Summary
En metode for å laste subventricular sone (SVZ) celler med kalsium indikator fargestoffer for opptak kalsium aktivitet er beskrevet. Postnatal SVZ inneholder tett pakket celler, inkludert nevrale stamceller og neuroblasts. Snarere enn å bruke bad lasting injisert vi fargestoff ved trykk inne i vevet lar bedre fargestoff diffusjon.
Abstract
Subventricular sone (SVZ) er en av de to soner i nevrogene postnatal hjernen. Den SVZ inneholder tettpakkede celler, inkludert nevrale stamceller med astrocytic funksjoner (kalt SVZ astrocytes), neuroblasts og mellomliggende progenitorceller. Neuroblasts født i SVZ tangentialt migrere en stor avstand til luktelappen, hvor de differensieres til interneurons. Intercellulære signalering gjennom adhesjonsmolekyler og diffusjonsevne signaler spiller viktige roller i kontrollerende neurogenesis. Mange av disse signalene utløse intercellulære kalsium aktivitet som overfører informasjon i og mellom cellene. Kalsium aktivitet er således reflektert av aktiviteten av ekstracellulære signaler og er en optimal måte å forstå funksjonell intercellulære signalering blant SVZ celler.
Kalsium aktivitet er undersøkt i mange andre regioner og celletyper, inkludert modne astrocytes og nevroner. Men den tradisjonelle metoden for å load celler med kalsium indikator dye (dvs. bad lasting) var ikke effektiv ved lasting alle SVZ celletyper. Faktisk, utelukker cellulære tetthet i SVZ fargestoff diffusjon inne i vevet. I tillegg vil forberede sagittale stykker bedre bevare tredimensjonale arrangement av SVZ celler, spesielt strømmen av neuroblast migrasjon på rostral-kaudal aksen.
Her beskriver vi metoder for å forberede sagittale seksjoner som inneholder SVZ, lasting av SVZ celler med kalsium indikator fargestoff, og oppkjøpet av kalsium aktivitet med time-lapse filmer. Vi brukte Fluo-4 AM dye for lasting SVZ astrocytes med spyling inne i vevet. Kalsium aktivitet ble registrert med en scanning confocal mikroskop slik at en presis oppløsning for å skille de forskjellige cellene. Vår tilnærming er gjeldende for andre nevrogene soner inkludert voksen hippocampus subgranular sone og embryonale nevrogene soner. I tillegg andre typer fargestoffer kanpåføres ved hjelp av den beskrevne metode.
Protocol
1. Utarbeidelse av løsninger, disseksjon, og Vibratome
- Løsninger må være forberedt på riktig osmolaritet og pH (tabell 1). Sammenlignet med kunstig cerebrospinalvæske (ACSF), er disseksjon oppløsning fremstilt med lavere konsentrasjoner av natrium og kalsium, og høyere konsentrasjoner av magnesium. Dette er for å minimere eksitotoksisitet effekter under kutting.
- Både disseksjon og ACSF løsninger må mettet med 95% O 2/5% CO 2 ved bobling i minst 10 min for å nå den ønskede pH-verdi på 7,3.
- Forbered et isbad i en skuff. Plasser en disseksjon plate i isbad og fyll med disseksjon løsning. Bubble disseksjon plate.
- Forbered vibratome ved å opprette et isbad. Plasser seksjonering rett i isbad, fyll tallerken med disseksjon løsning, og boble.
- Fyll stykket holder kammeret med ACSF og boble for å sikre at oppløsningen er tilstrekkelig luftes uansetthvor skiver er plassert.
2. Fjerning av hjernevev
Akutt hjernen skiver har en tendens til å være sunnere med yngre mus. Postnatal SVZ cellular arkitektur i gnagere er moden rundt postnatal dag (P) 20 1. Derfor prøver vi å begrense våre eksperimenter til musen alderen P20-P30, men vi har utført vellykkede forsøk på mus er like gammel som 3 måneder. Gjennom håndtering av vev, må man være oppmerksom på å minimere mekaniske bevegelser og press til hjernen, vedlikeholde avkjølte forhold, og utsetter SVZ til løsning så raskt som mulig etter offer.
