Summary
Une méthode d'imagerie fonctionnelle du tissu adipeux brun de la souris (BAT) est décrit dans lequel froide stimulée par l'absorption de 18F-fluorodésoxyglucose (FDG) dans la MTD est non-invasive évaluée avec un protocole standardisé micro-PET/CT. Cette méthode est robuste et sensible pour détecter des différences dans les activités de BAT dans des modèles murins.
Abstract
Le tissu adipeux brun (BAT) diffère de tissu adipeux blanc (WAT) par son emplacement discret et une couleur brun-rouge due à la vascularisation riche et haute densité des mitochondries. BAT joue un rôle majeur dans la dépense énergétique et non frissons thermogenèse chez les mammifères nouveau-nés ainsi que les adultes 1. BAT-thermogenèse induite est fortement régulée par le système nerveux sympathique, principalement par l'intermédiaire des récepteurs adrénergiques β 2, 3. Des études récentes ont montré que les activités de BAT chez les adultes humains sont corrélés négativement avec l'indice de masse corporelle (IMC) et les paramètres de diabétiques d'autres 4-6. BAT a donc été proposé comme une cible potentielle pour la thérapie anti-obesity/anti-diabetes mettant l'accent sur la modulation de la balance énergétique 6-8. Alors que plusieurs froides défi à base de tomographie par émission de positons (TEP) méthodes ont été établies pour détecter BAT humaine 9-13, il ya pratiquement pas de protocole standardisé pour l'imagerie et QUANTIFication des MTD dans de petits modèles animaux tels que des souris. Nous décrivons ici une méthode d'imagerie robuste TEP / TDM pour l'évaluation fonctionnelle des MTD chez la souris. Brièvement, des souris C57BL/6J adultes étaient traités à froid à jeun pour une durée de 4 heures avant d'avoir reçu une dose de 18 F-fluorodésoxyglucose (FDG). Les souris ont été resté dans le froid pendant une heure après l'injection supplémentaire FDG, puis scannées avec un système micro-PET/CT animal dévoué mais peu nombreux. Les images TEP acquises ont été co-enregistré avec les images CT pour les références anatomiques et analysés pour la fixation du FDG dans la zone BAT interscapulaire de présenter l'activité BAT. Ce standard de traitement à froid et le protocole d'imagerie a été validé par des activités de test MTD lors des interventions pharmacologiques, par exemple, l'activation BAT supprimée par le traitement de la β-adrénergique antagoniste propranolol 14, 15, ou l'activation BAT renforcée par agoniste β3 BRL37344 16. La méthode described ici peuvent être appliqués pour cribler des médicaments / composés qui modulent l'activité BAT, ou pour identifier les gènes / voies qui sont impliqués dans le développement de BAT et de la réglementation dans plusieurs études précliniques et de base.
Protocol
1. Préparation des animaux et de Traitement par le froid
- Localiser et inspecter un 4 ° C chambre froide qui a été approuvé pour recevoir des souris de laboratoire.
- Cages pour animaux de pré-refroidissement pendant la nuit dans la chambre froide. Les cages sont assemblés sans nourriture et la litière, mais avec une bouteille d'eau.
- Dans la matinée de la journée expérimentale, les souris lieu un par un dans chacune des cages pré-réfrigérés à intervalles de 30 min. Chaque souris individuellement en cage devrait rester dans la chambre froide pendant près de 4 heures avant d'être transporté au laboratoire d'imagerie. S'assurer que les souris sont à jeun mais avec un accès à l'eau.
- À 4 h après le transport d'un animal traitement par le froid à la fois toutes les 30 minutes au laboratoire d'imagerie. Ceci peut être obtenu en remplissant un récipient en polystyrène avec de la glace et à placer une cage de boîtier pré-refroidi au-dessus de la glace à l'intérieur de la boîte. Librement placer le couvercle sur la boîte en polystyrène.
2. Configuration Micro-PET/CT imagerie de flux de travail
- Acquisition CT: Pour l'ensemble du corps tomodensitométrie, régler le courant à 500 uA, la tension à 80kV, temps d'exposition à 200 ms, et 240 marches pour 240 ° de rotation. Pour détecteur de rayons X, sélectionnez la résolution à «faible grossissement système" avec 78 mm Imagerie en mode axial et un lit simple. Sélectionnez «reconstruction en temps réel" en utilisant le "Common Cone-Beam reconstruction" méthode pour que les pourparlers PC hôte avecun véritable ordinateur dédié reconstruction de temps (Cobra) pour lancer la tâche.
- Acquisition d'émission PET: Set 600 sec (10 min) pour "temps de cycle fixe" dans le "acquérir par le temps" option. Sélectionnez F-18 comme «isotope étude" et utilisez 350-650 keV comme «niveau d'énergie».
- Histogramme des émissions PET: Set "cadre dynamique» comme «noir» pour traiter les données comme une image pendant toute la durée de balayage pour atteindre statique. Sélectionnez "3D" comme type histogramme et choisissez "aucune correction de dispersion".
- Reconstruction TEP: Utilisez 2D Maximisation Commandé Attente sous-ensemble (OSEM2D) que l'algorithme de reconstruction.
3. L'injection de FDG
- Commander un paquet clinique de 18 F-FDG (10 mCi) d'un fournisseur régional de son arrivée au laboratoire d'imagerie ~ 30 min avant l'injection programmée premier. Suivre les procédures de sécurité de l'Institut pour recevoir et étudier le paquet contenant materia radioactifsls (RAM).
- Avec la protection offerte par un bouclier L-bloc de dessus de table, partie aliquote du FDG et faire des dilutions de sérum physiologique stérile. La concentration d'activité du FDG diluée devrait être disponible à 200-300 μCi/100 ul pour chaque injection. Aspirer la solution de FDG dans une seringue de 1 ml avec 26G 1/2 pouces aiguille, et de mesurer la radioactivité de la seringue en entier avec un calibreur de dose.
- Injecter l'animal qui est tout simplement transporté de la chambre froide (voir l'étape 1.4) avec 100 pi de solution de FDG par voie intrapéritonéale (ip) de route. Noter le temps d'injection. Mesurer la radioactivité résidu de la seringue à nouveau avec le calibreur de dose.
- Placez l'animal à l'intérieur d'une cage froide refroidisseur polystyrène maintenues avec de la glace. Incuber l'animal au froid (~ 4 ° C) pendant 1 heure pour la fixation du FDG.
- Calculer l'activité injectée FDG pour chaque souris par la formule suivante:
Injecté activité (Ci) = activité dans la seringue avant l'injection- L'activité dans la seringue après l'injection
4. Micro-PET/CT Imaging
- L'imagerie micro-PET/CT commence 1 heure après l'injection du FDG ou 5 heures après le traitement par le froid. Placez l'animal dans une chambre d'induction de l'anesthésie avec l'isoflurane 3% en oxygène.
- Une fois l'anesthésie est induite, l'animal est déplacé sur une pastille micro-CT (lit pour animaux) avec sa tête reposant dans un masque cône qui fournit en permanence l'isoflurane (2%) à un débit de 2 L / min. Un coussin chauffant électrique (BioVet, m2m Imaging Corp) est placé sous l'animal pour aider à maintenir la température du corps.
- Faites glisser l'animal à l'entrée du scanner MM, activer le "laser" icône de la barre d'outils, et utilisez la commande touchpad pour déplacer le lit de sorte que la poitrine de l'animal est à la croisée des lignes laser horizontales et verticales. Dans le "alignement laser" fenêtre, sélectionnez "Type de la première analyse" comme la tomodensitométrie, et «Acquisition TEP inclus dans le workflow" comme option.
- Ouvrez la fenêtre "Vue scout" fenêtre et acquérir une vision scout radiographie radiographie. Utiliser AIF pour ajuster la position du lit animal de façon que le champ de vue du centre CT est situé dans le centre du corps de la souris (foie). Répétez cette étape si nécessaire.
- Démarrez le "workflow" créé à l'étape 2. Lorsque des options s'affiche, sélectionnez une appropriée 3D PET-CT matrice de transformation de fichier à utiliser en reconstruction tomographique, et choisissez un fichier normalisation récemment créé pour la reconstruction TEP sans correction d'atténuation. L'AIF va alors commencer CT et TEP séquentiellement comme programmés.
