ओर ठोकर. धीरे लार्वा agarose थोड़ा तरल के रूप में संभव के रूप में प्रयोग पकवान पर मछली विंदुक.
  10. एक चिकनी ग्लास रॉड (उन्हें कुचलने के लिए नहीं सावधान रहना होगा!) के साथ मछली लाइन. पकवान की संभव बंद के रूप में अधिक तरल के रूप में महाप्राण (व्यंजन). दूर किसी भी नमी बाती एक KimWipe का उपयोग करें.
  11. खुर्दबीन के नीचे मछली के साथ लार्वा agarose पकवान स्थिति जब तक आप और एक ही समय में सुई मछली की एक अच्छा विचार हो. गिलास सुई मछली की ओर ले जाएँ. दोनों मछली और सुई पर में ज़ूम के रूप में आप मछली की ओर सुई की स्थिति. ध्यान से कान का 27 पुटिका, पहली मछली के 29 (कान) में कांच सुई चाल. आप एक बार तुम मछली में सुई चला गया है पता है क्योंकि जब आप पैर स्विच (वैज्ञानिक उपकरण एप्लाइड) धक्का, hindbrain निलय को थोड़ा उठा लूँगा.
  12. प्रेस पैर स्विच (एप्लाइड वैज्ञानिक उपकरण) और तरल मछली के hindbrain 27 निलय अंदर फैलाने देखो. मछली और कदम से अगले मछली सुई वापस लेना. प्रक्रिया दोहराएँ जब तक आप थाली पर मछली के सभी इंजेक्शन है. किसी भी घ निकालेंead मछली और प्रतिस्थापन इंजेक्षन करने के लिए सही संख्या (50 मछली) रखने के लिए. 50 मछली के प्रत्येक समूह के लिए एक नया microinjection सुई इंजेक्शन तैयार किया जाना चाहिए, या सी. श्वेत सुई के नीचे बैठती है और यह मोज़री, या इंजेक्शन एकाग्रता फेंकता है.
  13. मछली पकवान angling और मछली पर एक साफ अतिरिक्त गहरी पेट्री 60 एमएल अंडे पानी युक्त डिश में अंडे पानी छिड़काव द्वारा पकवान की धो बंद. यह महत्वपूर्ण है agarose पर अब से 15-20 मिनट के लिए मछली नहीं छोड़ या वे बाहर सूखी और मर जाएगा.
  14. पूरे इंजेक्शन प्रक्रिया को दोहराएँ जब तक समाप्त हो. पीबीएस और गैर रोगजनक इंजेक्शन नियंत्रण नहीं भूल जाते हैं.
  15. जब समाप्त हो, पर 28 मछली रखने डिग्री सेल्सियस
  16. नाइट्रोजन टैंक वाल्व बंद करें. "निरंतर" से "नाड़ी" इंजेक्शन यूनिट स्विच ले जाएँ टैंक लाइन में दबाव को राहत देने के दबाव में इस बिंदु पर शून्य करने के लिए छोड़ देना चाहिए. इंजेक्शन इकाई "पल्स" करने के लिए स्विच. इंजेक्शन इकाई बंद करें और कार्य क्षेत्र को साफ.
    17. 4. इमेजिंग के लिए मछली की तैयारी

    प्रायोगिक अवधि: ** (30 मिनट)

    कठिनाई के डिग्री: **

    1. पहले (200 / μg एमएल) के रूप tricaine मीथेन सल्फ़ोनेट समाधान तैयार करें. संक्रमित मछली, और उन्हें tricaine में स्थानांतरित.
    2. अंडे पानी में 47.9 एमएल 0.4% कम पिघल agarose (VWR वैज्ञानिक) तैयार करें. Microwaving द्वारा समाधान गर्मी. 37 शांत डिग्री सेल्सियस और ऐड tricaine मीथेन का मिश्रण करने के लिए सल्फ़ोनेट (200 / μg एमएल)
    3. एक बार मछली tricaine मीथेन सल्फ़ोनेट, विंदुक एक पेट्री डिश (VWR वैज्ञानिक) 0.4% कम पिघल agarose (VWR वैज्ञानिक) से युक्त में व्यक्तिगत मछली में स्थिर कर रहे हैं.
    4. अगला, इमेजिंग के लिए एक गिलास नीचे पकवान (MatTek निगम) के अलग - अलग कुओं में कम पिघल agarose से मछली चाल. थोड़ा कम पिघल agarose के रूप में संभव के रूप में प्रयोग करें ताकि मछली डिश के तल पर फ्लैट झूठ. केवल tricaine - agarose के लिए पर्याप्त में भरने का उपयोग करने के लिएगिलास नीचे पकवान की नेर हलकों.

