Summary
Werkwijze voor subventriculaire zone (SVZ) cellen geladen met calcium indicator kleurstoffen voor opname calcium activiteit beschreven. De postnatale SVZ bevat dicht opeengepakte cellen met inbegrip van neurale progenitor cellen en neuroblasten. Plaats van bad loading injecteerden we de kleurstof door druk in het weefsel voor een beter kleurstofdiffusieoverdracht.
Abstract
De subventriculaire zone (SVZ) is een van de twee neurogene zones in de postnatale hersenen. De SVZ bevat dicht op elkaar gepakte cellen, met inbegrip van neurale progenitorcellen met astrocytaire functies (de zogenaamde SVZ astrocyten), neuroblasten, en tussenliggende progenitorcellen. Neuroblasten geboren in de SVZ tangentiaal migreren een grote afstand tot de bulbus olfactorius, waar ze differentiëren tot interneuronen. Intercellulaire signalering door middel van adhesiemoleculen en diffundeerbare signalen spelen een belangrijke rol bij het beheersen van neurogenese. Veel van deze signalen te activeren intercellulaire calcium activiteit die informatie binnen en tussen cellen verzendt. Calcium activiteit is dus representatief voor de activiteit van extracellulaire signalen en is optimaal aan functionele intercellulaire signalering tussen SVZ cellen te begrijpen.
Calcium activiteit is bestudeerd in veel andere gebieden en celtypen, waaronder rijpe astrocyten en neuronen. De traditionele methode load cellen met calcium indicator kleurstof (dwz bad laden) was niet efficiënt bij het laden alle SVZ celtypen. Inderdaad, de celdichtheid in de SVZ sluit kleurstofdiffusie in het weefsel. Bovendien zal bereiden sagittale plakken beter behoud van de driedimensionale schikking van SVZ cellen, met name de stroom neuroblast migratie de rostrale-caudale as.
Hier beschrijven we methoden om sagittale secties waarin de SVZ, het laden van SVZ cellen met calcium indicator kleurstof, en de overname van calcium activiteit met time-lapse filmpjes te bereiden. We gebruikten Fluo-4 AM kleurstof voor het laden van SVZ astrocyten met behulp van druk toepassing binnen het weefsel. Calcium activiteit werd opgenomen met behulp van een scanning confocale microscoop zodat een nauwkeurige resolutie voor het onderscheiden van afzonderlijke cellen. Onze aanpak toepasbaar is op andere neurogene zones zoals de hippocampus volwassen en embryonale subgranulaire zone neurogene zones. Ook andere typen kleurstoffen kunnenworden toegepast met de beschreven werkwijze.
Protocol
1. Bereiding van oplossingen, Dissection en Vibratome
- Oplossingen worden bereid op de juiste osmolariteit en pH (tabel 1). Vergeleken met kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF) wordt dissectie oplossing bereid met lagere concentraties van natrium en calcium, en de concentratie van magnesium. Dit is om excitotoxiciteit effecten te minimaliseren tijdens het snijden.
- Zowel dissectie en ACSF oplossingen worden verzadigd met 95% O2 / 5% CO 2 borrelen ten minste 10 min de gewenste pH van 7,3 te bereiken.
- Bereid een ijsbad in een lade. Plaats een dissectie plaat in het ijsbad en vul met dissectie oplossing. Bubble de dissectie plaat.
- Bereid de vibratome door het creëren van een ijsbad. Plaats het snijden schotel in het ijsbad, vul de schaal met dissectie oplossing en bel.
- Vul de plak houdt kamer met ACSF en bel om die oplossing verzekering van een adequate ongeacht beluchtwaar segmenten worden geplaatst.
2. Verwijdering van hersenweefsel
Acute hersencoupes de neiging om gezonder met jongere muizen. Cellulaire architectuur de postnatale SVZ bij knaagdieren is volwassen rond postnatale dag (P) 20 1. Daarom proberen we onze experimenten te beperken tot de muis leeftijd van P20-P30, maar we hebben uitgevoerd succesvolle experimenten in muizen zo oud als de 3 maanden. Bij de verwerking van het weefsel moet men rekening houden met mechanische bewegingen en druk om de hersenen te minimaliseren gekoelde toestand houden en de SVZ blootstellen aan deze zo snel mogelijk na offeren.