- Etter injeksjon av pentobarbital, blir musen raskt halshugget. Pelsen er fjernet og snittene blir lagt gjennom bunnen av hodeskallen. Hodet er deretter plassert i et brett fylt med disseksjon løsning.
- Mens stabilisere hodet med tang, er kontinuerlig kutt gjort rundt skallen og noen ganger opp midtlinjen med microscissors. Vær nøye med å minimere kontakt med vevet. Siden luktelappen er det endelige målet for nyfødte nerveceller fra SVZ, må man være oppmerksom på å bevare dette området, spesielt i bein fjerning rundt dette området. Microscissor kutt gjort rundt skallen skal være på dorsal side, slik at for enkel fjerning av skallen.
- Fjerning av hodeskallen overliggende hjernen er nå skilt fra beina under hjernen. Hvis kutt i forrige trinn er gjort riktig, kan dette overliggende bein fjernes enkelt med pinsett eller tang.
- Mens fortsatt holdes hodet med tang, kan man bruke en kirurgisk blad til rent fjerne flere stykker av hjernevev før kutting, for eksempel følgende. En koronale snitt kan gjøres på nivået av lambda. Sagittale kutt kan gjøres på begge sider av hjernen lateralt for SVZ. Et forsiktig anslag vil være ~ 2,5 mm fra midtlinjen. Hvis ønskelig, kan hjernen også hemisected her. Disse kuttene vil både FACILitate montering av vev og la SVZ skal nås raskere når hjernen slicing. Det er viktig å huske å utøve den minimale mengden av mekaniske krefter på hjernen (f.eks ikke skyve eller dra).
3. Akutt Brain Slice Forberedelse
- For å forberede etterfølgende trinn, sørge for at superlim brukes til å montere vevet er fri for tresko og klar til å gjelde for vibratome plate. Det er viktig å gå så fort som mulig uten å skade hjernen.
- Hjernevevet kan deretter øses fra undersiden, som skiller vev fra underliggende ben samtidig separering nerver.
- Vevet er montert og limt på en plate og plassert på vibratome. På grunn av den rostral-caudal anatomi av SVZ, har vi fokusert på å gjøre sagittale skiver som det bevarer den vandrende vei av neuroblasts, den glial skjede, og blodkar som i stor grad innrettet i denne retningen. Man kan enten mount vevet ved midtlinjen eller på den flate overflaten opprettet ved å gjøre kutt sagittale lateralt for SVZ. Et valgfritt trinn er å plassere en 3% agarose-blokk bak vevet å tjene som en anleggsflate til bladet som skivene løsner. Vi fortrinnsvis brukes cyanoakrylat-basert superlim.
- Skyll bladet med etanol for å fjerne oljer og skyll med destillert vann. Plasser bladet på bladholderen. Monter bladholderen til vibratome.
- Juster vibratome innstillinger å kutte vev med en tykkelse på 250-350 mikrometer pr skive. Det er viktig å kutte med høyfrekvente vibrasjoner og lav hastighet.
- § progressivt gjennom vevet. Utseendet på luktelappen er en god indikator på at man er nær SVZ i sagittal skiver som den mest laterale skiver skal inneholde verken regionen. Andre landemerker å se etter inkludere ventrikkel og fortykkelse av corpus callosum, under der SVZ ligger. Den SVZ kommer først opp i mer lateral sagittal skiver. RMS vil vise i mediale sagittale skiver.
- Fjern stykker inneholder SVZ med en plast Pasteur pipette med spissen avskåret. Overføre til stykket driftsenheten kammeret. Vi ofte få flere skiver enn vi kan bruke i en arbeidsdag. Imidlertid vil stykker varierer på mengden celler inneholdende SVZ. Noen ganger er det nødvendig å se gjennom flere stykker for å finne en ønsket for bildebehandling.
4. Utarbeidelse av mikroskop og fargestoffer
Sektorene krever en times inkubasjonstid i ACSF å gjenopprette fra disseksjon og kutting. Flere trinn kan utføres i løpet av denne stykke utvinning perioden.
- Forberedelse av pipetter for kalsium fargestoff og / eller narkotika søknad
- Glass pipetter må ha en spiss av 2-3 um i diameter og en spiss lengde (~ 2 mm) og vinkel (~ 16 ° for pipetteholder) som hindrer kontakt med perfusjon kammer og gir rom for plassering avmålet.