    5. प्रोटोकॉल जौव के लिए संबंधित संशोधन

    Microinjection के लिए micropipettes

    प्रायोगिक अवधि: * (10-15 मिनट)

    कठिनाई के डिग्री: *

    1. खोखले गिलास BF120 69 10 छड़ (Sutter उपकरण) एक ज्वलंत ब्राउन micropipette खींचने P-97 मॉडल (Sutter उपकरण) युआन एट अल के अनुसार 30. का उपयोग खींचो. निम्नलिखित शर्तों हीट = 470 वेग, = 120 का समय = 200 के साथ # 7 प्रोग्राम चुनें. परिणामस्वरूप सुई 8 उठाव से टिप मिमी और, एक बार टिप यह लगभग 10 माइक्रोन का एक व्यास के ऊपर 3 मिमी पर काटा गया है.
    2. कोष्ठक में एक गिलास micropipette लोड. का चयन करें "खींचो. हीटिंग रेशा कार्यक्रम मापदंडों और गिलास छड़ी खींचा दो micropipettes में अलग कर देगा अनुसार सुई गर्मी होगी. एक विंदुक भंडारण बॉक्स (Sutt में स्टोर micropipettesएर यंत्र).

    भ्रूण संग्रह, morpholino इंजेक्शन और रखरखाव

    प्रायोगिक अवधि: *** घंटे (1-2)

    कठिनाई के डिग्री: ***

    1. रोजेन एट अल 31. के तरीके के अनुसार भ्रूण लीजिए. Spawning टैंक (जलीय निवास) से अंडे एकत्र की एक प्लास्टिक चलनी (Knutsford का माल) का प्रयोग करें. चलनी उल्टा और एक अतिरिक्त गहरी पेट्री डिश पर पकड़ टैंक पानी से कुल्ला करने के लिए अंडे इकट्ठा.
    2. इस morpholino तैयारी के लिए 300 morpholino की nanomoles (GeneTools, LLC) 300 μL बाँझ पानी जोड़ें. यह 1.0 मिमी की एक काम शेयर देता है.
    3. Morpholino की एकाग्रता एक Nanodrop (थर्मो वैज्ञानिक) का उपयोग करके सत्यापित करें. "Nucleic एसिड और नमूना प्रकार बदलने के लिए" का चयन करें अन्य "तरंगदैर्य और 265 1000 से morpholino की आणविक भार absorptivit द्वारा विभाजित गुणा करके लगातार दर्ज करें.y के गुणांक morpholino oligo संपत्ति शीट में सूचीबद्ध है.
    4. 2 μL 0.1 एन एचसीएल के साथ रिक्त nanodrop. 0.1 एन एचसीएल (20x मन्दन) के 95 μL में morpholino समाधान के 5 μL पतला. Nanodrop कुरसी पर क्लिक करें और उपाय पर कमजोर पड़ने के 2 μL रखें. कमजोर पड़ने कारक (20) द्वारा एकाग्रता गुणा. इस morpholino की एकाग्रता काम कर देता है. Millimolar एकाग्रता की गणना के morpholino की आणविक वजन से प्राप्त एकाग्रता विभाजित करते हैं.
    5. तैयार में morpholino Danieau बफर (58 मिमी NaCl, 0.7 मिमी KCl, 0.4 मिमी 4 MgSO, 0.6 मिमी (3) Ca 2, 5.0 मिमी HEPES, 7.6 पीएच) और 0.01% phenol के लाल (VWR वैज्ञानिक) के शेयर एक काम.
    6. रोजेन एट 31. अल और युआन एट अल. 30 के अनुसार morpholino इंजेक्शन काम के लिए प्रोटोकॉल का पालन करें. अंडा - पानी और गर्म के साथ morpholino इंजेक्शन व्यंजन 28 ° सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए कुल्ला. इंजेक्शन व्यंजन और लाइन अप एक ग से पानी निकालेंपक्ष हस्तांतरण विंदुक के साथ इंजेक्शन पकवान (धारा 1 से तैयार) के grooves में मंच भ्रूण. हर प्लेट में लगभग 250 अंडे का आयोजन करेगा. Morpholino साथ 1-2 सेल मंच भ्रूण इंजेक्षन. अंडे 15 27 मिनट के लिए एक सेल चरण में रहेगा.
    7. अतिरिक्त गहरी पेट्री डिश में 60 एमएल अंडे पानी में अंडे पानी के इंजेक्शन के साथ अंडे जब समाप्त (60 मिलीग्राम / एल तुरंत महासागर नमक के साथ बाँझ विआयनीकृत पानी) और जगह कुल्ला. Morpholino इंजेक्शन व्यंजन reused किया जा सकता है. अंडे पानी से कुल्ला जब समाप्त की दुकान और डिग्री सेल्सियस 4 में औंधा
    8. भ्रूण के भंडारण के लिए 60 एमएल अंडे पानी के लिए पकवान जोड़ें. 60 एमएल अंडे पानी के साथ एक हस्तांतरण विंदुक के साथ 110 भ्रूण अलग अतिरिक्त गहरी पेट्री डिश में गिनती. 0.००००३% नीले methylene जोड़ें 28 माइक्रोबियल विकास और सेते हैं भ्रूण को रोकने डिग्री सेल्सियस
    9. भ्रूण के विकास में तेजी लाने के 24 घंटे और चरण के लिए 33 ° C पर भ्रूण Kimmel एट अल. 27 के अनुसार बर्तन रखने के लिए, भ्रूण को एक सिर के लिए विकसित करने के लिए अनुमति देता है75 के ट्रंक ° कोण (रस्मी 25 27 चरण).
    10. लार्वा संक्रमण काम के लिए 28 ° सी में सी. के साथ इंजेक्शन के बाद भ्रूण रखना albicans.
    11. प्रत्येक दिन 60 एमएल ताजा अंडा - पानी के साथ भ्रूण बर्तन की जगह.