- Na injectie van pentobarbital, wordt de muis snel onthoofd. De vacht wordt verwijderd en incisies door de basis van de schedel. De kop wordt dan geplaatst in een bak gevuld met dissectie oplossing.
- Terwijl het stabiliseren van de kop met een tang, continue bezuinigingen zijn gemaakt rond de schedel en soms de middellijn met Microscissors. Wees voorzichtig om contact te minimaliseren met het weefsel. Sinds de bulbus olfactorius is de eindbestemming van pasgeboren neuronen van de SVZ, moet men rekening te houden met het behoud van die regio, met name tijdens botverwijdering rond dit gebied. Microscissor bezuinigingen gemaakt rond de schedel moet worden op de dorsale zijde, te zorgen voor een gemakkelijke verwijdering van de schedel.
- Verwijdering van de schedel bovenop de hersenen nu gescheiden van de botten onder de hersenen. Als bezuinigingen in de vorige stap goed zijn gemaakt, kan dit bovenliggende bot gemakkelijk worden verwijderd met een pincet of een tang.
- Terwijl u de kop met een tang, kan men een chirurgisch mes om netjes verwijderen voordat verscheidene stukjes hersenweefsel te snijden, zoals de volgende. Een coronale snede kan worden gemaakt op het niveau van lambda. Sagittale sneden kan worden aan beide zijden van de hersenen lateraal van de SVZ. Een voorzichtige schatting zou ~ 2,5 mm van de middellijn te zijn. Desgewenst kan de hersenen ook hier hemisected. Deze besparingen zullen zowel facilitate montage van het weefsel en laat de SVZ om sneller bereikt worden bij hersenen snijden. Het is belangrijk om te onthouden om de minimale hoeveelheid mechanische krachten uitoefenen op de hersenen (bijv. niet duwen of trekken).
3. Acute Brain Slice Voorbereiding
- Ter voorbereiding van de volgende stappen, ervoor te zorgen dat de super lijm gebruikt om het weefsel te monteren vrij is van vuil en klaar om toe te passen op de vibratome plaat. Het is belangrijk om zo snel mogelijk te gaan zonder beschadiging van de hersenen.
- Het hersenweefsel kan vervolgens worden geschept van onder, die het weefsel scheidt van het onderliggende bot tegelijkertijd scheiden zenuwen.
- Het weefsel is gemonteerd en gelijmd op een bord en op de vibratome. Door de rostrale-caudale anatomie van de SVZ, hebben we ons gericht op het maken sagittale plakken en vrijwaart de migratie pad van neuroblasten, gliale de schede en de vasculatuur die grotendeels zijn uitgelijnd in die richting. Men kan ofwel moUNT het weefsel op de middellijn of op het vlakke oppervlak gecreëerd door sagittale sneden lateraal van de SVZ. Een optionele stap is een 3% agarose blok hout achter het weefsel om te dienen als een aanslag op het blad als de plakjes loskomen. Wij bij voorkeur gebruikte cyanoacrylaat-based superlijm.
- Spoel het blad met ethanol om olie te verwijderen en spoel af met gedestilleerd water. Plaats het mes op de meshouder. Monteer de meshouder aan de vibratome.
- Pas vibratome instellingen om weefsel te snijden bij een dikte van 250-350 micrometer per stuk. Het is belangrijk te snijden met hoogfrequente trillingen en lage snelheid.
- Gedeelte geleidelijk door het weefsel. Het uiterlijk van de bulbus olfactorius is een goede indicator dat men bij de SVZ in sagittale plakken als de laterale segmenten zal geen gebied bevatten. Andere bezienswaardigheden om te zoeken naar onder meer het ventrikel en de verdikking van het corpus callosum, waar onder door de SVZ is gevestigd. De SVZ zal eerst verschijnen in meer laterale sagittal plakjes. De RMS zal laten zien in mediale sagittale plakjes.
- Verwijder plakjes met de SVZ met een plastic Pasteur pipet met de punt afgesneden. Overstappen naar de slice deelneming kamer. We krijgen vaak meer schijfjes dan we kunnen gebruiken in een werk dag. Echter segmenten variëren van de hoeveelheid cellen met de SVZ. Het is soms noodzakelijk om te kijken door verschillende plakken een gewenst imaging vinden.
4. Voorbereiding van Microscoop en kleurstoffen
De schijfjes hebben een een uur incubatie tijd in ACSF te herstellen van de dissectie en snijden. Verschillende stappen kunnen worden tijdens deze slice herstelperiode.