- Man kan vanligvis forberede 6-8 press pipetter for hver dag i eksperimenter.
- Kalsium dye forberedelse
- Ved utarbeidelsen arbeidsløsningen (4-5 uM etter bad, 250 uM av trykk søknad), er det best å eksponere det minimum av DMSO til celler. Dette kan oppnås ved å gjøre høykonsentrerte bestander. For eksempel, for Fluo-4, er en rør inneholdende 50 ug brukes per dag. Man kan foreta en 10 mM lager av denne aliquot ved tilsetning 4,6 pl av Pluronic F-127 20% oppløsning i DMSO.
- Forbereder mikroskop oppsett (figur 2).
- Bruk av en peristaltisk pumpe for løsning strømning har bidratt minimere image avdrift. Kjør den peristaltiske pumpen før tillate ACSF å kjøre gjennom perfusjon linjer og sikre at det er boble-fri.
- Still røret inntaket på perfusjon kammer og sikre at det ikke er noen lekkasjer.
- Plasser vakuum tips til ensure at løsningen blir aspireres fra perfusjon kammeret. Sørg for at det er på et tilstrekkelig nivå, slik at målet er nedsenket i riktig arbeidsavstand, men ikke så høyt slik at løsningen kan renne over kammeret. Et lavt nivå av løsning vil også minimere flyt forvrengninger. En konstant aspirasjon kan også verifiseres ved å lytte etter stødighet.
5. Dye Loading
Denne metoden har blitt beskrevet i detalj i en annen manuskript 2. Vennligst se tall der.
- Bath lasting fargestoff
- Foreta en 1-2 ml arbeidsoppløsning av fargestoffet. For Fluo-4 AM, er en konsentrasjon av 4-5 pM tilstrekkelig for merking SVZ neuroblasts.
- Skiver er først overføres til en 35 mm kultur tallerken med en maske bunn som er allerede fylt med ACSF. Erstatte løsning ved hjelp av en 3 ml plast overføringspipetten å forsiktig fjerne ACSF, samtidig legger til calcium fargestoff arbeider løsning.
- Inkuber ved 37 ° C i 30-60 min i en 5% CO 2 gass-kontrollert miljø.
- Plasser stykke tilbake i ACSF fylt holder kammer å vaske bort fargestoff som har ikke angitt celler. Alternativt kan man plassere den direkte på mikroskopet perfusjon kammer som kjører ACSF. Dette vask perioden er 30-45 min.
- Overfør stykket til perfusjon kammeret.
- Spyling av fargestoff
- Overfør stykke fra driftsenheten kammeret til perfusjon kammer på mikroskopet oppsettet.
- Fyll et glass pipette med en fungerende løsning som er 250 mikrometer og sted på micromanipulator.
- Senk pipetten til regionen av interesse. Pipetten kan plasseres slik at spissen er enten flere mikrometer over stykket overflaten eller begravd flere mikrometer under stykket overflaten, men vekk fra den innspilte regionen. Vinkelen på pipetten ikke Affect lasting effektivitet. Når bildebehandling under stykket overflaten, ser vi at det å legge pipettespissen under bildebehandling flyet vil merke vår ønsket bildebehandling området bedre.
- Når trykket påføre fargestoff, angi Picospritzer slik at det er <3 psi. Vi har ikke beregnet volumet av fargestoff diffusjon, fordi dette er underlagt variasjon av pipettespissen diameter, anvendt press, og tettheten av vev der fargestoff injiseres. Vi bruker rett og slett før vi oppnår våre ønsket lasting som vurderes av øyet. Minimere skader på stykket under påføring, spesielt når spissen er plassert under skive overflaten. Søk om 1-2 min. Noen ganger gjentatte søknader er nødvendig avhengig av merking som vurderes av øyet. For denne konsentrasjonen og søknad varighet, finner vi at overflaten anvendelse av fargestoff fortrinnsvis merker neuroblasts mens under overflaten programmet fortrinnsvis merker astrocytes. Imidlertid vil> 3 min søknad på 500 mikrometer også merke neuroblastsuavhengig av om spissen er over eller under stykket overflaten (JC Platel, upublisert observasjon). Tillat for vask og skjær gjenoppretting for 30-45 min.
6. Confocal Imaging av kalsium aktivitet
- Finn regionen av interesse først med en lavere strøm objektiv som 4x eller 10x. Plassere i midten av feltet før du bytter til en høyere makt mål. På dette punktet, kan man vurdere generell stykke helse ved å merke utseendet SVZ celler under differensial interferens kontrast (DIC). Friske celler vises rund og lubben. I tillegg vil friske celler viser svak Fluo-4 lasting som skal ingen lasting det hele tatt eller lyse fluorescens (en døende celle).
- Senke vannets-nedsenking mål på regionen av interesse, som er nå fargestoff-lastet. Enten en 40x eller 60x Målet har vært tilstrekkelig for våre behov, selv om 40x gir et bredere synsfelt og gir større pipette tilgang. Når bildebehandling underoverflaten, vi ofte gå minst 15 mikrometer under stykket overflaten der den 3-dimensjonale arkitektur og celle helse er bedre bevart.
- Kontroller at perfusjon og vakuum jobber tilstrekkelig.
- Setup mikroskopet slik at time-lapse oppløsning og romlig oppløsning er satt til ønsket hastighet. For konfokalmikroskopi må disse faktorer avveies som en økning i tidsoppløsning vanligvis resulterer i et tap av romlig oppløsning på grunn skanning natur av systemet. For kalsium aktivitet, har vi tatt bilder av en ramme rundt hvert sekund med en 512x512 pikslers oppløsning. Hvis flere kanaler anskaffes separat er nødvendig, vil dette også påvirke oppkjøpet priser. Still lengden på filmen (2-10 min).
- Initiere kjøre. Hvis du utfører farmakologiske studier, vask på antagonister eller ikke-desensitizing agonister for minst 5-10 min, og deretter lage en ny film på 5-10 min. Agonister som kan desensitize reseptorer kan være akutt spesielt, for eksempel ved hjelp av en prEssure pipette kontrollert av en micromanipulator.
7. Kalsium Analyse
Analyse følger standard prosedyrer som vi beskrevet i pervious publikasjoner 2-4. F 0 (dvs. baseline) og F er de gjennomsnittlige fluorescensintensiteter målt gjennom alle områder av interesse (ROIs) og i hvert ROI, henholdsvis. En endring i fluorescens ble ansett å være en Ca 2 + øker dersom det var> 15% F / F 0 økning. Intracellulære Ca 2 + endringer ble beregnet ved hjelp av Calsignal 5.
8. Representant Resultater
Vi har vært i stand til å skaffe selektiv lasting av SVZ celler avhengig av fargestoff lasting protokollen beskrevet ovenfor og andre steder 2-4,6. Badekar lasting eller spyling på skive overflaten av fluo-4 AM (4-5 eller 250 mikrometer, henholdsvis) etiketter meste neuroblasts. Mens press programmet kan laste neurobvarer raskere enn bad lasting i ett enkelt stykke, gjør bad lasting samtidig lasting av flere stykker. Vi bekrefter identiteten til merkede celler som neuroblasts av (1) om de viser trekkadferden 4,7, (2) deres morfologi, (3) negativ farging av sulforhodamine 101, en astrocyte-spesifikk fargestoff 3 eller (4) positiv farging med DCX-DsRed uttrykk (JC Platel, upublisert observasjon). Neuroblasts forflytter seg raskt (gjennomsnitt av 60 mikrometer / time) ved fysiologisk temperatur 4,7-9, men deres bevegelse kan lett observeres selv ved romtemperatur. Bevegelsen av neuroblasts ikke utgjør et problem med hensyn til å plassere regioner-of-interesse (ROI) for å spore kalsium aktivitet siden våre filmer er typisk kort varighet. Men under lange ventetider, for eksempel under narkotika løsning utveksling, må etterforskerne være forsiktig med å matche ROIs i kontroll og behandling perioder. Det er ikke uvanlig for neuroblasts å migrere inn i eller ut av i ledningene slik felt eller fokusplan.