    इमेजिंग

    प्रायोगिक अवधि: ***** (1-5 घंटे)

    कठिनाई के डिग्री: ***

    1. कम पिघल agarose (4.2 खंड के अनुसार) में कांच नीचे इमेजिंग (MatTek निगम) के व्यंजन के रूप में पहले वर्णित में tricaine के साथ मछली तैयार है. ओलिंप ग्यारहवीं - 81 (ओलिंप) उलटा माइक्रोस्कोप मंच पर पकवान रखें. अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) प्रकाश के तहत 4x बढ़ाई के तहत ध्यान में मछली लाओ. छवियाँ 20x 4x, पर कब्जा कर लिया जा सकता है, और डीआईसी, TRITC (tetramethyl rhodamine आइसोथियोसाइनेट), और FITC (fluorescein आइसोथियोसाइनेट) फ़िल्टर सेटिंग्स में 40x बढ़ाई.
    2. एक FV-1 के साथ एक ओलिंप नौवीं 81-उलटा माइक्रोस्कोप का उपयोग करें000 लेजर Ariga एट अल के अनुसार confocal प्रणाली स्कैनिंग 32. 40x बढ़ाई में 1-1.5 माइक्रोन संक्रमण के हर घंटे के स्लाइस के साथ Z ढेर स्थापना द्वारा समय पाठ्यक्रम संचालित.
    3. 2 घंटे या अधिक के लंबे समय पाठ्यक्रम इमेजिंग के लिए, मछली इमेजिंग पकवान में हर 2-3 घंटे के शीर्ष पर कम पिघल agarose की एक परत जगह. यह बाहर सुखाने और मछली कुचल जबकि यह imaged किया जा रहा है से agarose रोकता है. मछली की एक छोटी संख्या के साथ लंबा समय पाठ्यक्रम के लिए, एक गर्म मंच का उपयोग करें (Bioptechs इंक) के संक्रमण के दौरान 28 ° C बनाए रखने.

    6. प्रतिनिधि परिणाम

    एक सफल hindbrain निलय सी. का एक उदाहरण 5 घंटे के बाद संक्रमण (HPI) और 24 hpi पर एक zebrafish लार्वा में albicans संक्रमण में दिखाया गया है (चित्रा 1). बृहतभक्षककोशिका कोशिकाओं की तरह घिरा हुआ सी. के साथ श्वेत 5 hpi पर hindbrain निलय में देखा जाता है. 24 द्वारा HPI, सी. श्वेत बृहतभक्षककोशिका - तरह सेल के अंदर हैपृष्ठीय पूंछ के ऊतकों में फैलाया कैंडिडिआसिस का संकेत है. इस संक्रमण परिणाम 10-15 खमीर फार्म सी. के एक सटीक इंजेक्शन पर अत्यधिक निर्भर है श्वेत hindbrain निलय में. संक्रमित तुरंत बाद इंजेक्शन मछली की स्क्रीनिंग यह सुनिश्चित कर सकते हैं.