- Voorbereiding van pipetten voor calcium kleurstof en / of Drug Application
- Glazen pipetten nodig om een tip van 2-3 urn in diameter en een lengte tip (~ 2 mm) en hoek (~ 16 ° voor de pipethouder) die voorkomt contact met de perfusie kamer hebben en laat ruimte voor plaatsing vandoel.
- Men kan meestal voor te bereiden zes-acht druk pipetten voor elke dag van experimenten.
- Calcium kleurstofpreparaat
- Bij de opstelling werkoplossing (4-5 uM van bad, 250 uM door druktoepassing) het beste de minimale hoeveelheid DMSO blootstellen aan cellen. Dit kan worden bereikt door zeer geconcentreerd voorraden. Bijvoorbeeld voor Fluo-4 is een buis met 50 ug per dag gebruikt. Men kan een 10 mM stock van deze hoeveelheid door toevoeging 4,6 pi Pluronic F-127 20% oplossing in DMSO.
- Voorbereiden microscoop setup (figuur 2).
- Het gebruik van een peristaltische pomp voor oplossing debiet heeft geholpen minimaliseren beeld drift. Vóór de controle van de peristaltische pomp om ACSF om door de perfusielijnen en dat het luchtbellen waarborgen.
- Zet de buis inlaat op de perfusie kamer en ervoor zorgen dat er geen lekken zijn.
- Plaats de vacuüm tip om ensure dat de oplossing wordt afgezogen uit de kamer perfusie. Zorg ervoor dat het op een adequaat niveau, zodat de doelstelling wordt ondergedompeld op de juiste werkafstand, maar niet zo hoog zoals die oplossing kan lekken de kamer. Een lage niveau van de oplossing zal ook het minimaliseren van stroom vervormingen. Een constante aspiratie kan ook worden gecontroleerd door te luisteren naar stabiliteit.
5. Dye Loading
Deze methode is in detail beschreven in een manuscript 2. Gelieve daarin zie figuren.
- Bad laden kleurstof
- Een 1-2 ml werkoplossing van de kleurstof. Voor Fluo-4 AM, een concentratie van 4-5 pM voldoende voor het labelen SVZ neuroblasten.
- Slices worden eerst overgebracht naar een 35 mm cultuur schotel met een mesh bodem die al gevuld is met ACSF. Vervang de oplossing met behulp van een 3 ml plastic overdracht pipet om voorzichtig te verwijderen van de ACSF, terwijl tegelijkertijd het toevoegen van de calcium kleurstof werkende oplossing.
- Incubeer bij 37 ° C gedurende 30-60 min in een 5% CO2 gas worden geregeld.
- Plaats de plak in de ACSF gevulde houdt kamer weg te wassen kleurstof die niet is aangegaan cellen. Als alternatief kan men direct plaats het op de microscoop perfusie kamer die wordt uitgevoerd ACSF. Dit wash periode 30-45 min.
- Breng het segment van de perfusie kamer.
- Druktoepassing kleurstof
- Breng de plak van de houdkamer de perfusie kamer op de microscoop setup.
- Vul een glazen pipet met een werkende oplossing die 250 uM en leg ze op de micromanipulator.
- Laat de pipet het gebied van belang. De pipet kan worden geplaatst dat het uiteinde ofwel enkele micrometer boven het oppervlak slice of begraven enkele micrometers onder het oppervlak slice, maar buiten de opgenomen gedeelte. De hoek van de pipet niet Affect het laden efficiëntie. Wanneer beeldvorming onder de plak oppervlak, vinden we dat het plaatsen van de pipetpunt onder het beeldvlak onze gewenste beeldgebied beter te labelen.
- Wanneer de druk van de kleurstof van toepassing, stelt u de Picospritzer zodat het <3 psi. We hebben niet het volume van kleurstofdiffusie geschat, aangezien dit is afhankelijk van variabiliteit van de pipetpunt diameter, toegepaste druk en dichtheid van weefsel waar de kleurstof geïnjecteerd. We passen gewoon totdat we bereiken door ons gewenste belasting zoals beoordeeld door oog. Beperking van schade aan de plak tijdens het aanbrengen, in het bijzonder wanneer de punt is geplaatst onder het segment oppervlak. Solliciteer voor 1-2 minuten. Soms herhaalde toepassingen nodig zijn, afhankelijk van etikettering zoals beoordeeld door oog. Voor deze concentratie en de toepassing duur, vinden we dat oppervlak toepassing van kleurstof bij voorkeur neuroblasten labelt, terwijl onder de oppervlakte toepassing bij voorkeur labels astrocyten. Echter,> 3 min toepassing bij 500 uM eveneens een label neuroblastenongeacht of de tip boven of onder het segment oppervlak (JC Platel, niet gepubliceerde waarneming). Zorg voor wassen en plak herstel voor 30-45 min..