- Après l'ensemble du workflow est terminé, ce qui peut prendre 20-25 minutes, brièvement évaluer la qualité de l'acquis images TEP et CT avec le VM ASIPro, un logiciel d'analyse micro-TEP co-installé avec AIF. Archiver les données d'imagerie à un périphérique de stockage de données ou de transférer les données à travers le réseau à un poste de travail après l'analyse d'imagerie (voir l'étape 5) pour une analyse plus approfondie.
- ReleaSE l'animal à partir des systèmes d'imagerie et le placer à une cage de boîtier propre à l'alimentation normale et d'approvisionnement en eau pour sa récupération à la température ambiante. Les systèmes sont maintenant prêts pour le prochain animal dans la file d'attente. Notez le soin et la manipulation des animaux de post-imagerie doit se conformer aux règlements de l'Institut en ce qui concerne "la manipulation des animaux de laboratoire injectés avec de la mémoire". A noter également que utilisé aiguilles / seringues, les tampons absorbants, gants, et toute la literie et les matières fécales doivent être considérés comme des déchets radioactifs, et manipulés conformément à la réglementation pertinentes institut RAM élimination des déchets.
5. Analyse post-imagerie
- Ouvrir la recherche Inveon milieu de travail (IRW) logiciel (Siemens) et importer manuellement CT et PET ensembles de données. Co-registre images TEP et CT dans "Enregistrement" fenêtre à l'aide des outils de l '«analyse générale" la fonction, et sous la rubrique «Revue" fenêtre de s'assurer un alignement parfait entre les images TEP et CT dans les 3 dimensions.
- De «région d'intérêt (ROI) Quantification" fenêtre, avec les références fournies par les images CT co-enregistrés, d'identifier les meilleures techniques disponibles dans la région interscapulaire du cou, le plus prédominant inductible par le froid BAT chez la souris adulte, et d'en tirer volume d'intérêt (VOI) des MTD sur l'ensemble des données TEP. Sélectionnez "Intensité Voxel» comme «Type de Quantification" et enregistrer la radioactivité moyenne dans le VOI en Bq / ml. Un facteur d'étalonnage qui convertit coups / sec en Bq / ml a été établi préalablement par la numérisation d'un fantôme à la radioactivité connue.
- La fixation du FDG dans la MTD est quantifié par la dose injectée pourcentage par gramme de tissu (% ID / g) avec correction de décroissance. La dose injectée est le résultat de l'étape 3.5, cependant, converti en becquerel (Bq) Unité (1 pCi = 37.000 Bq), nous supposons que 1 ml de tissu est égal à 1 g.
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Representative Results
Un exemple de l'imagerie micro-PET/CT des MTD souris est illustré à la figure 1. Alors que l'imagerie CT fournit des informations anatomiques, l'imagerie TEP code de la distribution et de la quantité de 18 F-FDG dans tout le corps. Ces données d'imagerie peuvent être regardées séparément (1A et 1B), fusionnée (1C), ou résulter d'une fonctionnalité 3D comme projection d'intensité maximale (MIP, 1D). Avec l'aide d'un outil d'imagerie 3D, un volume d'intérêt (VOI), voici la région BAT interscapulaire (indiqué par des flèches sur la figure 1), est attirée sur les images TEP et les signaux totales dans le VOI peuvent être convertis en ID% / g, ce qui représente la dose injectée en pourcentage (% ID) par gramme de tissu. Chez la souris a démontré, la fixation du FDG dans le BAT est l'ID de 19% / g. Afin de vérifier si cette induction froid et le protocole d'imagerie est assez sensible pour détecter une activité BAT altéré, dans les deux cas de régulation à la hausse ou à la baisse la réglementation, nous avons utilisé βantagoniste adrénorécepteur propranolol pour supprimer l'activation MTD 15, et β3 agoniste BRL37344 pour améliorer l'induction MTD 16, respectivement. Ces interventions pharmacologiques ont été appliquées pendant le traitement à froid et avec précision, à 30 min avant l'injection du FDG. Imagerie TEP / TDM (figure 2A) et l'analyse (figure 2B) ont montré que le traitement propranolol réduit de façon significative la fixation du FDG dans la MTD, alors que BRL37344 nettement élevés de la consommation, par rapport à la maîtrise du véhicule.
Figure 1. Imagerie Micro-PET/CT des MTD dans une souris après 5 h de traitement à froid. (A) Une partie coronaire de l'image CT. (B) Une coupe coronale de l'image TEP co-enregistré avec le CT en "A". (C) Une fusion TEP / CT l'image résulte de la superposition de "A" et "B". (D) Intensité maximale projectisur (MIP) présentation des fondus PET / CT images. Les flèches jaunes: la zone correspondant au tissu adipeux brun interscapulaire.
Figure 2. Micro-PET/CT démonstration d'altération activité BAT par des médicaments adrénergiques. (A) 18 F-FDG PET / CT imagerie de souris traitées avec des médicaments différents. a) PBS (contrôle). b) Le propranolol (antagoniste β, 5mg/kg, ip). A noter une réduction marquée de la fixation du FDG dans la zone BAT. c) BRL37344 (β3 agoniste, 5mg/kg, ip). A noter une augmentation significative de l'accumulation de FDG dans la MTD. Les flèches jaunes: la zone correspondant au tissu adipeux brun interscapulaire. (B) Analyse quantitative de la fixation du FDG dans la MTD. Les valeurs de% ID / g (le pourcentage dose injectée par gramme de tissu) sont présentés (moyenne ± écart-type). n = 10 pour le groupe PBS, n = 5 pour les groupes à la fois propranolol et BRL37344. * P <0,05; **p <0,005 par rapport au groupe PBS.
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Discussion
Dans cette étude, une méthode d'imagerie micro-PET/CT-based a été développé pour la détection des activités de BAT chez la souris adulte qui nécessite simplement un traitement par le froid et une injection de disponible dans le commerce 18 F-FDG. L'ensemble de la procédure peut se faire en un jour à la suite d'un traitement et d'imagerie séquence qui commence toutes les 30 minutes jusqu'à ce que tous les animaux sont traités et imagée. Dans les conditions expérimentales décrites, un total de 10 souris (ou 2 groupes de 5 souris) peuvent être testés le même jour avec un système d'imagerie unique. La limitation de ce type de débit peut être levée si 2 ou plusieurs animaux peuvent être scannés simultanément sur un lit spécialement conçu animale comme il a été indiqué précédemment 17. Pour compléter l'étude nous nous appuyons sur l'utilisation d'un système d'imagerie micro-PET/CT combiné qui tire parti de l'information anatomique détaillée fournie par le CT. Cependant, un standalone micro-TEP est également en mesure de remplir la tâche quand un C 57o transmission balayage est ajouté au flux de travail avant l'acquisition des données d'émission F18. Les données de transmission Co 57 peut être utilisé pour la correction d'atténuation au cours de la reconstruction d'images PET et peut également être reconstituée pour la localisation anatomique.
Une étape cruciale de ce protocole est d'optimiser la durée du traitement à froid (par exemple, 5 heures dans cette étude). Un temps plus courte durée ou l'élimination de l'exposition au froid peut produire une activité proche de l'arrière-plan et la méthode peut être insensible à toute régulation à la baisse des MTD (l'effet du floor). En revanche, une exposition allongée à froid (comme les heures de nuit, ou 24) peut maximiser l'induction et la méthode peut devenir saturé masquer des différences dans la régulation positive des MTD (l'effet plafond). Les conditions optimales décrites dans ce protocole ont été validées par la suppression propranolol et β3 agoniste des tests de stimulation (Figure 2 BRL37344
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier Laura Diaz, Kevin Phillips, Willa A. Hsueh, et le roi C. Li pour leur soutien utiles commentaires et technique dans le développement de cette méthode.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro-PET/CT Imaging System | Siemens Medical Solutions USA, Inc. | Inveon Dedicated PET System and Inveon Multimodality CT/SPECT System (docked) | |
| Propranolol | Sigma | P0884 | |
| BRL 37344 | Sigma | B169 | |
| 18F-FDG | Cyclotope Inc. | ||
| C57BL/6J Male Mice | Jackson Laboratory | 000664 | 3-4 months old |
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