    चित्रा 1
    चित्रा 1: ट्रांसजेनिक fli1 को. 22 EGFP 33 CaF2 - yCherry Candida albicans और confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा imaged किया intravitally से संक्रमित लार्वा. (एसी) 5 घंटे के बाद संक्रमण (ए) में संक्रमण की साइट (hindbrain निलय) स्केल बार = 100 माइक्रोन बृहतभक्षककोशिका कोशिकाओं की तरह EGFP व्यक्त के साथ संक्रमित लार्वा. (ख और ग) एक ही मछली के उच्च बढ़ाई छवियों, सी. दिखा phagocytes के भीतर सफेद. पैमाने बार = B के लिए 100 माइक्रोन और सी. (लोमो) 24 घंटे के बाद संक्रमण (डी) CaF2 के yCherry सी. के साथ फैलाया कैंडिडिआसिस के साथ संक्रमित लार्वा के लिए 10 माइक्रोन albicans के अंदर EGFP मैकपृष्ठीय पूंछ ऊतक में rophage कोशिकाओं की तरह. पैमाने बार = 100 माइक्रोन. (ई और एफ) एक ही मछली के उच्च बढ़ाई छवियों, सी. दिखा सफेद पूंछ के ऊतकों में. पैमाने बार = 100 माइक्रोन.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

zebrafish microinjection यहाँ प्रस्तुत विधि Gutzman एट अल से अलग 34. कि यहाँ में हम 36-48 HPF लार्वा के hindbrain निलय में कान का पुटिका के माध्यम से इंजेक्शन दिखाना है. विधि का वर्णन हम कम ऊतकों को नुकसान के साथ hindbrain निलय में 10-15 खमीर के लगातार इंजेक्शन के लिए अनुमति देता है. यह प्रोटोकॉल है कि 24 (चित्र 1) hpi और महत्वपूर्ण मारक / 5 रुग्णता में परिणाम द्वारा पूरे शरीर में फैलता है शुरू में एक स्थानीय संक्रमण पैदा करता है. hindbrain वेंट्रिकल पूरी तरह से 48 HPF 27 29, जब तक बंद नहीं बंद है. विकास मैक्रोफेज और neutrophils के इस प्रारंभिक चरण के दौरान संक्रमण के साइट, phagocytose की सी. की ओर पलायन सफेद, और 5 शरीर के अन्य भागों के लिए स्थानांतरित कर सकते हैं.

इस प्रणाली की वास्तविक शक्ति फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त रोगाणुओं के zebrafish ट्रांसजेनिक्स के साथ गठबंधन की क्षमता से आता है. हम एन हैसी. की gineered जंगली और प्रकार उत्परिवर्ती दाग albicans के रचनात्मक रूप में व्यक्त करने के लिए mCherry, dTomato, और eqFP650. Oxidative तनाव उत्तरदायी प्रमोटरों के साथ इन अभिव्यक्ति constructs के संयोजन रहते zebrafish लार्वा भीतर 5 oxidative तनाव के ratiometric मात्रा का ठहराव परमिट. फ्लोरोसेंट और उत्परिवर्ती कवक या मछली morphant संदर्भ में कवक फ्लोरोसेंट सहज प्रतिरक्षा कोशिकाओं के vivo इमेजिंग में दोहरी भी मजबूती के साथ संक्रमण की साइट के लिए पलायन, रोगज़नक़ के phagocytosis, कवक अंकुरण की रोकथाम के रूप में बदल प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया यों किया जा सकता है और 5 हत्या.

