Summary
Denna video demonstrerar förfaranden för karakterisering av humana pankreasöar med hematoxylin och eosin (H & E) och immunohistokemi (IHC). Pankreatiska sektioner från huvud, kropp och regioner svans färgas av både H & E och IHC för att bestämma ö endokrin sammansättning (insulin, glukagon och pankreaspolypeptid), cellreplikation (Ki67) och inflammatoriska infiltrat (H & E, CD3). Den uncinate regionen är lokaliserad användning IHC för pankreatisk polypeptid.
Abstract
Uppskattningar av ö-område och antalet och endokrina celler komposition i vuxen human pankreas variera från flera hundra tusen till flera miljoner och beta massa ligger i intervallet från 500 till 1500 mg 1-3. Med denna kända heterogenitet, var en vanlig behandling och färgningsproceduren utvecklas så att bukspottkörteln regioner var tydligt definierade och holmar kännetecknas med rigorös histopatologi och undersökningar immunolokalisering.
Standardiserade förfaranden för bearbetning av mänskliga bukspottkörteln återhämtat sig från organdonatorer beskrivs i del 1 av denna serie. Bukspottkörteln är bearbetas i 3 huvudsakliga områden (huvud, kropp, svans) följt av tvärgående sektioner. Tvärgående snitt från bukspottkörteln huvudet är vidare uppdelade, som anges baserat på storlek, och numrerade alfabetiskt att beteckna underavdelningar. Denna standardisering möjliggör en fullständig tvärsektion analys av huvudet regionen inklusive uncinate region som innehåller sammansatta cellöarprimärt av pankreatisk polypeptid celler till svansregionen.
Den här rapporten utgör en del 2 i denna serie och beskriver de förfaranden som används för seriell sektionering och histopatologiska karakterisering av avsnitten pankreas paraffin med en betoning på ö endokrina celler, replikering och T-cellinfiltrat. Patologi pankreas sektioner är avsedd att karakterisera både exokrin, duktulära, och komponenter endokrina. Den exokrina facket utvärderas med avseende på närvaro av pankreatit (aktiv eller kronisk), atrofi, fibros, och fett, liksom kanalsystemet, i synnerhet i relation till närvaron av pankreatisk intraduktal neoplasi 4. Cellöarna utvärderades med avseende på morfologi, storlek och densitet, celler endokrina, inflammation, fibros, amyloid, och närvaron av replikerande eller apoptotiska celler med användning av H & E och IHC fläckar.
Den sista komponenten beskrivs i del 2 är tillhandahållandet av färgade bildens som digitaliserade hela glaset bilder. De digitaliserade bilderna är organiserade från fall till fall och bukspottkörtel region i en online-databas patologi skapa en virtuell biobank. Tillgång till detta online kollektion tillhandahålls för närvarande till över 200 kliniker och forskare som deltar i typ 1-diabetes forskning. Online databasen ger ett medel för snabb och fullständig datadelning och utredarna att välja block för paraffin eller frysta seriella sektioner.
Protocol
1. Mikrotomi för Ofärgade avsnitten
- Ställ in vattenbad och mikrotom som för standard paraffin mikrotomi. Använd positivt laddade bilder och pre-etikett med målnummer, pankreas-regionen (prov) och bildnummer. Plats paraffin-block i mikrotomen chucken med kassetten etiketten på den vänstra sidan.
- Följ normala mikrotomi förfaranden, avsnitt in i blocket tills vävnaden är jämnt påträffas. Skapa ett band av seriella sektioner (4 m tjocka, 3-6 beroende på antalet ursprungliga nödvändiga fläckar (se formulär mål Submission, bilaga 1)). Separata avsnitt i bandet, plocka upp varje i ordning, och lägg på bilder med beställning numrerade med blyerts. Beteckna om en del är oanvänd med numrering avsnitt i exakt ordning. Behåll samma orientering på bilden som finns i kassetten med bilden etiketten orienterade till vänster. Torka över natten vid rumstemperatur sedan att fortsätta med färgning eller distribution till undersökarna.