Spyling av Fluo-4 AM (250 mikrometer) dypt inn i stykket, og for begrenset varighet (<2 min) etiketter fortrinnsvis SVZ astrocytes 2. Astrocyte merking er verifisert av positiv merking med sulforhodamine 101 og deres morfologi, spesielt ved nærvær av fremspring og endfeet for blodårer som vi nylig har beskrevet 3. Ved hjelp av disse metodene, har vi observert spontan aktivitet i både SVZ neuroblast og astrocyte befolkningen (figur 1). Aktiviteten i astrocytes tar ofte form av bølger som engasjerer blodåre 3. Videre, ved hjelp av kalsium billeddiagnostikk som et assay, har anvendelse av farmakologiske agonister avdekket eller bekreftet ekspresjon av GABA A reseptorer på neuroblasts og astrocytes 6, AMPA og NMDA reseptorer på neuroblasts 4.
Tall
1 "src =" / files/ftp_upload/4071/4071fig1.jpg "/>
Figur 1. Forplanter kalsium aktivitet i astrocytes. (A) Representant gjennomsnitt bilde fra en time-lapse opptak av kalsium aktivitet. Astrocytes i SVZ ble lastet med spyling av Fluo-4 AM dypt inn i stykket. Filmer ble kjøpt på 0,75 s time-trinn. Regioner av interesse (ROI) er plassert over cellene stiller aktivitet. (B) spor fra ROIs plasseres over celler fra filmen avbildede i (A). Spor ble filtrert med et glidende gjennomsnitt og normalisert. Den vertikale skalaen representerer 2 x Af / F 0 hvor F er signalintensitet og F 0 er gjennomsnittlig baseline signal og Af = FF 0.
Figur 2. Bilde av perfusjon systemet. En ende av et rør er nedsenket i 95% O 2/5% CO 2 gass-perfused løsning. Løsningen blir deretter perfused gjennom røret og til badekaret kammeret ved en peristaltisk pumpe (ikke vist). Den andre enden er satt inn i løsningen innløpet av badekaret kammer montert på en plattform. Aspirasjon spissen kobles deretter til oppløsningen utløp av kammeret og satt på et nivå for å bestemme oppløsningen høyde. Fra utløpet, er aspirasjon spissen koblet til vakuumledning som aspirates løsningen fra kammeret inn i en avfallsbeholder. Perfusjon systemet er vist av mikroskop scenen for visuell klarhet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kalsium avbildning av SVZ celler har blitt brukt til å studere mønstre i spontan aktivitet i neuroblasts 10, reseptor kanal uttrykk i både neuroblasts og astrocytes 4,6,8 og astrocytic kalsium bølger 3. Siden cellene i SVZ er enten umoden eller har glial egenskaper, har de ikke brann aksjonspotensialer 11,12, noe som betyr at millisekund endringer i spenningspotensial tyder på aktivitet i modne nettverk er ikke aktuelt i denne regionen. Derfor fange tregere kalsium hendelser (i størrelsesorden sekunder) er ikke bare biologisk meningsfylt, men kanskje den mest relevante formen for aktivitet i disse cellene.
Etterforskerne må være oppmerksomme på mange trinn i denne prosedyren, spesielt med hensyn til skive helse. Uriktig making av løsninger, kan dårlig vannkvalitet (brukt til å lage oppløsninger), langsomme og upresis disseksjoner, og bruk av skitne barberblader å kutte vev alle har skadelig effects på aktivitet.
Med hensyn til bruk av kalsium indikatorer, mens vi bare diskutert bruk av Fluo-4AM, har vi forsøkt andre kommersielle fargestoffer, inkludert Oregon Grønn BAPTA-AM, som har en høyere baseline loading nivå enn Fluo-4. Vi valgte å fokusere på Fluo-4 på grunn av sin større dynamisk omfang i forhold til andre fargestoffer, men andre forskere kan finne ulike fargestoffer fordel for sine formål. Hver fargestoff kan ha forskjellig affinitet for visse celletyper. Konsentrasjon og fremgangsmåte for lasting kan måtte justeres for hvert fargestoff. Vi fortrinnsvis brukes press lasting å merke SVZ astrocytes og sunnere, dypere celler. En finansiell faktor å vurdere er at bruk av press programmet er mer kostnadskrevende enn bad program, selv om fargestoff løsning i trykket pipette kan fryses og brukes på nytt neste dag. Alternativt har genetisk-kodede kalsium indikatorer (GECIs), som GCaMP3, blitt stadig mer populært å studere andre systemer og BHi regionene 13,14. Disse GECIs har fordelen av å være drevet under celle-spesifikke promotorer, men deres kinetikk og dynamisk område er generelt ikke bedre enn de organiske fargestoffer 15. Deres anvendelse i postnatal SVZ krever også viral merking eller elektroporering av konstruksjonen, sistnevnte begrenser studiet av neuroblasts til nyfødtperioden grunn av tap av plasmid under celledeling.
Slice drift hindrer pålitelig signal oppkjøpet i løpet av varigheten av filmen, og er en av de mest utfordrende tekniske hindrene med live-imaging eksperimenter av hjernen skiver. Det påvirkes av flere faktorer, inkludert perfusjon rate, vakuum plassering, objektiv vekt, og eventuelt temperaturgradienter. Dersom temperaturen er større enn 25 ° C er nødvendig for eksperimenter, bør man forsøke å varme løsninger og perfusjon kamre ved laveste temperatur hvor de kan ta sine spørsmål siden temperaturer kan føre til betydelige, undesired fokus drift. Objektive varmeovner og varmekabler vedlegg kan også bidra til å minimere denne effekten, selv om vi har prøvd det tidligere uten særlig suksess.
Sperring disse tekniske hindrene, forskere har mulighet til analysen et stort antall celler i en postnatal utvikle regionen. Dette gir mulighet til å ta aktivitet på en befolkning nivå, noe som kan gi ny innsikt i prosessene som regulerer neurogenesis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra NIH (DC007681, AB), CT Stem Cell stipend (AB), Pardee fundament (AB), Predoctoral Ruth L. Kirschstein National Research Service Awards (NRSA) (SZY), og en NSF Graduate Research Fellowship (BL). Vi takker Bordey lab medlemmer for nyttige kommentarer på manuskriptet. Det foreliggende materiale er basert på arbeid delvis støttet av staten Connecticut under Connecticut Stem Cell Research Grants Program. Innholdet er utelukkende ansvaret av forfatterne og ikke nødvendigvis representerer den offisielle syn i staten Connecticut, Department of Public Health i delstaten Connecticut eller CT Innovations, Incorporated.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Sigma | S0389 | Dissection: 147 mM ACSF: 0 mM |
| NaCl | Sigma | S9888 | Dissection: 42 mM ACSF: 126 mM |
| KCl | Sigma | P3911 | Dissection: 2.5 mM ACSF: 2.5 mM |
| MgCl2.6H2O | Sigma | M9272 | Dissection: 4.33 mM ACSF: 1 mM |
| NaH2PO4.H2O | Sigma | S8282 | Dissection: 1.25 mM ACSF: 1.25 mM |
| Glucose | Sigma | G8270 | Dissection: 10 mM ACSF: 10 mM |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | Dissection: 26 mM ACSF: 26 mM |
| CaCl2.2H2O | Sigma | C3306 | Dissection: 1.33 mM ACSF: 2 mM |
Table 1. Chemical list and recipes of dissection solution and ACSF. |
|||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vibratome | Leica | VT 1000S | |
| Super Glue | Surehold or 3M | Surehold 3G Super Glue or 3M Vet-Bond | |
| Dissection tools | Roboz or Ted Pella | ||
| Fluo-4 AM calcium-sensitive dye | Invitrogen | F14201 | |
| Oregon Green BAPTA-1 AM calcium-sensitive dye | Invitrogen | O6807 | |
| Pluronic F-127 20% solution in DMSO | Invitrogen | P3000MP | |
| Upright confocal microscope | Olympus | FV300 or FV1000 | |
| Water-immersion objectives | Olympus | LUMPlanFl 40 x W/IR (NA 0.80); LUMPlanFl 60 x W/I (NA 0.90) | |
| Micromanipulators | Sutter | MPC-200/MPC-325/MPC-385 | |
| Pressure controller | Parker Hannifin | Picospritzer | <3 PSI during application |
| Pipette puller | Sutter or Narshige | Sutter P-97 or Narshige PP-830 | |
| Glass pipettes | Sutter | BF150-110-10 | I.D.:1.10, O.D.: 1.50 |
| Peristaltic pump | Harvard Apparatus | Model 720 | flow rate: 1 ml/min |
| Chamber bath | Warner Instruments | RC-26 GLP | Low profile allows for objective clearance |
| Tubing | Tygon | ||
| Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B/344B | |
Table 2. Materials/equipment list. |
|||
References
- Peretto, P., Giachino, C., Aimar, P., Fasolo, A., Bonfanti, L. Chain formation and glial tube assembly in the shift from neonatal to adult subventricular zone of the rodent forebrain. J. Comp Neurol. 487, 407-427 (2005).
- Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. Imaging and recording subventricular zone progenitor cells in live tissue of postnatal mice. Front. Neurosci. 4, 10-3389 (2010).
- Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. Gap junction-mediated calcium waves define communication networks among murine postnatal neural progenitor cells. Eur. J. Neurosci. , (2011).
- Platel, J. C., Dave, K. A., Gordon, V., Lacar, B., Rubio, M. E., Bordey, A. NMDA receptors activated by subventricular zone astrocytic glutamate are critical for neuroblast survival prior to entering a synaptic network. Neuron. 65, 859-872 (2010).
- Platel, J. C., Dupuis, A., Boisseau, S., Villaz, M., Albrieux, M., Brocard, J. Synchrony of spontaneous calcium activity in mouse neocortex before synaptogenesis. Eur. J. Neurosci. 25, 920-928 (2007).
- Young, S. Z., Platel, J. C., Nielsen, J. V., Jensen, N. A., Bordey, A. GABAA increases calcium in subventricular zone astrocyte-like cells through L- and T-type voltage-gated calcium channels. Front. Cell. Neurosci. 4, 8 (2010).
- Bolteus, A. J., Bordey, A. GABA Release and Uptake Regulate Neuronal Precursor Migration in the Postnatal Subventricular Zone. J. Neurosci. 24, 7623-7631 (2004).
- Platel, J., Heintz, T., Young, S., Gordon, V., Bordey, A. Tonic activation of GLUK5 kainate receptors decreases neuroblast migration in a whole mount preparation of the subventricular zone. J. Physiol. (Lond). 586, 3783-3793 (2008).
- Nam, S. C., Kim, Y., Dryanovski, D., Walker, A., Goings, G., Woolfrey, K., Kang, S. S., Chu, C., Chenn, A., Erdelyi, F., Szabo, G., Hockberger, P., Szele, F. G. Dynamic features of postnatal subventricular zone cell motility: a two-photon time-lapse study. J. Comp. Neurol. 505, 190-208 (2007).
- Lacar, B. L., Platel, J. C., Bordey, A. GABA controls Ca2+ activity-dependent network synchrony in the adult neurogenic forebrain. Neuroscience Meeting Planner, San Diego, CA, , Society for Neuroscience. (2007).
- Liu, X., Bolteus, A. J., Balkin, D. M., Henschel, O., Bordey, A. GFAP-expressing cells in the postnatal subventricular zone display a unique glial phenotype intermediate between radial glia and astrocytes. Glia. 54, 394-410 (2006).
- Wang, D. D., Krueger, D. D., Bordey, A. Biophysical properties and ionic signature of neuronal progenitors of the postnatal subventricular zone in situ. J. Neurophysiol. 90, 2291-2302 (2003).
- Tian, L., Hires, S. A., Mao, T., Huber, D., Chiappe, M. E., Chalasani, S. H., Petreanu, L., Akerboom, J., McKinney, S. A., Schreiter, E. R., Bargmann, C. I., Jayaraman, V., Svoboda, K., Looger, L. L. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).
- Zhao, Y., Araki, S., Wu, J., Teramoto, T., Chang, Y. F. An expanded palette of genetically encoded Ca(2) indicators. Science. 333, 1888-1891 (2011).
- Shigetomi, E., Kracun, S., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. A genetically targeted optical sensor to monitor calcium signals in astrocyte processes. Nat. Neurosci. 13, 759-766 (2010).