वहाँ कई तकनीक से संबंधित मुद्दों है कि इस प्रोटोकॉल के एक नौसिखिए उपयोगकर्ता के लिए समस्याग्रस्त किया जा सकता है. सबसे पहले, यह महत्वपूर्ण है कि सुई उचित काटा गया है और इंजेक्शन दबाव ठीक से सेट कर दिया जाता है इतना है कि 5 सी. की nl albicans के निलंबन microinjected है. यह सुनिश्चित करने के लिए यह एक जाँच कर सकते हैं कि सांस से बाहर आ रहा हैसुई एक रस्मी 25 zebrafish लार्वा की पुतली के आकार है, जैसा कि खंड 3.8 में वर्णित है. यह महत्वपूर्ण है कि zebrafish लार्वा injectant की एक ही राशि है, जो epifluorescence द्वारा तत्काल स्क्रीनिंग के बाद संक्रमण के द्वारा पुष्टि की जा सकती है सत्यापित करने के लिए कि वहाँ 10-15 hindbrain निलय में मौजूद खमीर हैं प्राप्त करने के. इंजेक्शन मछली भी किया जा सकता है और homogenized प्रारंभिक कॉलोनी के सत्यापन 5 इकाइयों के गठन के लिए चढ़ाया. दूसरा, यह puncturing से बचने hindbrain निलय में रक्त वाहिकाओं महत्वपूर्ण है, के रूप में इस लार्वा की अकाल मृत्यु का कारण बनता है. यह महत्वपूर्ण है एक लगभग 45 डिग्री के कोण के साथ कान का पुटिका में इंजेक्षन, hindbrain निलय में प्रत्यक्ष microinjection सुनिश्चित करने. तीसरा, अतिरिक्त देखभाल नहीं आंसू या कान का पुटिका ऊतक है, जो संक्रमण साइट है कि रोगज़नक़ संक्रमण से स्वतंत्र है के लिए वृद्धि हुई सूजन में परिणाम कर सकते हैं नुकसान ले. चौथा, इंजेक्शन जल्दी से प्रदर्शन किया जाना चाहिए एक बार लार्वा से agarose injecti पर तैनात कर रहे हैंडिश पर. लार्वा छोड़ पकवान पर भी लंबे समय तक बाहर सूख जाएगा, और अगर यह होता है वहाँ पीबीएस इंजेक्शन मछली में मृत्यु हो जाएगा. 15 मिनट के भीतर संक्रमण को पूरा करने और पानी के पकवान पर एक अवशिष्ट राशि छोड़ने जबकि मछली संक्रमण दोनों को इस समस्या की उन्नति में मदद कर सकते हैं. हालांकि, पकवान पर बहुत अधिक पानी छोड़ने के इंजेक्शन अधिक लार्वा बहती के साथ मुश्किल कर सकते हैं. इंजेक्शन का एक वैकल्पिक तरीका है पुराने के लिए (4 DPF) मछली है कि और अधिक जटिल है, लेकिन हवा के लिए लार्वा को उजागर करने से बचा जाता है वर्णित Cosentino और 28 सहयोगियों द्वारा प्रदान की गई है.

zebrafish लार्वा बैक्टीरिया, कवक और वायरल 5 रोगज़नक़ों, 26, 35-46 के लिए सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया मॉडल इस्तेमाल किया गया तिथि है. ये पढ़ाई groundbreaking दोनों मेजबान और रोगज़नक़ में नई सेलुलर और आणविक तंत्र की खोज करने के लिए इस मॉडल प्रणाली की उपयोगिता की स्थापना की है. इस वर्णित प्रोटोकॉल के साथ एक साथ ले ली गई, इन अन्य प्रकाशित काम करता है अन्य laborato के लिए एक आधार प्रदान करते हैंएक अक्षुण्ण मेजबान के संदर्भ में बातचीत के मेजबान कवक की जांच यादें.

हालांकि इन प्रयोगों में उपयोगी है, fli1 EGFP ट्रांसजेनिक लाइन यहाँ वर्णित की अपनी सीमाएं है. fli1 जीन endothelial वाहिका संरचना में बृहतभक्षककोशिका तरह 22 कोशिकाओं के अलावा में व्यक्त की है. अक्सर vasculature की EGFP प्रतिदीप्ति यह कठिन सी. का पता लगाने के लिए कर सकते हैं बृहतभक्षककोशिका में श्वेत कोशिकाओं की तरह. इसके अलावा, बृहतभक्षककोशिका की तरह कोशिकाओं में EGFP अभिव्यक्ति 18-24 घंटे के बाद संक्रमण के चारों ओर कम हो जाता है यह पता लगाने के लिए मुश्किल बना रही है. एक हाल ही में प्रकाशित बृहतभक्षककोशिका विशिष्ट ट्रांसजेनिक zebrafish लाइन बृहतभक्षककोशिका 23 पढ़ाई के लिए एक मॉडल के रूप में कई फायदे हैं.