- ResEAL ytan av paraffin block med tunt skikt av paraffin för att bevara vävnad och arkivera i rumstemperatur eller -20 ° C.
- För efterföljande mikrotomi, upprätthålla numrering för seriella sektioner på varje nivå enligt ovan. Erhålla en ytterligare bild och färga med H & E objektglas för varje ~ 100 pM nivå inom varje block.
2. H & E-färgning
- Placera den första seriella snitt bild från varje block i en bild rack sedan i den första brickan på Autostainer.
- Välj standard H & E färgning och fortsätt som vanligt.
- När du är klar färgning, ta bort bilder från Autostainer och placera i huva för täckglas.
- Täckglas med användning av standardteknik. Torka noga och etikett med en tryckt etikett (se avsnitt 12).
3. IHC Set-up
- Välj Dako för dubbla fläckar och telefonnummer in i bilder. Framställ TBST och citratbuffertar, antikroppar och andra Reagent på bestämda volymer (tabell 1). Laddas reagensen facket och bilder. Rotation av ren och linjer avfall är programmerade enligt tillverkarens rekommendationer.
- Om att utföra dessa analyser manuellt, förbereda beräknade volymer. Inkubera objektglasen i en fuktig kammare för att undvika att bilderna torkning ut på varje steg. Följ samma procedur för varje reagens som när den används för Autostainer.
4. IHC Deparaffinization och antigenåtervinning
- Sätt objektglasen i xylen under 5 min. Upprepa en gång. Låt inte objektglasen torka ut vid någon senare punkt tills anges som detta kommer att resultera i överdriven bakgrunden och dålig färgning.
- Överför objektglasen till 100% etanol under 2 minuter. Upprepa en gång.
- Sätt objektglasen i nyberedd 3% H2O 2 i metanol under 10 minuter.
- Dip bilder i 90% etanol och sedan placera i 90% etanol i 3 minuter.
- Överför objektglasen till70% etanol under 1 minut.
- Skölj objektglasen i avjoniserat vatten.
- Förvärma ångkokaren och citratbuffert i ångkokaren i 5 minuter.
- Lägg bilder till citrat buffert i ångaren och ånga i 30 minuter.
- Omgående överlåta bilder till vatten och håll tills glider svalna till rumstemperatur (~ 20 minuter).
- Överför bilder till Dako Autostainer rack enligt färga sekvens (figur 1) och kör dubbla färgningen programmet. De stora stegen i Autostainer programmet listas så att manuella körningar kan kopiera.
5. Första primära antikroppar (Ki-67, CD3, pankreaspolypeptid)
- Blockera objektglas med Krypskytten lösningen under 15 minuter. Tvätta två gånger med TBST.
- Inkubera objektglasen i primär antikropp i 30 minuter. Tvätta två gånger med TBST.
- Inkubera med Mach2 get-anti-mus (Ki-67) eller anti-kanin (CD3, pankreatisk polypeptid) pepparrotsperoxidas (HRP)-polymer för 30 minutes. Tvätta två gånger med TBST.
- Tillämpas 3,3-diaminobensidintetrahydroklorid (DAB) till objektglas i 4 minuter. Tvätta två gånger med vatten.
- Objektglas inkuberats med pankreaspolypeptid hålls på Dako när de analyseras samtidigt och TBST används för alla efterföljande steg medan de övriga bilderna inkuberas med den andra uppsättningen av primära antikroppar. Alternativt, för manuella analyser, gå vidare till avsnitt 6.
6. Andra primära antikroppar (insulin, glukagon)
- Inkubera objektglasen i Deeb i 20 minuter. Tvätta två gånger med TBST.
- Blocket med 10% normalt getserum i 20% avidin-blockerare i TBST (insulin) eller Sniper (glukagon) i TBST under 20 min. Tvätta två gånger med TBST.
- Inkubera med insulin eller glukagon primär antikropp under 15 minuter. Tvätta två gånger med TBST.
- Insulin: Inkubera objektglasen i biotinylerad get anti-marsvin vid 1:300 utspädning i 30 minuter. Tvätta två gånger med TBST. Inkubera med standard vector ABC-AP-reagens under 30 minuter. Tvätta två gånger med TBST.
- Glukagon: Inkubera objektglasen i buffert under 30 minuter följt av get-anti-mus-alkaliskt fosfatas (AP)-polymer i 30 minuter. Tvätta två gånger med TBST.
- Även bilder inkuberas i konjugat, värma LPR bufferten till rumstemperatur. Tillsätt 1 droppe vätska permanent röd (LPR) per 3 ml buffert omedelbart före användning och placeras i Dako reagensställningen. Inkubera objektglasen i LPC i 4 minuter. Tvätta två gånger med vatten.
- Inkubera objektglasen i hematoxylin under 1 minut. Skölj två gånger med vatten.
- Inkubera objektglasen i TBS pH 7,6 under 1 minut. Skölj två gånger med vatten.
- Inaktivera bilder från DAKO Autostainer.
- Omedelbart torka objektglasen färgats för pankreaspolypeptid. För alla dubbla färgade bilder, torka i minst 1 timme torka då.
7. Dehydratisering
- Placera objektglasen i 80% etanol under 1 minut.
- Doppa objektglasen i 95% etanol. Håll bilder i 95% etanol i 30 sekunder.
- Överför bilder till 100% etanol och håll ned 1 minut. Upprepa.
- Dip bilder i xylen.
- Håll bilder i xylen under 1 minut. Upprepa.
- Omedelbart montera täckglas på objektglas med Cytoseal.
8. Slide Märkning
- Ange informationen fallet identifiering, inklusive orgel och blocknummer, bets, och datum och tryck. Serienummer avsnitt nummer är frivilligt för de första slide fläckar i varje block. Efterföljande nivåer är betecknade med numrering.
- Placera etiketter på bilder.
9. Diabilder
- Placera färgade bilder i scanner bricka och scanna efter instrumentering.
- Ordna bilder med givare och vävnadstyp (pankreas huvud, kropp, svans, mjälte).
- Arkivera färgade objektglasen vid rumstemperatur och eventuellt kvarvarande ofärgade objektglas vid -20 ° C tills de användes.
10. Representative Resultat
Dessa färgningsförfaranden utvecklades för JDRF Nätverket för givare bukspottkörtel orgel med Diabetes (nPOD) för att ge baslinjen karakterisering av paraffin och färska frysta block. Varje givare har en baslinje karakterisering utförs består av färgning 2 kvarter från varje bukspottkörteln region (huvud, kropp och svans) och mjälte (Figur 1, se även mål inlämningsformuläret, bilaga 1). H & E-färgning genomfördes med användning av en Autostainer programmeras som en klinisk anläggning med klinisk kvalitet lösningar som används genomgående. Som ytterligare givare block är sektioneras, har varje en bild tagen för H & E för att visa vävnadsmorfologin. När block är sektioneras igen, som för distribution till utredare, kommer djupare nivåer har också diabilder tagna för representativa H & E bilder för att dokumentera hela blocket vävnad morfologi samt numrering seriella sektioner på varje nivå. Färgade objektglasen är märkta medVid identifiering, bukspottkörtel region, blocknummer, bets och datum (Figur 2) och skannas in i online-patologi informationshanteringssystem. Representativa bilder från en kontroll donator visas i figur 3 vid både låga och höga förstoringar för att visa förväntade resultaten av detta förfarande. Sliden färgades med pankreatisk polypeptid (d, H) analyserades på en annan dag med analysen genomfördes manuellt och visar minskad nedfläckning intensitet hematoxylin motfärg. Skillnader i färgningsintensitet av primära antikroppar eller Motfärga mellan analyser skall undvikas speciellt om du använder bildanalys annat glider att det krävs individuella färgkorrigering för att uppnå samma cell områden eller räknas.
Varje laboratorium bör räkna med att optimera antikropps koncentrationer sats-till-många variation och andra reagenser och förhållanden kan påverka färgning intensitet och specificitet. Med förvärv av nya REAgents är färgningsförfaranden valideras med kända positiva och negativa kontrollprover att uppnå samma grad av färg intensitet med tidigare reagenser. Ytterligare antikroppar optimerades i det nPOD patologin kärnan ges i tabell 2 som en referenskälla och har använts för multilabeling immunfluorescensanalyser för konfokal mikroskopi.
Figur 1. Dako färgning nätet. Detta schema visar en rutinanalys från en nPOD donator bukspottkörteln utförs på ett Dako Autostainer. De nPOD givarna är kodade med en 4-siffrigt identifikationsnummer. Två bildspel brickor visas med bilder som anordnas av fläcken. Alternativa bildspel konfigurationer förväntas beroende på antalet givare bilder. Positiva kontroller omfattar införandet av en känd positiv donator för de två dubbla fläckar och givare mjälte för Ki-67 och CD3. Negativa kontroller är två och inkluderar två SLIdes från en donator pankreas blocket inkuberades med immunglobulin (Ig) från värdarten av de primära antikropparna och två objektglas från donator mjälte för insulin och glukagon.
Figur 2. Representant dubbla färgade bilden. En typisk färdig bild visas med parametrar bildspel märkning och vävnader placering innan digital scanning utförs.
Figur 3. Representant H & E och IHC fläckar i bukspottkörteln sektioner. § från bukspottkörteln hos en vuxen hona organdonator (6096-04 Panhead) färgades och digitala utförda skanningar som beskrivs i protokollet. Bilder erhölls med användning av ImageScope betraktelseprogrammet för hela sektionen (AD) och från en ö (EH). De förväntade ö fläcken intensiteter för insulin, glukagon och pankreaspolypeptid ärobserverades för sektionerna BD som sektion D linjera att denna pankreas huvud block innehåller en liten del av uncinate regionen eller ventrala pankreatisk lob som alla öar innehåller huvudsakligen pankreatiska polypeptiden-positiva celler. Observera att hematoxylin motfärg i panel D är för ljus medan hematoxylin Motfärga intensiteter i B och C är optimala. Panelerna EH visar en ö av den dorsala loben med den förväntade fördelningen av p-celler och α-celler. Några pankreatisk polypeptid celler finns i den nedre vänstra delen av ö (H). A, E-H &E; B, F-Ki67 + insulin, C, G-CD3 + glukagon; d, H-pankreatisk polypeptid. AD, 0,2 x, EH-12,8 X.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Standardisering av IHC förfaranden är kritisk för bildanalys, speciellt vid användning av dator-baserade algoritmer i stora mängder glider över tiden. IHC färgning som beskrivs i denna rapport kan parti analys av en viss givares prover med en Autostainer inom en 8-timmars arbetsdag och ändras från en tidigare rapport 5. Digitaliserade hela glaset bilder av varje färgade bild görs tillgänglig för nPOD-anslutna utredare genom det webbaserade online-patologi system. Utredarna kan granska givare demografi, data laboratorium och annan relevant klinisk historia tillsammans med bilderna och kan välja block mest lämpade för sina studier (se http://www.jdrfnpod.org/online-pathology.php för mer information) . Ett sådant nätet patologi systemet fungerar som en "virtuell biobanken". En ytterligare förbättring av detta system kommer att genomföras whefaldig bildspel etiketter innehåller en streckkod för att spåra seriella sektioner och nivåer för varje block med en eventuell mål 3-D rekonstruktion av bukspottkörteln.
De två dubbla färgningsförfaranden har främst valt att bestämma ö β-cellkomposition (insulin) i samförstånd med cellulär replikation (Ki-67) med tanke på vikten av att förstå mekanismer för vuxna β-cell förnyelse i typ 1-diabetes 5,6. Eftersom den andra dubbla IHC-analysen utförs på seriesnitt till den första är varje skär kännetecknad både β-cell (insulin) och α-cellkomposition (glukagon). Dessutom är närvaron av T-lymfocyter (CD3) bestäms i samband med α-cell-färgning av två huvudsakliga skäl. Basis av T-cellsmedierad autoimmunitet i progressionen av typ 1-diabetes har tydligt inses ännu beskaffenheten av de initierande medel (virus-, bakterie-, inflammatoriska celler) eller sammansättningen av den kroniska infiltrat med Resulviktigt β-cell dysfunktion och död har ännu inte definieras (över 7,8). Andra givare med typ 1-diabetes har en väl karakteriserad brist på p-celler så att kombinationen av CD3 och fläckar glukagon garanterar identifiering av öar, även om β-celler förlusten är svår 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Författarna tackar givarna familjer och orgeln organisationer för tillvaratagande inblandade i denna forskning och Emily Montgomery, Robert Pietras, Ann Fu, Mitali Agarwal och Roshan Agarwal för deras experthjälp. Detta arbete har finansierats av Juvenile Diabetes Research Foundation (MC-T.) till stöd för nätverket för givare bukspottkörtel Organ med diabetes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30% Hydrogen Peroxide (H2O2) | Fisher Scientific | H325-500 | Endogenous peroxidase blocking |
| ABC-Alkaline Phosphatase (AP) | Vector Laboratories | AK-5000 | AP conjugate |
| Antibody Diluent | Invitrogen | 003218 | Primary antibody |
| Avidin blocker | Vector Laboratories | SP-2001 | Block endogenous biotin |
| Biotinylated Goat anti-guinea pig | Vector Laboratories | BA-7000 | Secondary antibody |
| Bluing Reagent | Fisher Scientific | 7301 | Leica autostainer |
| Citrate buffer, pH 6.0 | BioGenex | HK086-9K | Antigen retrieval |
| Clarifier 1 | Fisher Scientific | 7401 | Leica autostainer |
| Cytoseal XYL | Fisher Scientific | 8312-4 | Coverslip mountant |
| DAB | Vector Laboratories | SK-4100 | HRP chromogen |
| DEEB | Dako | S2003 | Endogenous AP blocking reagent |
| Eosin Y Alcoholic | Fisher Scientific | 71204 | Leica autostainer |
| Ethanols- 100%, 95%, 90%, 70% | Fisher Scientific | Various | Deparaffinization and coverslipping |
| Hematoxylin | Dako | S3301 | Dako autostainer |
| Hematoxylin 7211 | Fisher Scientific | 7211 | Leica autostainer |
| IgG (all host species for primary antibodies) | Various | Various | Negative controls for primaries |
| Liquid Permanent Red (LPR) | Dako | K0640 | AP chromogen |
| Mach2 AP | Biocare Medical | MALP521L | Goat anti-Mouse AP conjugate |
| Mach2 HRP | Biocare Medical | MHRP520L | Goat anti-Mouse HRP conjugate |
| Mach2 HRP | Biocare Medical | RHRP520L | Goat anti-Mouse HRP conjugate |
| Methanol | Fisher Scientific | Various | H2O2 diluent |
| Normal goat serum | Vector Laboratories | S-1000 | IHC blocking reagent |
| Sniper | Biocare Medical | BS966M | IHC blocking reagent |
| TBST 20X | Thermo Fisher Scientific, Inc. | TA-999-TT | IHC buffer |
| Triology 20x | Cell Marque | 920P-06 | Antigen Retrieval |
| Xylene | Fisher Scientific | Various | Deparaffinization and coverslipping |
| Table 1. Specific reagents. | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraffin | |||
| Amylase | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-46657 | Mouse |
| Amylin | Serotec | MCA11267 | Mouse |
| Carbonic anhydrase 19.9 | Abcam | ab15146 | Mouse |
| Caspase-3, cleaved | Cell Signaling Technology | 9961 | Rabbit |
| CD20 | Dako | M0755 | Mouse |
| CD3 | Dako | A0452 | Rabbit |
| CD34 | Cell Signaling Technology | 3569 | Mouse |
| CD4 | Dako | M7310 | Mouse |
| CD45 | Dako | M0754 | Mouse |
| CD68 | Dako | M0876 | Mouse |
| CD8 | Dako | M7103 | Mouse |
| Chromogranin A | Dako | A0430 | Rabbit |
| CK17 | Dako | M7046 | Mouse |
| CK19 | Dako | M0772 | Mouse |
| CK7 | Dako | M7018 | Mouse |
| C-peptide | Cell Signaling Technology | 4593 | Rabbit |
| Foxp3 | e Bioscience | 14-4776-80 | Rat |
| Ghrelin | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-10386 | Goat |
| Ghrelin | Abcam | ab85104 | Rabbit |
| Glucagon | Dako | A0565 | Rabbit |
| Glucagon | Abcam | ab10988 | Mouse |
| Glucagon | Bachem | T-5037 | Guinea Pig |
| Glut-1 | Abcam | ab40084 | Mouse |
| Glut-2 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-9117 | Rabbit |
| Insulin | Dako | A0564 | Guinea Pig |
| Ki-67 | Dako | M7240 | Mouse |
| Mafa | Novus Biological | NB400-137A | Rabbit |
| Pancreatic polypeptide | Invitrogen | 18-0043 | Rabbit |
| Pdx-1 | Abcam | ab47308 | Guinea Pig |
| Proinsulin | Novocastra | NCL-proin-1G4 | Mouse |
| Proinsulin | Developmental Studies Hybridoma Bank | GS-9A8 | Mouse |
| Secretagogin | Sigma-Aldrich | HPA 006641 | Rabbit |
| Smooth muscle actin | Abcam | ab5694 | Rabbit |
| Somatostatin | Dako | A0566 | Rabbit |
| Synaptophysin | Dako | M0776 | Mouse |
| Fresh Frozen | |||
| CD11b | Abcam | ab6332 | Rat |
| CD11c | Serotec | AHP1226 | Rabbit |
| CD25 | Novus Biological | NB 600-564 | Mouse |
| CD94 | Abcam | ab61874 | Mouse |
| GAD65 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-130569 | Mouse |
| HLA-ABC | Dako | M0736 | Mouse |
| Table 2. Primary antibodies. | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aperio Scanscope CS | Aperio Technologies | Digital slide scanner | |
| DAKO Autostainer Plus | Dako | IHC stains | |
| Label Matrix printing software | BioCarta | LM7UP57 | Slide label software |
| Leica XL Autostainer | Leica Microsystems | H&E stains | |
| Premium Coverglass | Fisher Scientific | 12-548-5J | Coverslip |
| Spectrum Information Manager | Aperio Technologies | Scanner software | |
| Superfrost Plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | Positively charged slides |
| Vegetable steamer | Black and Decker | Various | Antigen retrieval |
| Zebra TLP 3742 | CDWG | TLP3742 | Slide label printer |
| Table 3. Specific supplies and equipment. | |||
References
- In't Veld, P., Marichal, M. Microscopic anatomy of the human islet of Langerhans. Adv. Exp. Med. Biol. 654, 1-19 (2010).
- Matveyenko, A. V., Butler, P. C. Relationship between beta-cell mass and diabetes onset. Diabetes Obes. Metab. 10, Suppl . 4. 23-31 (2008).
- Saisho, Y. Pancreas volumes in humans from birth to age one hundred taking into account sex, obesity, and presence of type-2 diabetes. Clin. Anat. 20, 933-942 (2007).
- Hruban, R. H. Pancreatic intraepithelial neoplasia: a new nomenclature and classification system for pancreatic duct lesions. Am. J. Surg. Pathol. 25, 579-586 (2001).
- Campbell-Thompson, M. Pancreatic adenocarcinoma patients with localised chronic severe pancreatitis show an increased number of single beta cells, without alterations in fractional insulin area. Diabetologia. 52, 262-270 (2009).
- Meier, J. Beta-cell replication is the primary mechanism subserving the postnatal expansion of beta-cell mass in humans. Diabetes. 57, 1584-1594 (2008).
- Rowe, P. A., Campbell-Thompson, M. L., Schatz, D. A., Atkinson, M. A. The pancreas in human type 1 diabetes. Semin. Immunopathol. 33, 29-43 (2011).
- Veld, I. n't, P, Insulitis in human type 1 diabetes: The quest for an elusive lesion. Islets. 3, 131-138 (2011).
- van Belle, T. L., Coppieters, K. T., von Herrath, M. G. Type 1 diabetes: etiology, immunology, and therapeutic strategies. Physiol Rev. 91, 79-118 (2011).