6. Confocale beeldvorming van Calcium Activiteit
- Vind de van belang eerst met een lager vermogen doelstelling zoals 4x of 10x. Plaats in het midden van het veld voordat naar een hogere macht doel. Op dit punt, kan men algemene plak de gezondheid te beoordelen door op te merken de verschijning van SVZ cellen onder differentieel interferentie contrast (DIC). Gezonde cellen verschijnen rond en mollig. Daarnaast zal gezonde cellen vertonen zwakke Fluo-4 geladen als verondersteld geen lading of helemaal heldere fluorescentie (a stervende cel).
- Laat de water-immersie-objectief op het gebied van belang, die nu kleurstof-geladen. Ofwel een 40x of 60x doelstelling is voldoende voor onze behoeften, maar 40x biedt een breder gezichtsveld en zorgt voor een grotere pipet toegang. Bij beeldvorming onder deoppervlakte, gaan we vaak op zijn minst 15 pm onder de plak oppervlak waar de 3-dimensionale architectuur en gezondheid van de cellen beter behouden blijven.
- Controleer of de perfusie en vacuüm adequaat werken.
- Stel de microscoop, zodat time-lapse resolutie en ruimtelijke resolutie worden ingesteld op het gewenste tarieven. Voor confocale microscopie, moeten deze factoren worden afgewogen als een toename in tijdresolutie meestal leidt tot een verlies aan ruimtelijke resolutie door het scannen van het stelsel. Voor calcium-activiteit, hebben we afgebeeld een frame ongeveer elke seconde met een 512x512 pixel resolutie. Als er meerdere kanalen die afzonderlijk nodig zijn, zal dit ook gevolgen hebben voor overname tarieven. Stel de duur van de film (2-10 min).
- Start uit te voeren. Bij het uitvoeren van farmacologische studies, was op antagonisten of niet-desensibilisatie agonisten voor ten minste 5-10 minuten, en dan maak een andere film van 5-10 minuten. Agonisten die ongevoelig receptoren acuut worden toegepast, zoals met een prEssure pipet bestuurd door een micromanipulator.
7. Calcium Analyse
Analyse volgt de standaard procedures die we beschreven in doorlatende publicaties 2-4. F 0 (dat wil zeggen de basis) en F zijn de gemiddelde fluorescentie-intensiteiten gemeten in alle van de regio's van belang (ROI) en in elke ROI, respectievelijk. Een verandering in fluorescentie werd als een Ca2 + stijging zijn als het> 15% F / F 0 toe. Intracellulaire Ca 2 + veranderingen werden berekend met Calsignal 5.
8. Representatieve resultaten
We hebben kunnen selectief laden van SVZ cellen, afhankelijk van de kleurstof loading protocollen hierboven en elders beschreven 2-4,6 verkrijgen. Bad laden of druk applicatie op de plak oppervlak van Fluo-4 AM (4-5 of 250 uM, respectievelijk) etiketten meestal neuroblasten. Terwijl de druk toepassing kan laden neurobduurt sneller dan bad laden in een enkele plak, bad laden kan de gelijktijdige belasting van meerdere plakjes. We bevestigen de identiteit van gemerkte cellen zoals neuroblasten door (1) of ze migratiegedrag 4,7, (2) hun morfologie, (3) negatieve kleuring van sulforhodamine 101, een astrocyt specifieke kleurstof 3 of (4) positieve kleuring met weer DCX-DsRed expressie (JC Platel, ongepubliceerd observatie). Neuroblasten snel migreren (gemiddeld 60 um / uur) bij fysiologische temperatuur 4,7-9, maar hun beweging gemakkelijk kunnen worden waargenomen, zelfs bij kamertemperatuur. De beweging van neuroblasten heeft een probleem niet vormen met betrekking tot het plaatsen van de regio's of interest (ROI) om calcium bij te houden, omdat onze films zijn meestal van korte duur. Echter, tijdens lange wachttijden, zoals tijdens geneesmiddeloplossing uitwisselingen moeten onderzoekers voorzichtig zijn om ROI wedstrijd in controle en behandeling periodes. Het is niet ongewoon voor neuroblasten migreren naar of uit de i maging veld of focal plane.