वर्णित संक्रमण तकनीक शक्तिशाली आनुवंशिक माइक्रोस्कोपी और प्रतिदीप्ति zebrafish में उपलब्ध उपकरणों की एक संख्या के लिए एक उद्यमियों प्रदान करता है. यह उचित ट्रांसजेनिक मछली और इंजीनियर सी. के साथ जोड़ा जा सकता है सफेद सी. युक्त की संख्या सहित मेजबान रोगज़नक़ संपर्क के कई पहलुओं की मात्रा का ठहराव, सक्षम albicans, सी. की आवृत्ति albicans के पाचन, और सी. के विभाजन सहज प्रतिरक्षा कोशिकाओं के भीतर 5 albicans. एक morpholino antisense oligonucleotides का उपयोग करने के लिए 5 संक्रमण में व्यक्ति सहज प्रतिरक्षा जीन की भूमिका की जांच के साथ भी इस प्रोटोकॉल गठबंधन कर सकते हैं.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

लेखकों के लिए microinjection, सलाह के लिए प्रशिक्षण Clarissa हेनरी के लिए भ्रूण और उपकरणों के विकास का उपयोग तेजी पर डॉ. कैरोल किम की प्रयोगशाला का शुक्रिया अदा करना, और fli1 योगदान के लिए नाथन लॉसन: EGFP मछली. हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए व्हीलर प्रयोगशाला और शॉन दीवारों के सदस्यों को धन्यवाद. हम भी इस परियोजना पर तकनीकी सलाह के लिए मछली देखभाल और सलाह के लिए मार्क, और Nilan रयान Phennicie और क्रिस्टिन गेबर धन्यवाद देना चाहूंगा. इस काम के. ब्रदर्स, MAFES हैच E08913-08 अनुदान, और एनआईएच NCRR आर व्हीलर P20RR016463 पुरस्कार के लिए एक MAFES अनुसंधान सहायता द्वारा वित्त पोषित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Spawning tanks Aquatic habitats 2L
1.7 mL tubes Axygen MCT-175-C
Instant Ocean Fisher Scientific S17957C
Extra deep Petri dishes Fisher Scientific 08-757-11Z
Standard Petri dishes VWR Scientific 25384-302
Transfer pipettes Fisher Scientific 13-711-7M
Yeast Extract VWR Scientific 90000-726
Peptone VWR Scientific 90000-264
Dextrose Fisher Scientific D16-1
Agar VWR Scientific 90000-760
Disposable Hemocytometer VWR Scientific 82030-468
Phosphate Buffered Saline VWR Scientific 12001-986
Dumont Dumoxel Tweezers VWR Scientific 100501-806
Wooden Dowels VWR Scientific 10805-018
KimWipes VWR Scientific 300053-964
Low Melt Agarose VWR Scientific 12001-722
Agarose for injection dishes VWR Scientific 12002-102
Flaming Brown Micropipette Puller Sutter Instruments P-97
Hollow glass rods Sutter Instruments BF120-69-10 For glass rods smooth glass by heating over bunsen burner
Pipette Storage Box Sutter Instruments BX10
MPPI-3 Injection system Applied Scientific Instrumentation MPPI-3
Back Pressure Unit Applied Scientific Instrumentation BPU
Micropipette Holder kit Applied Scientific Instrumentation MPIP
Foot Switch Applied Scientific Instrumentation FSW
Micromanipulator Applied Scientific Instrumentation MM33
Magnetic Base Applied Scientific Instrumentation Magnetic Base
Tricaine methane sulfonate Western Chemical Inc. MS-222
Dissecting Scope Olympus SZ61 top SZX-ILLB2-100 base
Confocal Microscope Olympus IX-81 with FV-1000 laser scanning confocal system
TC-7 Tissue Culture Roller drum with 14 inch test tube wheel New Brunswick Scientific TC-7
Imaging Dishes MatTek Corporation P24G-1.0-10-F
Pipette tips for loading needles Eppendorf 930001007
Plate pouring grids Adaptive Science Tools TU-1
Heated Stage Bioptechs Inc. Delta T-5
Flat Spatula VWR Scientific 82027-486
Plastic Sieves Wares of Knutsford Online 12 cm
Parafilm VWR Scientific 52858-000
Vortex Genie VWR Scientific 14216-184
16 x 150 mm Culture tubes VWR Scientific 60825-435
Nanodrop Thermo Scientific ND 2000
Phenol Red VWR Scientific 97062-478
HCl VWR Scientific 87003-216
NaCl VWR Scientific BDH4534-500GP
KCl VWR Scientific BDH4532-500GP
MgSO4 VWR Scientific BDH0246-500GP
Ca(NO3)2 VWR Scientific BDH0226-500GP
HEPES VWR Scientific BDH4520-500GP
Morpholinos GeneTools, LLC

