Summary
ووصف طريقة لتحميل subventricular منطقة (SVZ) الخلايا مع الأصباغ الكالسيوم مؤشر لنشاط الكالسيوم التسجيل. وSVZ بعد الولادة يحتوي على خلايا معبأة بإحكام بما في ذلك الخلايا العصبية والسلف neuroblasts. بدلا من استخدام حمام التحميل حقن الصبغة عن طريق فإننا الضغط داخل الأنسجة مما يسمح نشر أفضل صباغة.
Abstract
منطقة subventricular (SVZ) هي واحدة من المنطقتين العصبية في الدماغ بعد الولادة. ويحتوي على خلايا SVZ المزدحمة بالسكان، بما في ذلك الخلايا العصبية السلف مع ميزات نجمي (وتسمى الخلايا النجمية SVZ)، neuroblasts، والخلايا الاولية وسيطة. Neuroblasts ولد في SVZ ترحيل عرضية مسافة كبيرة على البصلة الشمية، حيث أنها تفرق في interneurons. إشارات بين الخلايا من خلال جزيئات الالتصاق وإشارات إنتشاري تلعب أدوارا هامة في تكوين الخلايا العصبية مسيطرة. كثير من هذه الإشارات بين الخلايا يؤدي النشاط الكالسيوم التي تنقل المعلومات داخل وبين الخلايا. النشاط الكالسيوم وبالتالي هو انعكاس لنشاط خارج الخلية إشارات وهي الطريقة المثلى لفهم الإشارات بين الخلايا الوظيفية بين خلايا SVZ.
وقد تمت دراسة نشاط الكالسيوم في العديد من المناطق الأخرى وأنواع الخلايا، بما في ذلك الخلايا النجمية والخلايا العصبية الناضجة. ومع ذلك، فإن الطريقة التقليدية لمبناهاكان د مع الكالسيوم خلايا الصبغة مؤشر (أي تحميل حمام) ليست فعالة في تحميل جميع أنواع الخلايا SVZ. والواقع أن الكثافة الخلوية في SVZ يمنع نشر الصبغة داخل الأنسجة. وبالإضافة إلى ذلك، سوف إعداد شرائح سهمي الحفاظ على أفضل ترتيب ثلاثي الأبعاد من الخلايا SVZ، ولا سيما تيار الهجرة أرومة عصبية على المحور منقاري-الذيلية.
هنا، نحن تصف طرق لإعداد أقسام السهمي الذي يحتوي على SVZ، التحميل من خلايا الصبغة SVZ مع مؤشر الكالسيوم، واكتساب النشاط الكالسيوم مع مرور الزمن الأفلام. كنا فلوو-04:00 صبغ الخلايا النجمية لتحميل التطبيق الخاص SVZ الضغط داخل الأنسجة. تم تسجيل النشاط الكالسيوم باستخدام مجهر المسح مبائر يسمح قرار دقيقة لتمييز الخلايا الفردية. نهجنا ينطبق على مناطق أخرى العصبية بما في ذلك منطقة قرن آمون والكبار جزئي التحبب المناطق العصبية الجنينية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن لأنواع أخرى من الأصباغأن يطبق باستخدام الطريقة الموصوفة.
Protocol
1. إعداد حلول، تشريح، وVibratome
- يجب أن يكون مستعدا الحلول في الأسمولية الصحيح ودرجة الحموضة (الجدول 1). مقارنة السائل النخاعي الاصطناعي (ACSF)، على استعداد حل تشريح مع انخفاض تركيزات الصوديوم والكالسيوم، وتركيزات أعلى من المغنيسيوم. هذا هو لتقليل آثار السامة للاعصاب خلال تشريح.
- يجب مشبعة كل الحلول وتشريح ACSF مع 95٪ O 2/5٪. CO 2 بواسطة محتدما لا يقل عن 10 دقيقة للوصول إلى درجة الحموضة المطلوبة قدرها 7.3
- يعد حمام جليدي في علبة. وضع لوحة تشريح في حمام جليدي وملء مع الحل تشريح. فقاعة لوحة التشريح.
- إعداد vibratome من خلال خلق حمام جليدي. وضع الطبق في الحمام تقطيع الجليد، وملء الطبق مع حل تشريح، وفقاعة.
- ملء مع شريحة عقد غرفة ACSF وفقاعة لضمان تهوية كافية والحل بغض النظرمن حيث توضع شرائح.
2. إزالة أنسجة المخ
شرائح الدماغ الحادة تميل إلى أن تكون أصغر سنا صحة مع الفئران. الهيكل SVZ بعد الولادة والخلوية في القوارض ناضجة حول يوم بعد الولادة (P) 20 1. ولذلك، فإننا في محاولة للحد من تجاربنا الأعمار من الماوس P30-P20 ولكن قمنا بإجراء التجارب الناجحة في الفئران قديمة قدم 3 أشهر. في جميع أنحاء التعامل مع من الأنسجة، ويجب على المرء أن يكون منتبها للحد من الحركات الميكانيكية والضغط على الدماغ، والحفاظ على الظروف المبردة، وفضح SVZ إلى حل في أسرع وقت ممكن التضحية التالية.
- بعد حقن بنتوباربيتال، ومقطوعة الرأس بسرعة الماوس. تتم إزالة الفراء ومصنوعة من خلال شقوق قاعدة الجمجمة. ثم يتم وضع الرأس في علبة مليئة حل تشريح.
- في حين استقرار الرأس مع ملقط، يتم إجراء تخفيضات مستمرة حول الجمجمة وأحيانا خط الوسط مع microscissors. أن تحرص على تقليل اتصال مع الأنسجة. منذ البصلة الشمية هي الوجهة النهائية من الخلايا العصبية الوليد من SVZ، لا بد من أن تضع في اعتبارها الحفاظ على تلك المنطقة، وخصوصا خلال إزالة العظام حول هذه المنطقة. وينبغي خفض Microscissor التي صدرت حول الجمجمة تكون على الجانب الظهري، للسماح لإزالة سهلة من الجمجمة.
- يتم فصل الآن إزالة الجمجمة التي تغمر الدماغ من العظام تحت الدماغ. إذا تم إجراء تخفيضات في الخطوة السابقة بشكل صحيح، يمكن إزالة هذه العظام بسهولة المغطي مع ملاقط أو ملقط.
- مع الاستمرار في الضغط على الرأس مع ملقط، يمكن للمرء استخدام شفرة جراحية لإزالة نظيفة عدة قطع من أنسجة المخ قبل التقطيع، مثل التالية. ويمكن إجراء قطع الاكليلية على مستوى امدا. ويمكن إجراء تخفيضات السهمي على جانبي الدماغ الجانبية للSVZ. ومن شأن تقدير متحفظ يكون ~ 2.5 ملم من خط الوسط. إذا رغبت في ذلك، يمكن أيضا أن المخ hemisected هنا. وهذه التخفيضات على حد سواء FACILإيتات المتصاعدة من الأنسجة ويسمح بلغ SVZ بسرعة أكبر عندما الدماغ تشريح. من المهم أن نتذكر أن بذل الحد الأدنى من القوات الميكانيكية على الدماغ (مثل عدم دفع أو سحب).
3. إعداد شريحة الدماغ الحادة
- للتحضير لخطوات لاحقة، تأكد من أن تستخدم الغراء سوبر لتركيب الأنسجة خالية من السدادات وعلى استعداد لتطبيقه على لوحة vibratome. من المهم أن تذهب في أسرع وقت ممكن دون الإضرار بالمخ.
- يمكن للأنسجة المخ بعد ذلك مغروف من تحت، والذي يفصل بين الأنسجة من العظام الكامنة في وقت واحد في حين فصل الأعصاب.
- هي التي شنت في الأنسجة ولصقها على لوحة وضعت على vibratome. نظرا لتشريح منقاري، الذيلية للSVZ، فقد ركزنا على جعل شرائح سهمي كما يحافظ على مسار هجرة neuroblasts، وغمد الدبقية، والأوعية الدموية التي تتماشى إلى حد كبير في هذا الاتجاه. يمكن للمرء إما موالاتحاد الوطني للعمال النسيج في خط الوسط أو على سطح مستو خلق بجعل تخفيضات السهمي الجانبي إلى SVZ. خطوة اختيارية هو وضع كتلة الاغاروز 3٪ وراء الأنسجة لتكون بمثابة دعامة للشفرة وشرائح تؤتي ثمارها. كنا تفضيلي CYANOACRYLATE القائمة على الغراء عظمى.
- شطف شفرة مع الايثانول لإزالة الزيوت وشطف مع الماء المقطر. وضع شفرة على حامل النصل. تحميل صاحب شفرة لvibratome.
- ضبط إعدادات vibratome لخفض الأنسجة في سمك 250-350 ميكرون في شريحة. من المهم لخفض الاهتزازات باستخدام الترددات العالية والمنخفضة السرعة.
- القسم تدريجيا من خلال الأنسجة. ظهور البصلة الشمية يعد مؤشرا جيدا أن واحدا بالقرب من SVZ في شرائح السهمي وشرائح الأكثر الجانبي سوف تحتوي المنطقة لا. معالم أخرى للبحث عن تشمل البطين وسماكة في الجسم الثفني، الذي يقع تحت وSVZ. سوف تظهر أولا في SVZ سقيت أكثر الجانبيةتل شرائح. سوف تظهر في RMS شرائح السهمي وسطي.
- إزالة شرائح تحتوي على SVZ مع ماصة باستور البلاستيك مع طرف قطع. نقل إلى غرفة شريحة القابضة. نحصل على كثير من الأحيان أكثر مما كنا شرائح يمكن استخدامها في يوم عمل. ومع ذلك، سوف تختلف شرائح على كمية من الخلايا التي تحتوي على SVZ. فمن الضروري في بعض الأحيان أن ننظر من خلال عدة شرائح العثور على واحد المطلوب للتصوير.
4. إعداد المجهر والأصباغ
شرائح تتطلب فترة حضانة ساعة واحدة في ACSF للتعافي من تشريح وتقطيع. لا يمكن أن يؤديها عدة خطوات خلال هذه الفترة شريحة الانتعاش.
- إعداد ماصات لصبغ الكالسيوم و / أو تطبيق المخدرات
- ماصات زجاجية الحاجة إلى وجود طرف من 2-3 ميكرومتر في القطر وطول الحافة (~ 2 مم) والزاوية (16 ° ~ لصاحب ماصة) الذي يمنع الاتصال مع غرفة نضح ويسمح مجال لوضعالهدف.
- يمكن للمرء أن يعد عادة ماصات الضغط 6-8 عن كل يوم من التجارب.
- الكالسيوم صبغة إعداد
- الحل عند إعداد العمل (4-5 ميكرومتر بواسطة حمام، 250 ميكرومتر من خلال تطبيق الضغط)، فمن الأفضل لفضح الحد الأدنى من DMSO إلى الخلايا. ويمكن تحقيق هذا من خلال جعل الأسهم عالية التركيز. على سبيل المثال، لفلوو-4، يتم استخدام أنبوب واحد يحتوي على 50 ميكروغرام في اليوم الواحد. يمكن للمرء أن مخزون ملي 10 من هذه قسامة عن طريق إضافة 4.6 ميكرولتر من حل بلورونيك F-127 20٪ في DMSO.
- إعداد الإعداد المجهر (الشكل 2).
- وقد ساعد استخدام مضخة تمعجية لتدفق حل تقليل الانجراف الصورة. تشغيل مضخة تمعجية قبل السماح لتشغيل ACSF من خلال خطوط نضح وضمان أن تكون فقاعة خالية.
- تعيين مدخل أنبوب على غرفة نضح وضمان عدم وجود تسرب.
- وضع تلميح إلى فراغ ENSلدى عودتهم والذي يتم يستنشق الحل من غرفة نضح. ضمان أن تكون في مستوى كاف بحيث يتم غمر الهدف على مسافة والصحيح العمل، ولكن ليست عالية جدا بحيث يمكن أن تتطور حل مجلس النواب. وهناك مستوى منخفض من الحل أيضا تقليل التشوهات التدفق. ويمكن أيضا التطلع المستمر يمكن التحقق من خلال الاستماع للالثبات.
5. صبغ تحميل
وقد وصفت هذه الطريقة بالتفصيل في آخر مخطوطة 2. الرجاء مراجعة الأرقام فيها.
- حمام الصبغة التحميل
- جعل حل مل 1-2 يعمل من الصبغة. لفلوو-4 AM، بتركيز 4-5 ميكرومتر كافية لوصفها neuroblasts SVZ.
- ونقلها أولا إلى شرائح طبق الثقافة 35 مم أسفل مع شبكة أن يتم تعبئة بالفعل مع ACSF. استبدال الحل باستخدام البلاستيك نقل 3 مل ماصة لإزالة بلطف ACSF، في حين اضاف في وقت واحد جalcium صبغة العمل الحل.
- احتضان في C ° 37 ل 30-60 دقيقة في بيئة CO 5٪ الغاز التي تسيطر عليها 2.
- ضع شريحة العودة الى غرفة مليئة ACSF عقد ليغسل الصبغة التي لم تدخل الخلايا. بدلا من ذلك، يمكن للمرء أن وضعه مباشرة على غرفة نضح المجهر الذي يقوم بتشغيل ACSF. هذه الفترة هو غسل 30-45 دقيقة.
- نقل شريحة إلى غرفة نضح.
- تطبيق ضغط صبغ
- نقل شريحة من غرفة إلى غرفة عقد نضح على الإعداد المجهر.
- ملء ماصة الزجاج بمحلول العمل التي هي 250 ميكرومتر ومكان على مياداة مجهرية.
- تخفيض ماصة للمنطقة التي تهم. يمكن وضعها بحيث ماصة الحافة إما ميكرومتر عدة فوق سطح شريحة أو دفن عدة ميكرومتر تحت سطح شريحة، ولكن بعيدا عن المنطقة المسجلة. لم زاوية ماصة لا affeCT كفاءة التحميل. عندما التصوير تحت سطح شريحة، نجد أن وضع تلميح ماصة تحت تسمية طائرة التصوير سوف منطقتنا التصوير المطلوب على نحو أفضل.
- تعيين عند ممارسة الضغط الصبغة، وPicospritzer بحيث يكون <3 رطل. تطبيق الضغط أننا لم تقدر حجم انتشار الصبغة، لأن هذا يخضع لتباين القطر تلميح ماصة، وكثافة الأنسجة حيث يتم حقن الصبغة. نحن ببساطة تطبيق حتى نحقق المطلوب التحميل لدينا وفقا لتقييم العين. تقليل الأضرار التي لحقت شريحة أثناء التطبيق، وخصوصا عندما يتم وضع الطرف تحت سطح شريحة. تطبيق لمدة 1-2 دقيقة. تطبيقات المتكررة في بعض الأحيان ضرورية اعتمادا على وضع العلامات وفقا لتقييم العين. لهذا التركيز ومدة التطبيق، نجد أن تطبيق سطح صبغ تصف تفضيلي neuroblasts بينما تحت السطح تطبيق تسميات تفضيلي الخلايا النجمية. ومع ذلك، سوف> تطبيق حد أدنى 3 في 500 ميكرومتر أيضا تسمية neuroblastsبغض النظر عن ما إذا كان الطرف هو فوق أو تحت سطح شريحة (JC Platel، والمراقبة غير منشورة). السماح للغسيل والانتعاش لمدة 30-45 دقيقة شريحة.
6. مبائر التصوير النشاط الكالسيوم
- العثور على المنطقة من الفائدة الأولى مع الهدف أقل قوة مثل 4X أو 10X. وضع في وسط الميدان قبل أن ينتقل إلى هدف أعلى سلطة. عند هذه النقطة، يمكن للمرء أن تقييم الصحة العامة شريحة بالإشارة إلى ظهور الخلايا تحت SVZ النقيض التدخل التفاضلية (DIC). تظهر الخلايا السليمة مستديرة وممتلئ الجسم. وبالإضافة إلى ذلك، سوف تعرض الخلايا السليمة خافت فلوو-4 تحميل والمفترض أن لا التحميل في مضان كل أو مشرق (خلية الموت).
- خفض الهدف المياه الغمر على المنطقة من الفائدة، التي هي الآن صبغ محملة. وكان الهدف إما 40X 60X أو كافية لتلبية احتياجاتنا، على الرغم من 40X يوفر أوسع مجال الرؤية ويسمح للوصول أكبر ماصة. عندما تحت التصويرالسطح، ونحن غالبا ما تذهب لا يقل عن 15 ميكرون تحت سطح شريحة حيث يتم الاحتفاظ أفضل بنية 3-dimentional والصحة الخلية.
- تحقق من أن نضح والفراغ تعمل بشكل كاف.
- إعداد المجهر حتى يتم تعيين هذا القرار مرور الزمن والتحليل المكاني لمعدلات المطلوب. للفحص المجهري متحد البؤر، يجب أن يكون متوازنا هذه العوامل كزيادة في القرار الزمنية يؤدي عادة إلى فقدان القرار المكانية نظرا لطبيعة المسح الضوئي للنظام. للنشاط الكالسيوم، وتصوير لدينا حوالي الإطار كل ثانية مع دقة 512x512 بكسل. إذا حصلت بشكل منفصل قنوات متعددة ضرورية، وهذا يؤثر أيضا على أسعار الشراء. تعيين مدة الفيلم (2-10 دقائق).
- بدء تشغيل. إذا إجراء الدراسات الدوائية، وغسل على الخصوم أو منبهات غير مزيل للتحسس لمدة لا تقل 5-10 دقيقة، ثم قم بإجراء فيلم آخر من 5-10 دقيقة. يمكن منبهات التي قد توعي المستقبلات تطبيق تماما، مثل باستخدام العلاقات العامةessure ماصة يسيطر عليها مياداة مجهرية.
7. تحليل الكالسيوم
تحليل يلي الإجراءات القياسية التي وصفناها في منشورات الأسبق 2-4. F 0 (أي خط الأساس) وF هي شدة يعني مضان قياس في جميع المناطق ذات الاهتمام (رويس) وفي كل ROI، على التوالي. واعتبر أي تغيير في مضان أن تكون الزيادة + CA 2 إذا كان> 15٪ F / F 0 الزيادة. تم حساب الخلايا التغييرات الكالسيوم + 2 باستخدام Calsignal 5.
8. ممثل النتائج
لقد تمكنا من الحصول على التحميل الانتقائي للخلايا SVZ اعتمادا على بروتوكولات التحميل الصبغة المذكورة أعلاه وغيرها 2-4،6. تحميل حمام أو تطبيق الضغط على سطح شريحة من التسميات فلوو-4 (4-5 ميكرومتر أو 250 على التوالي) في الغالب neuroblasts AM. بينما يمكن تطبيق ضغط تحميل neurobيستمر التحميل بسرعة أكبر من حمام في شريحة واحدة، تحميل حمام يسمح للتحميل في وقت واحد من شرائح متعددة. نؤكد هوية الخلايا وصفت بأنها neuroblasts من (1) ما إذا كانت السلوك المهاجرة عرض 4،7، (2) من التشكل، (3) تلطيخ السلبية للsulforhodamine 101، وصبغ نجمية محددة 3 أو (4) تلطيخ إيجابية مع DCX-DsRed التعبير (JC Platel، والمراقبة غير منشورة). Neuroblasts ترحيل بسرعة (المتوسط 60 ميكرون / ساعة) في درجة حرارة 4،7-9 الفسيولوجية، ولكن يمكن بسهولة ملاحظة حركتهم حتى في درجة حرارة الغرفة. حركة neuroblasts لا يشكل مشكلة بالنسبة لوضع المناطق في المصالح (ROI) لتتبع نشاط الكالسيوم منذ أفلامنا وعادة ما تكون في مدة قصيرة. ومع ذلك، وخلال فترات الانتظار الطويلة، مثل المخدرات خلال تبادل الحل، يجب أن نكون حذرين المحققين لمباراة رويس في السيطرة وفترات العلاج. ليس من غير المألوف لneuroblasts إلى الهجرة داخل أو خارج من أنا مجال maging أو البؤري.
تطبيق ضغط فلوو-4 AM (250 ميكرون) في عمق شريحة ومحدودة المدة (<2 دقيقة) تصف بشكل تفضيلي الخلايا النجمية SVZ 2. تم التحقق من وضع العلامات نجمية وضع العلامات الإيجابية مع 101 sulforhodamine والتشكل، وخاصة من خلال وجود توقعات وendfeet على الأوعية الدموية التي وصفناها في الآونة الأخيرة 3. باستخدام هذه الأساليب، لاحظنا النشاط العفوي في كل من أرومة عصبية SVZ والسكان نجمية (الشكل 1). النشاط في الخلايا النجمية كثيرا ما يأخذ شكل موجات التي تشارك الدم 3 السفينة. وعلاوة على ذلك، وذلك باستخدام التصوير الكالسيوم باعتبارها الفحص، كشفت تطبيق منبهات الدوائية أو تأكيد التعبير عن مستقبلات GABA A الخلايا النجمية وعلى neuroblasts 6، أمبا ومستقبلات NMDA على neuroblasts 4.
أرقام
1 "SRC =" / files/ftp_upload/4071/4071fig1.jpg "/>
الشكل 1. نشر النشاط الكالسيوم في الخلايا النجمية. (A) متوسط الممثل صورة من تسجيل الوقت الفاصل بين النشاط الكالسيوم. تم تحميل الخلايا النجمية في SVZ مع تطبيق ضغط فلوو-04:00 عمق شريحة. تم الحصول الأفلام بنسبة 0.75-حان الوقت الخطوات. المناطق ذات الاهتمام (ROI) يتم وضعها على الخلايا العارضة النشاط. (B) وضعت من آثار على خلايا رويس من الفيلم صورت في (A). تم تصفية آثار مع المتوسط المتحرك وتطبيع. المقياس العمودي يمثل 2 × ΔF / F 0 F حيث هو قوة إشارة وF 0 هو إشارة خط الأساس والمتوسط ΔF = FF 0.
الشكل 2. الغارقة صورة لنظام نضح. واحدة من نهاية أنبوب في O٪ 95 2/5٪ CO 2 ف الغازerfused الحل. وperfused ثم الحل من خلال أنبوب إلى الدائرة وحمام بواسطة مضخة تمعجية (لا يظهر). يتم إدراج الطرف الآخر في مدخل حل للغرفة حمام شنت على منصة. ثم يتم توصيل الطرف الطموح إلى منفذ حل للغرفة وضعت في مستوى لتحديد ارتفاع الحل. من مأخذ، ويرتبط الطرف الطموح إلى خط فراغ، الذي aspirates الحل من غرفة في وعاء النفايات. يظهر نظام نضح قبالة المرحلة المجهر من أجل الوضوح البصري.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد استخدم التصوير الكالسيوم من الخلايا لدراسة أنماط SVZ في النشاط العفوي في neuroblasts 10، مستقبلات التعبير في كل من قناة neuroblasts والخلايا النجمية وموجات 4،6،8 الكالسيوم نجمي 3. منذ الخلايا في SVZ هي غير ناضجة أو لها خصائص الدبقية، فإنها لا تطلق الإمكانيات 11،12 العمل، وهذا يعني أن التغيرات المحتملة في ميلي ثانية واحدة الجهد الإرشادي النشاط في شبكات ناضجة لا ينطبق في هذه المنطقة. ولذلك، واستولت على الأحداث أبطأ الكالسيوم (بناء على أمر من ثانية) ليست فقط ذات مغزى من الناحية البيولوجية، ولكن ربما كان الشكل الأكثر ذات الصلة من النشاط في هذه الخلايا.
يجب أن تضع في اعتبارها المحققين العديد من الخطوات في هذا الإجراء، خاصة فيما يتعلق بالصحة شريحة. صنع غير لائق من الحلول، يمكن أن سوء نوعية المياه (تستخدم في صنع الحلول)، تشريح بطيئة وغير دقيقة، واستخدام شفرات الحلاقة لقطع الأنسجة القذرة جميعا EF ضارةتأثيرات سلبية على النشاط.
فيما يتعلق باستخدام مؤشرات الكالسيوم، في حين ناقشنا فقط استخدام-فلوو 04:00، حاولنا الأصباغ التجارية الأخرى، بما في ذلك ولاية أوريغون الخضراء BAPTA-AM، التي لديها أعلى تحميل خط الأساس من مستوى فلوو-4. اخترنا التركيز على فلوو-4 بسبب مجموعتها أكبر دينامية مقارنة مع الأصباغ الأخرى، ولكن محققين آخرين قد تجد من المفيد الأصباغ المختلفة لتحقيق أغراضهم. قد يكون كل صبغة مختلفة لتقارب بعض أنواع الخلايا. قد التركيز وطريقة التحميل تحتاج إلى تعديل لكل صباغة. كنا تفضيلي الضغط لتسمية الخلايا النجمية التحميل SVZ وأكثر صحة وأعمق الخلايا. وهناك عامل المالية للنظر هو أن استخدام تطبيق الضغط هو أكثر تكلفة من تطبيق الحمام، على الرغم من أن يمكن تجميد محلول الصبغة في ماصة الضغط وإعادة استخدامها في اليوم التالي. بدلا من ذلك، كانت مؤشرات الكالسيوم وراثيا ترميز (GECIs)، مثل GCaMP3، شعبية متزايدة لدراسة النظم الأخرى والبرازيلفي مناطق 13،14. هذه GECIs لديها ميزة طردهم تحت خلية محددة المروجين، ولكن حركية ودينامية المدى هي عموما ليست أفضل من الأصباغ العضوية 15. استخدامها في SVZ بعد الولادة يتطلب أيضا وضع العلامات الفيروسية أو الصعق الكهربائي للبناء، وهذا الأخير يحد من دراسة neuroblasts لفترة الوليد بسبب فقدان البلازميد أثناء انقسام الخلية.
الانجراف شريحة يمنع اقتناء إشارة موثوقة خلال مدة الفيلم وهي واحدة من العقبات التقنية الأكثر تحديا مع الحية التصوير تجارب شرائح الدماغ. يتأثر بها العديد من العوامل بما في ذلك معدل التروية والتنسيب فراغ، الوزن الهدف، و، إن وجدت، التدرجات درجة الحرارة. إذا كان أكبر من 25 ° C درجات الحرارة ضرورية للتجارب، ينبغي للمرء أن يحاول لتسخين حلول وغرف نضح عند أدنى درجة حرارة حيث يمكن معالجة مسائل لها منذ درجات الحرارة قد يؤدي إلى كبيرة، شndesired التركيز الانجراف. يمكن سخانات موضوعية والعبوات ساخنة تساعد أيضا تقليل هذا التأثير، على الرغم من أننا حاولنا السابق دون نجاح يذكر.
منع هذه العقبات التقنية والباحثين لدينا الفرصة لفحص عدد كبير من الخلايا في منطقة ما بعد الولادة النامية. هذا يقدم فرصة لمعالجة النشاط على مستوى السكان، والتي يمكن أن تسفر عن رؤى جديدة في عمليات تنظيم الخلايا العصبية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (DC007681، AB)، CT الخلايا الجذعية منحة (AB)، باردي الأساس (AB)، Predoctoral روث L. كيرشتاين القومي للبحوث الخدمة الجوائز (NRSA) (SZY)، ودراسات عليا أبحاث NSF الزمالة (BL). نشكر أعضاء مختبر Bordey للتعليقات مفيدة على المخطوطة. ويستند المواد الحالية على العمل المدعوم جزئيا من ولاية كونيتيكت تحت الخلايا الجذعية كونيتيكت برنامج المنح البحثية. محتوياته هي الجهة الوحيدة المسؤولة عن أصحابها ولا تعبر بالضرورة عن وجهات النظر الرسمية للدولة من ولاية كونيتيكت، وزارة الصحة العامة في دولة الابتكارات كونيتيكت أو CT، إعلام.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Sigma | S0389 | Dissection: 147 mM ACSF: 0 mM |
| NaCl | Sigma | S9888 | Dissection: 42 mM ACSF: 126 mM |
| KCl | Sigma | P3911 | Dissection: 2.5 mM ACSF: 2.5 mM |
| MgCl2.6H2O | Sigma | M9272 | Dissection: 4.33 mM ACSF: 1 mM |
| NaH2PO4.H2O | Sigma | S8282 | Dissection: 1.25 mM ACSF: 1.25 mM |
| Glucose | Sigma | G8270 | Dissection: 10 mM ACSF: 10 mM |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | Dissection: 26 mM ACSF: 26 mM |
| CaCl2.2H2O | Sigma | C3306 | Dissection: 1.33 mM ACSF: 2 mM |
Table 1. Chemical list and recipes of dissection solution and ACSF. |
|||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vibratome | Leica | VT 1000S | |
| Super Glue | Surehold or 3M | Surehold 3G Super Glue or 3M Vet-Bond | |
| Dissection tools | Roboz or Ted Pella | ||
| Fluo-4 AM calcium-sensitive dye | Invitrogen | F14201 | |
| Oregon Green BAPTA-1 AM calcium-sensitive dye | Invitrogen | O6807 | |
| Pluronic F-127 20% solution in DMSO | Invitrogen | P3000MP | |
| Upright confocal microscope | Olympus | FV300 or FV1000 | |
| Water-immersion objectives | Olympus | LUMPlanFl 40 x W/IR (NA 0.80); LUMPlanFl 60 x W/I (NA 0.90) | |
| Micromanipulators | Sutter | MPC-200/MPC-325/MPC-385 | |
| Pressure controller | Parker Hannifin | Picospritzer | <3 PSI during application |
| Pipette puller | Sutter or Narshige | Sutter P-97 or Narshige PP-830 | |
| Glass pipettes | Sutter | BF150-110-10 | I.D.:1.10, O.D.: 1.50 |
| Peristaltic pump | Harvard Apparatus | Model 720 | flow rate: 1 ml/min |
| Chamber bath | Warner Instruments | RC-26 GLP | Low profile allows for objective clearance |
| Tubing | Tygon | ||
| Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B/344B | |
Table 2. Materials/equipment list. |
|||
References
- Peretto, P., Giachino, C., Aimar, P., Fasolo, A., Bonfanti, L. Chain formation and glial tube assembly in the shift from neonatal to adult subventricular zone of the rodent forebrain. J. Comp Neurol. 487, 407-427 (2005).
- Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. Imaging and recording subventricular zone progenitor cells in live tissue of postnatal mice. Front. Neurosci. 4, 10-3389 (2010).
- Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. Gap junction-mediated calcium waves define communication networks among murine postnatal neural progenitor cells. Eur. J. Neurosci. , (2011).
- Platel, J. C., Dave, K. A., Gordon, V., Lacar, B., Rubio, M. E., Bordey, A. NMDA receptors activated by subventricular zone astrocytic glutamate are critical for neuroblast survival prior to entering a synaptic network. Neuron. 65, 859-872 (2010).
- Platel, J. C., Dupuis, A., Boisseau, S., Villaz, M., Albrieux, M., Brocard, J. Synchrony of spontaneous calcium activity in mouse neocortex before synaptogenesis. Eur. J. Neurosci. 25, 920-928 (2007).
- Young, S. Z., Platel, J. C., Nielsen, J. V., Jensen, N. A., Bordey, A. GABAA increases calcium in subventricular zone astrocyte-like cells through L- and T-type voltage-gated calcium channels. Front. Cell. Neurosci. 4, 8 (2010).
- Bolteus, A. J., Bordey, A. GABA Release and Uptake Regulate Neuronal Precursor Migration in the Postnatal Subventricular Zone. J. Neurosci. 24, 7623-7631 (2004).
- Platel, J., Heintz, T., Young, S., Gordon, V., Bordey, A. Tonic activation of GLUK5 kainate receptors decreases neuroblast migration in a whole mount preparation of the subventricular zone. J. Physiol. (Lond). 586, 3783-3793 (2008).
- Nam, S. C., Kim, Y., Dryanovski, D., Walker, A., Goings, G., Woolfrey, K., Kang, S. S., Chu, C., Chenn, A., Erdelyi, F., Szabo, G., Hockberger, P., Szele, F. G. Dynamic features of postnatal subventricular zone cell motility: a two-photon time-lapse study. J. Comp. Neurol. 505, 190-208 (2007).
- Lacar, B. L., Platel, J. C., Bordey, A. GABA controls Ca2+ activity-dependent network synchrony in the adult neurogenic forebrain. Neuroscience Meeting Planner, San Diego, CA, , Society for Neuroscience. (2007).
- Liu, X., Bolteus, A. J., Balkin, D. M., Henschel, O., Bordey, A. GFAP-expressing cells in the postnatal subventricular zone display a unique glial phenotype intermediate between radial glia and astrocytes. Glia. 54, 394-410 (2006).
- Wang, D. D., Krueger, D. D., Bordey, A. Biophysical properties and ionic signature of neuronal progenitors of the postnatal subventricular zone in situ. J. Neurophysiol. 90, 2291-2302 (2003).
- Tian, L., Hires, S. A., Mao, T., Huber, D., Chiappe, M. E., Chalasani, S. H., Petreanu, L., Akerboom, J., McKinney, S. A., Schreiter, E. R., Bargmann, C. I., Jayaraman, V., Svoboda, K., Looger, L. L. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).
- Zhao, Y., Araki, S., Wu, J., Teramoto, T., Chang, Y. F. An expanded palette of genetically encoded Ca(2) indicators. Science. 333, 1888-1891 (2011).
- Shigetomi, E., Kracun, S., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. A genetically targeted optical sensor to monitor calcium signals in astrocyte processes. Nat. Neurosci. 13, 759-766 (2010).