Druktoepassing van Fluo-4 AM (250 uM) diep in het segment en voor beperkte duur (<2 min) aanbrengt voorkeur SVZ astrocyten 2. Astrocyten etikettering is geverifieerd door positieve labeling met sulforhodamine 101 en hun morfologie, in het bijzonder door de aanwezigheid van projecties en eindvoetjes op de bloedvaten die wij onlangs hebben beschreven 3. Met deze methoden hebben we waargenomen spontane activiteit zowel in de SVZ neuroblast en astrocyt populatie (Figuur 1). De activiteit in astrocyten neemt vaak de vorm van golven die bloedvat 3 in te schakelen. Bovendien met calcium imaging als assay is de toepassing van farmacologische agonisten aangetoond of bevestigd expressie van GABAA-receptoren op neuroblasten en astrocyten 6, AMPA en NMDA receptoren op neuroblasten 4.
Cijfers
1 "src =" / files/ftp_upload/4071/4071fig1.jpg "/>
Figuur 1. Het uitdragen van calcium activiteit in astrocyten. (A) Vertegenwoordiger gemiddeld beeld van een time-lapse-opname van calcium activiteit. Astrocyten in de SVZ werden beladen met druk toepassing van Fluo-4 AM diep in het segment. Films werden verworven tegen 0,75 s tijd-stappen. Regio's van belang (ROI) worden geplaatst over cellen die activiteit vertonen. (B) Sporen van ROI geplaatst over cellen van de film weergegeven in (A). Sporen werden gefiltreerd met een voortschrijdend gemiddelde en genormaliseerd. De verticale schaal is 2 x AF / F 0 waarin F de signaalintensiteit en F 0 is de gemiddelde basislijn-signaal en Af = FF 0.
Figuur 2. Afbeelding van de perfusiesysteem. Een uiteinde van een buis wordt ondergedompeld in 95% O2 / 5% CO 2-gas-perfused oplossing. De oplossing wordt vervolgens geperfundeerd door de buis en het bad kamer door een peristaltische pomp (niet getoond). Het andere uiteinde wordt in de oplossing inlaat van het bad kamer gemonteerd op een platform. Het streven tip is dan verbonden met de oplossing uitlaat van de kamer en vastgesteld op een niveau om de oplossing te hoogte te bepalen. Uit het stopcontact, wordt de aspiratie tip is aangesloten op het vacuüm lijn, die de oplossing zuigt uit de kamer in een afvalbak. Het perfusiesysteem wordt uit de microscooptafel voor visuele helderheid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Calcium beeldvorming van SVZ cellen is om patronen te bestuderen in spontane activiteit in neuroblasten 10 receptor kanaal expressie in zowel neuroblasten en astrocyten 4,6,8 en astrocytaire calcium golven 3. Omdat cellen in de SVZ zijn ofwel onrijp of gliale eigenschappen, ze niet ontslaan actiepotentialen 11,12, wat betekent dat milliseconde veranderingen in spanningspotentiaal indicatie van de activiteiten in volwassen netwerken niet van toepassing is in deze regio. Daarom, het vastleggen van de langzamere calcium gebeurtenissen (in de orde van seconden) is niet alleen biologisch zinvol, maar misschien wel de meest relevante vorm van activiteit in deze cellen.
Onderzoekers moeten rekening houden met een groot aantal stappen in deze procedure, in het bijzonder met betrekking tot slice gezondheid. Onjuiste maken van oplossingen, kan een slechte kwaliteit van het water (gebruikt om oplossingen te maken), langzaam en onnauwkeurig dissecties, en het gebruik van vuile scheermesjes om weefsel te snijden alle nadelige effecten van de activiteit.
Met betrekking tot het gebruik van calcium indicatoren, terwijl we alleen besproken het gebruik van Fluo-4AM, hebben we geprobeerd andere commerciële kleurstoffen, waaronder Oregon Green BAPTA-AM, welke een hoger niveau dan basislijn loading Fluo-4 heeft. We besloten te focussen op Fluo-4 vanwege zijn groter dynamisch bereik in vergelijking met andere kleurstoffen, maar andere onderzoekers vindt verschillende kleurstoffen voordelig voor hun doeleinden. Elke kleurstof kan verschillende affiniteit voor bepaalde celtypen. Concentratie en wijze van laden kan worden aangepast voor elke kleurstof. We voorkeur gebruikt drukbelasting aan SVZ astrocyten en gezonder, diepere cellen te labelen. Een financiële factor die meespeelt is dat het gebruik druktoepassing is duurder dan bad toepassing, hoewel de kleurstofoplossing in de druk pipet kunnen worden ingevroren en opnieuw de volgende dag. Als alternatief genetisch gecodeerde calcium indicatoren (GECIs), zoals GCaMP3, in toenemende mate populair voor onderzoek naar systemen en brain gebieden 13,14. Deze GECIs het voordeel wordt aangedreven onder celspecifieke promoters, maar de kinetiek en dynamiek algemeen niet beter dan de organische kleurstoffen 15. Het gebruik in de postnatale SVZ heeft ook virale etiket of elektroporatie van de construct, deze beperking onderzoek neuroblasten de neonatale periode door verlies van plasmide tijdens de celdeling.
Slice drift voorkomt betrouwbare signaal acquisitie tijdens de duur van de film en is een van de meest uitdagende technische hindernissen met live-imaging experimenten van de hersenen plakjes. Het is afhankelijk van diverse factoren, waaronder perfusiesnelheid, vacuum plaatsing objectieve gewicht en eventueel temperatuurgradiënten. Als de temperatuur boven 25 ° C nodig zijn voor experimenten worden geprobeerd oplossingen en perfusie kamers verwarmen bij de laagste temperatuur waarbij ze hun vragen aangezien temperaturen kunnen leiden tot grote, undesired aandacht drift. Doelstelling kachels en verwarmde kasten kunnen ook helpen bij het minimaliseren dit effect, hoewel we hebben geprobeerd de voormalige zonder veel succes.
Behoudens deze technische obstakels hebben onderzoekers de mogelijkheid assay een groot aantal cellen in een postnatale ontwikkelingsgebied. Dit biedt de mogelijkheid om de activiteit aan te pakken op een populatie niveau, waardoor nieuwe inzichten opleveren in de processen reguleren neurogenese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de NIH (DC007681, AB), CT Stem Cell subsidie (AB), Pardee stichting (AB), Predoctoraal Ruth L. Kirschstein National Research Service Awards (NRSA) (SZY), en een NSF Graduate Research Fellowship (BL). Wij danken de Bordey lab leden voor nuttige commentaar op het manuscript. De huidige materiaal is gebaseerd op het werk mede ondersteund door de staat Connecticut in de Connecticut Stem Cell Research Grants Program. De inhoud ervan is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigen niet noodzakelijk de officiële standpunten van de staat Connecticut, het ministerie van Volksgezondheid van de staat Connecticut of CT Innovations, Incorporated.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Sigma | S0389 | Dissection: 147 mM ACSF: 0 mM |
| NaCl | Sigma | S9888 | Dissection: 42 mM ACSF: 126 mM |
| KCl | Sigma | P3911 | Dissection: 2.5 mM ACSF: 2.5 mM |
| MgCl2.6H2O | Sigma | M9272 | Dissection: 4.33 mM ACSF: 1 mM |
| NaH2PO4.H2O | Sigma | S8282 | Dissection: 1.25 mM ACSF: 1.25 mM |
| Glucose | Sigma | G8270 | Dissection: 10 mM ACSF: 10 mM |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | Dissection: 26 mM ACSF: 26 mM |
| CaCl2.2H2O | Sigma | C3306 | Dissection: 1.33 mM ACSF: 2 mM |
Table 1. Chemical list and recipes of dissection solution and ACSF. |
|||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vibratome | Leica | VT 1000S | |
| Super Glue | Surehold or 3M | Surehold 3G Super Glue or 3M Vet-Bond | |
| Dissection tools | Roboz or Ted Pella | ||
| Fluo-4 AM calcium-sensitive dye | Invitrogen | F14201 | |
| Oregon Green BAPTA-1 AM calcium-sensitive dye | Invitrogen | O6807 | |
| Pluronic F-127 20% solution in DMSO | Invitrogen | P3000MP | |
| Upright confocal microscope | Olympus | FV300 or FV1000 | |
| Water-immersion objectives | Olympus | LUMPlanFl 40 x W/IR (NA 0.80); LUMPlanFl 60 x W/I (NA 0.90) | |
| Micromanipulators | Sutter | MPC-200/MPC-325/MPC-385 | |
| Pressure controller | Parker Hannifin | Picospritzer | <3 PSI during application |
| Pipette puller | Sutter or Narshige | Sutter P-97 or Narshige PP-830 | |
| Glass pipettes | Sutter | BF150-110-10 | I.D.:1.10, O.D.: 1.50 |
| Peristaltic pump | Harvard Apparatus | Model 720 | flow rate: 1 ml/min |
| Chamber bath | Warner Instruments | RC-26 GLP | Low profile allows for objective clearance |
| Tubing | Tygon | ||
| Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B/344B | |
Table 2. Materials/equipment list. |
|||
References
- Peretto, P., Giachino, C., Aimar, P., Fasolo, A., Bonfanti, L. Chain formation and glial tube assembly in the shift from neonatal to adult subventricular zone of the rodent forebrain. J. Comp Neurol. 487, 407-427 (2005).
- Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. Imaging and recording subventricular zone progenitor cells in live tissue of postnatal mice. Front. Neurosci. 4, 10-3389 (2010).
- Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. Gap junction-mediated calcium waves define communication networks among murine postnatal neural progenitor cells. Eur. J. Neurosci. , (2011).
- Platel, J. C., Dave, K. A., Gordon, V., Lacar, B., Rubio, M. E., Bordey, A. NMDA receptors activated by subventricular zone astrocytic glutamate are critical for neuroblast survival prior to entering a synaptic network. Neuron. 65, 859-872 (2010).
- Platel, J. C., Dupuis, A., Boisseau, S., Villaz, M., Albrieux, M., Brocard, J. Synchrony of spontaneous calcium activity in mouse neocortex before synaptogenesis. Eur. J. Neurosci. 25, 920-928 (2007).
- Young, S. Z., Platel, J. C., Nielsen, J. V., Jensen, N. A., Bordey, A. GABAA increases calcium in subventricular zone astrocyte-like cells through L- and T-type voltage-gated calcium channels. Front. Cell. Neurosci. 4, 8 (2010).
- Bolteus, A. J., Bordey, A. GABA Release and Uptake Regulate Neuronal Precursor Migration in the Postnatal Subventricular Zone. J. Neurosci. 24, 7623-7631 (2004).
- Platel, J., Heintz, T., Young, S., Gordon, V., Bordey, A. Tonic activation of GLUK5 kainate receptors decreases neuroblast migration in a whole mount preparation of the subventricular zone. J. Physiol. (Lond). 586, 3783-3793 (2008).
- Nam, S. C., Kim, Y., Dryanovski, D., Walker, A., Goings, G., Woolfrey, K., Kang, S. S., Chu, C., Chenn, A., Erdelyi, F., Szabo, G., Hockberger, P., Szele, F. G. Dynamic features of postnatal subventricular zone cell motility: a two-photon time-lapse study. J. Comp. Neurol. 505, 190-208 (2007).
- Lacar, B. L., Platel, J. C., Bordey, A. GABA controls Ca2+ activity-dependent network synchrony in the adult neurogenic forebrain. Neuroscience Meeting Planner, San Diego, CA, , Society for Neuroscience. (2007).
- Liu, X., Bolteus, A. J., Balkin, D. M., Henschel, O., Bordey, A. GFAP-expressing cells in the postnatal subventricular zone display a unique glial phenotype intermediate between radial glia and astrocytes. Glia. 54, 394-410 (2006).
- Wang, D. D., Krueger, D. D., Bordey, A. Biophysical properties and ionic signature of neuronal progenitors of the postnatal subventricular zone in situ. J. Neurophysiol. 90, 2291-2302 (2003).
- Tian, L., Hires, S. A., Mao, T., Huber, D., Chiappe, M. E., Chalasani, S. H., Petreanu, L., Akerboom, J., McKinney, S. A., Schreiter, E. R., Bargmann, C. I., Jayaraman, V., Svoboda, K., Looger, L. L. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).
- Zhao, Y., Araki, S., Wu, J., Teramoto, T., Chang, Y. F. An expanded palette of genetically encoded Ca(2) indicators. Science. 333, 1888-1891 (2011).
- Shigetomi, E., Kracun, S., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. A genetically targeted optical sensor to monitor calcium signals in astrocyte processes. Nat. Neurosci. 13, 759-766 (2010).