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Trede, N. S., Langenau, D. M., Traver, D., Look, A. T., Zon, L. I. The use of zebrafish to understand immunity. Immunity. 20, 367-379 (2004).
  2. Kanther, M., Rawls, J. F. Host-microbe interactions in the developing zebrafish. Curr. Opin. Immunol. 22, 10-19 (2010).
  3. Meeker, N. D., Trede, N. S. Immunology and zebrafish: spawning new models of human disease. Dev Comp Immunol. 32, 745-757 (2008).
  4. Tobin, D., May, R. C., Wheeler, R. T. Zebrafish: a see-through host and fluorescent toolbox to probe host-pathogen interaction. PLoS Pathog. , (2011).
  5. Brothers, K. M., Newman, Z. R., Wheeler, R. T. Live imaging of disseminated candidiasis in zebrafish reveals role of phagocyte oxidase in limiting filamentous growth. Eukaryot. Cell. 10, 932-944 (2011).
  6. Pfaller, M. A., Diekema, D. J. Epidemiology of invasive candidiasis: a persistent public health problem. Clin. Microbiol. Rev. 20, 133-163 (2007).
  7. Ashman, R. B. Innate versus adaptive immunity in Candida albicans infection. Immunol. Cell Biol. 82, 196-204 (2004).
  8. de Repentigny, L. Animal models in the analysis of Candida host-pathogen interactions. Curr. Opin. Microbiol. 7, 324-329 (2004).
  9. Rogers, T. J., Balish, E. Immunity to Candida albicans. Microbiol. Rev. 44, 660-682 (1980).
  10. Calderone, R., Sturtevant, J. Macrophage interactions with Candida. Immunol. Ser. 60, 505-515 (1994).
  11. Frohner, I. E., Bourgeois, C., Yatsyk, K., Majer, O., Kuchler, K. Candida albicans cell surface superoxide dismutases degrade host-derived reactive oxygen species to escape innate immune surveillance. Mol. Microbiol. 71, 240-252 (2009).
  12. Kumamoto, C. A., Vinces, M. D. Contributions of hyphae and hypha-co-regulated genes to Candida albicans virulence. Cell Microbiol. 7, 1546-1554 (2005).
  13. Lorenz, M. C., Bender, J. A., Fink, G. R. Transcriptional response of Candida albicans upon internalization by macrophages. Eukaryot. Cell. 3, 1076-1087 (2004).
  14. Rubin-Bejerano, I., Fraser, I., Grisafi, P., Fink, G. R. Phagocytosis by neutrophils induces an amino acid deprivation response in Saccharomyces cerevisiae and Candida albicans. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 11007-11012 (2003).
  15. Behnsen, J. Environmental dimensionality controls the interaction of phagocytes with the pathogenic fungi Aspergillus fumigatus and Candida albicans. PLoS Pathog. 3, e13 (2007).
  16. Lavigne, L. M. Integrin engagement mediates the human polymorphonuclear leukocyte response to a fungal pathogen-associated molecular pattern. J. Immunol. 178, 7276-7282 (2007).
  17. Newman, S. L., Bhugra, B., Holly, A., Morris, R. E. Enhanced killing of Candida albicans by human macrophages adherent to type 1 collagen matrices via induction of phagolysosomal fusion. Infect. Immun. 73, 770-777 (2005).
  18. Netea, M. G., Brown, G. D., Kullberg, B. J., Gow, N. A. An integrated model of the recognition of Candida albicans by the innate immune system. Nat. Rev. Microbiol. 6, 67-78 (2008).
  19. Lam, S. H., Chua, H. L., Gong, Z., Lam, T. J., Sin, Y. M. Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study. Dev. Comp. Immunol. 28, 9-28 (2004).
  20. Magnadottir, B. Innate immunity of fish (overview). Fish Shellfish Immunol. 20, 137-151 (2006).
  21. Sullivan, C., Kim, C. H. Zebrafish as a model for infectious disease and immune function. Fish Shellfish Immunol. 25, 341-350 (2008).
  22. Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev. Biol. 248, 307-318 (2002).
  23. Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117, e49-e56 (2011).
  24. Renshaw, S. A. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108, 3976-3978 (2006).
  25. Lesley, R., Ramakrishnan, L. Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish. Curr Opin. Microbiol. 11, 277-283 (2008).
  26. Chao, C. C. Zebrafish as a model host for Candida albicans infection. Infect. Immun. 78, 2512-2521 (2010).
  27. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. , 203-253 (1995).
  28. Cianciolo Cosentino, C., Roman, B. L., Drummond, I. A., Hukriede, N. A. Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury. J. Vis. Exp. (42), e2079 (2010).
  29. Haddon, C., Lewis, J. Early ear development in the embryo of the zebrafish, Danio rerio. J. Comp. Neurol. 365, 113-128 (1996).
  30. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).
  31. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
  32. Ariga, J., Walker, S. L., Mumm, J. S. Multicolor Time-lapse Imaging of Transgenic Zebrafish: Visualizing Retinal Stem Cells Activated by Targeted Neuronal Cell Ablation. J. Vis. Exp. (43), e2093 (2010).
  33. Redd, M. J., Kelly, G., Dunn, G., Way, M., Martin, P. Imaging macrophage chemotaxis in vivo: studies of microtubule function in zebrafish wound inflammation. Cell Motil. Cytoskeleton. 63, 415-422 (2006).
  34. Gutzman, J. H., Sive, H. Zebrafish Brain Ventricle Injection. J. Vis. Exp. (26), e1218 (2009).
  35. Davis, J. M. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17, 693-702 (2002).
  36. Meijer, A. H. Identification and real-time imaging of a myc-expressing neutrophil population involved in inflammation and mycobacterial granuloma formation in zebrafish. Dev. Comp. Immunol. 32, 36-49 (2008).
  37. Mathias, J. R. Live imaging of chronic inflammation caused by mutation of zebrafish Hai1. J. Cell Sci. 120, 3372-3383 (2007).
  38. Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Dev. Biol. 7, 42 (2007).
  39. Vergunst, A. C., Meijer, A. H., Renshaw, S. A., O'Callaghan, D. Burkholderia cenocepacia creates an intramacrophage replication niche in zebrafish embryos, followed by bacterial dissemination and establishment of systemic infection. Infect Immun. 78, 1495-1508 (2010).
  40. Le Guyader, D. Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish. Blood. 111, 132-141 (2008).
  41. Clatworthy, A. E. Pseudomonas aeruginosa infection of zebrafish involves both host and pathogen determinants. Infect. Immun. 77, 1293-1303 (2009).
  42. Brannon, M. K. Pseudomonas aeruginosa Type III secretion system interacts with phagocytes to modulate systemic infection of zebrafish embryos. Cell Microbiol. 11, 755-768 (2009).
  43. Levraud, J. P. Real-time observation of listeria monocytogenes-phagocyte interactions in living zebrafish larvae. Infect. Immun. 77, 3651-3660 (2009).
  44. van der Sar, A. M. Zebrafish embryos as a model host for the real time analysis of Salmonella typhimurium infections. Cell Microbiol. 5, 601-611 (2003).
  45. Phennicie, R. T., Sullivan, M. J., Singer, J. T., Yoder, J. A., Kim, C. H. Specific resistance to Pseudomonas aeruginosa infection in zebrafish is mediated by the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Infect Immun. 78, 4542-4550 (2010).
  46. Prajsnar, T. K., Cunliffe, V. T., Foster, S. J., Renshaw, S. A. A novel vertebrate model of Staphylococcus aureus infection reveals phagocyte-dependent resistance of zebrafish to non-host specialized pathogens. Cell Microbiol. 10, 2312-2325 (2008).

Tags

इम्यूनोलॉजी 65 अंक संक्रमण आण्विक जीवविज्ञान विकास जीवविज्ञान, कैंडिडिआसिस zebrafish लार्वा, confocal इमेजिंग
Zebrafish लार्वा में गैर इनवेसिव कैंडिडिआसिस फैलाया इमेजिंग
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Brothers, K. M., Wheeler, R. T.… More

Brothers, K. M., Wheeler, R. T. Non-invasive Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (65), e4051, doi:10.3791/4051 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter