Summary
단백질 misfolding의 순환 증폭 (PMCA)는 prion 변환과 변형 및 종 장벽의 연구에서 시험 관내 분석이다. 또한 prion 검출 분석으로 사용할 수 있습니다.
Abstract
Prions 동물과 인간 9,18에 필연적으로 치명적인 전도 할 수있는 해면상 뇌병증 (TSE)을 일으킬 전염성 대리인입니다. prion 단백질은 두 개의 isoforms, 비 전염성 호스트 인코딩 단백질 (PRP C) 및 전염성 단백질 (PRP SC), PRP C 8 비정상적으로 - 접힌 이소 형이 있습니다.
prion 에이전트 작업의 과제 중 하나는 이전의 호스트 접종 13 다음 임상 증상의 발전에 긴 잠복기입니다. 이 전통적으로 길고 비싼 동물 bioassay 연구를 위임. 또한, PRP SC의 생화학 및 biophysical 속성이 제대로 자신의 특이한 형태와 집계 상태로 인해 특징을 가지고 있습니다.
PRP SC는 체외 14 PRP SC에 PRP C의 씨앗 변환 할 수 있습니다. PMCA은 adva 소요의 체외 기술이다PRP C와 PRP SC의 씨앗 19 분 금액을 초과하는 금액을 포함하는 시스템에서, 가속 속도로, PRP SC 많은 양의 생산 sonication과 부화주기를 사용하여이 능력을 ntage. 이 기술은 효과적으로 prion 변형 간섭을 에뮬레이션하기 위해 PRP C에서 PRP SC 전환의 종과 변형 특성을 요점을 되풀이하고, 감염된 조직, 체액, 환경 샘플 6,7,16에서 PRP SC의 매우 낮은 수준을 증폭하기 위해 증명되었습니다 23.
, 오염을 최소화 일관된 결과를 생성하고, 그 결과를 정량화에 대한 권장 사항을 포함 본 논문은 내용 PMCA 프로토콜을. 우리는 또한 전염성 prion의 변종, prion 변형 간섭 및 환경에서 prions의 감지의 생성 및 특성 등 여러 PMCA 응용 프로그램을 논의합니다.
Protocol
1. 장비 준비
- Misonix 3000이나 37 일정 온도를 유지하기 위해 열 전자 Neslab EX-7 물 목욕 (이케아, NH)에 연결 Misonix 4000 sonicator (Farmingdale, NY) ° C.를 사용하여 열 과학 (Waltham, MA)에서 얻은 돔 캡 200 μl 얇은 벽 PCR 관 스트립의 샘플을 Sonicate.
- 새로운 sonicator는 지속적인 작동 9 '브레이크에서 "기간이 필요합니다. 두 달간 브레이크의 기간은 10로 설정 진폭 수준 40 초 sonication 버스트 10 분 부화 사이클 구성되어 있습니다. 하나는 티타늄 microplate 뿔 (그림 1, 패널 B)의 표면에 걸쳐 침식을 준수해야합니다. 순환 물은 티타늄 microplate 뿔의 침식으로 인해 흰 유탁을 찾습니다. 매일이 물을 교체합니다.
- PRP SC의 증폭은 microplate의 뿔에 걸쳐 다양합니다. 가장 PRP SC 증폭 효율에서 구할 수 있습니다microplate 뿔 (그림 1, 패널 C 참조)의 중심에서 5cm의 반경입니다.
- PMCA 중 하나 라운드는 144 사이클을 구성되어 있습니다. 각주기는 5 초 sonication과 10 분 부화로 구성됩니다. 이 약 PMCA의 원형 당 24 시간에 수반합니다.
- sonicator의 제어판에 표시 sonication의 전원 출력은, sonicator의 랙과 물 목욕에서 순환 물 온도에 존재하는 PCR 튜브의 수에 따라 다릅니다. 물이 37 ° C에서 equilibrated 있는지 확인하고, sonicator의 튜브 랙 (그림 1, 패널 C)의 약 30 % 이상을 입력하지 않습니다. microplate의 뿔을 통해 PCR 튜브를 분산. PCR 관 스트립 사이의 빈 공간의 적어도 하나의 행을 가지고 (그림 1, 패널 C) 스트립 당 서로 연결 더 이상 사 이상 튜브를 할 수 있습니다.
- sonication의 힘은 성공적으로 prion 변형 증폭을위한 중요합니다. sonicating 동안 전원 출력을 가지고 진폭을 조정155 ~ 170w 사이에 이르기까지. 저희 연구실에서 전력 수준은 각각 여섯 Misonix 3000 및 Misonix 4000 7로 설정되어 있습니다.
- 하드 물 얼룩을 축적 방지하기 위해 물 욕조에 증류수를 사용합니다. 이 물 주간를 교체합니다. 부화와 sonication 사이클 동안, 물 응축의 microplate 통 뚜껑 안쪽에 발생합니다. 그림 1, 패널 A. 같이 결로를 방지하려면 sonicator의 인클로저 상자의 상단에 작은 수족관 열 패드를 부착
2. 샘플 준비
- 동물을 포함한 모든 절차가 크 레이튼 대학 기관 동물 케어의 승인을위원회를 사용하여 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드를 준수했다. 조직의 수집하기 전에 동물이 anesthetized 및 transcardially 얼음처럼 차가운 인산염을 사용하여 perfused해야합니다은 뇌에서 피를 제거하고의 억제를 방지하기 위해 산도 7.4에서 5 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 생리 식염수를 버퍼혈액에 7 PMCA 반응. 무균 기술을 사용하여 빠른 속도로 동물 조직을 수집하고 각 prion 변형을위한 전용 분해 도구를 제공합니다. 절개 후, 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 조직을 배치, 플래시 드라이 아이스에 고정하고, -80에서 보관 ° C를 균질화까지.
- PMCA 기판 (PRP C) 솔루션을 준비하려면 Tenbroeck 조직 분쇄기를 사용하여 얼음 차가운 변환 버퍼와 10 %의 중량 / 부피 (w / V) 솔루션 (3 부 참조)에 감염되지 않은 햄스터 뇌를 (UN BH) 균질화. homogenizing 있지만, 솔루션의 거품 과도한 방지하기 위해 그라인더 내부에 공기를 얻을하지 마십시오. 30 초와 나누어지는 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브의 표면에 뜨는 500 XG에 centrifuging하여 솔루션을 명확히하십시오. -80에서 저장 ° C 더 사용까지.
- PMCA 씨 (PRP SC) 솔루션을 준비하려면, 얼음 차가운 wate하는 10 % w / V 솔루션으로 전염성 물질 (뇌, 비장, 림프절, 다른 조직이나 오염 된 토양)을 균질화0.6 ML의 microcentrifuge 튜브의 연구와 나누어지는 솔루션입니다. -80에서 저장 ° C 더 사용까지.
3. 변환 버퍼를 준비
- 50 ML의 용적 플라스크 (결과는 트라이 튼 X-100의 1 % 최종 농도)을 (; Steinheim, 독일 시그마 - 알드리치 GmbH의)에서 트리톤 X-100의 0.5093 g 무게.
- 하나의 완전한 단백 분해 효소 억제제 태블릿 (, 만하임, 독일 로슈 진단 GmbH가)를 추가합니다.
- EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 0.0931 g (이 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 5 MM 최종 농도가 높아집니다) (, Phillipsburg, NJ Mallinckrodt 베이커 주식회사)를 추가합니다.
- 1N NaOH를 7.4로 산도를 조정합니다.
- Dulbecco의 인산과 50 ML에 볼륨을 조정합니다 (, Manassas, VA Mediatech 주식회사) (DPBS) 식염 버퍼링.
- 진공 여과 장치와 0.45 μm의 니트로 셀룰로스 막 통해 솔루션을 필터링 할 수 있습니다. 변환 버퍼는 더 이상보다 달 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다.
4. PMCA를 사용 Prion의 변종의 증폭
- PCR 튜브에 1시 20분의 비율 (PMCA 씨와 PMCA 기판의 95 μl의 예 혼합 5 μl)에 PMCA 기판에 PMCA의 씨앗을 희석. -80에서 15 μl 나누어지는을 제거하고 저장 ° unsonicated 제어를위한 C,이 unsonicated 제어는 서양 얼룩 (WB) 분석에 의해 다음 proteinase K (PK) 소화를 통해 PRP SC 증폭을 수량화하는 데 사용됩니다. 추가 unsonicated 제어는 PMCA 반응의 기간 동안 37 ° C에서 두 번째 15 μl 나누어지는을 배치에 의해 생성 될 수 있습니다. 세 반복의 최소 통계 목적을 위해 필요합니다.
- 제목 그림 1에 설명 된대로 PMCA 중 하나 라운드에 샘플의 나머지 (70 μl), 패널 A. 흔들어서는 튜브 PCR 튜브의 돔 뚜껑에 물 응축을 방지하기 위해 매 5 시간입니다.
- 샘플의 튜브는 아래 돌다가 부드럽게 homog 보장 할 절차 후 열기 전에 (솔루션 돔 모자에 가서하지 않는 것이 조심하는) vortexed해야eneity하고 잠재적 인 오염을 피할 수 있습니다.
- 짧은 잠복기의 변종 (예 : HY TME, HaCWD, 또는 263K)의 시리얼 PMCA (sPMCA)의 경우, 신선한 감염되지 않은 95 μl로 라운드에서 sonicated 샘플의 5 μl를 전송하여 1시 20분의 비율에 sonicated 자료를 희석 뇌 homogenate (그림 2, 패널 B).
- 긴 잠복기의 변종 (예 : DY TME, 139H, 22CH, 22AH, 또는 ME7H)의 sPMCA를 들어, 신선한 감염되지 않은 50 μl로 라운드에서 sonicated 샘플의 50 μl를 전송하여 1시 1분의 비율에 sonicated 자료를 희석 뇌 homogenate (그림 2, 패널 B).
- 이전에 희석 sonicated 혼합물 (단계 4.4 또는 4.5)에서 두 15 μl aliquots를 제거하고 -80에서 둘 중 하나를 저장하는 37 번 ° C와 다른 ° C (PMCA 2 회전 unsonicated 제어 솔루션). PMCA 두번째로 생물 될 수 있습니다.
- 이 절차는 무한정 반복 할 수 있습니다. 저희 연구실에서는, 우리는변경되지 않은 나머지 변형 특성 15 PMCA 라운드까지 수행했습니다.
- PK는 샘플을 소화. 전형적인 WB의 경우, 5 샘플의 PK 80 μg / ML 5 μl (이 솔루션은 40 μg / ML의 최종 PK 농도를해야합니다)의 μl 한 시간 동안 37 ° C에서 배양을 섞는다. 겔로드 버퍼의 10 μl를 추가합니다. 10 분에이 솔루션을 끓일. 솔루션은 냉각과 젤에 10 μl를로드 보자.
- 증폭의 성공을 계산하는 것은 하나에 비교하여 증폭 PRP SC의 양을 추정하기 위해 PK-소화 샘플에 WB 분석을 수행 unsonicated 컨트롤 20,21 그림 2, 패널 C 또는 알려진 금액으로는 재조합 PK-소화되지 않은 PRP.
5. 교차 오염을 방지
중요한 단계는 교차 오염 및 단백 분해 효소 방지 제품의 드 노보 형성으로 인해 잘못된 반응의 발생을 최소화하기 위해 이동해야합니다.
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Representative Results
단백질 misfolding의 순환 증폭 (PMCA)는 체외 7 PRP SC, 12, 14, 19, 24을 증폭하는 데 사용됩니다. 성공적으로 PRP SC 증폭은 그림 3과 같이 PK 방지 prion 단백질 (햄스터 파생 prion의 변종이 19 ~ 30 kDa를 마이그레이션)의 서양 blots에 밴드 강도의 증가에 의해 표시됩니다.의 밴드 강도의 증가는 이후 PMCA는 PK 방지 PRP SC 소재의 증폭을 나타냅니다. 햄스터 - 파생 prion 단백질, HaCWD와 DY TME의 성공 증폭는 PMCA 전에 (레인 5, 7) 및 (레인 4 6) 후 밴드 강도를 비교하여 그림 3의 WB 분석에 표시됩니다.
PRP SC의 PK는 소화 각각 디 -, 모노, 그리고 unglycosylated prion 단백질에 해당하는, 상단 중간 및 하부 밴드를 보여줍니다 WB 분석이 나타납니다. 일부 prion의 변종들은 엘레으로 구분 될 수있다ctrophoretic 이동성. 예를 들어, HaCWD와 DY TME의 prion의 변종 사이의 마이그레이션에 두 kDa의 차이가 있습니다. (각각 그림 3, 레인 1과 2).
고 충실도 PRP SC 증폭는 PMCA 1, 7, 12, 19, 23, 24에 의해 달성된다. 레인 HaCWD와 DY TME 1, 4, 2 & 6, 해당 씨앗 (그림 3에 비해 PMCA 증폭의이 고 충실도는 PMCA - 증폭 prion의 변종 (HaCWD와 DY TME)의 유사한 전기 이동에 의해 관찰된다 각각).
더 교차 오염 또는 드 노보 PRP SC 형성이 발생하지 않으면, 가짜 제어 PMCA 샘플 WB 분석은 PK의 소화 (그림 3, 레인 8, 9) 이후에 명확 유지해야합니다.
1 그림. 물 응축을 방지하기 위해 정기적으로 수족관은 열 패드는 microplate 뿔 (패널 A)의 뚜껑 위에 배치됩니다. 새로운 sonicator가 가능해야합니다 브레이크에서 한 두 달 연속 sonication 기간. 패널 B는 브레이크의 기간 이후 티타늄 microplate 뿔에 침식을 보여줍니다. 패널 C는 샘플의 최적의 sonication을 허용 PCR 관 스트립의 가능한 배열을 보여줍니다.
그림 2. PMCA (패널 A), sPMCA (패널 B) 및 WB 분석 (패널 C)에 대한 흐름 차트입니다. PRP SC는 PMCA 씨와 감염되지 않은 뇌 homogenate 것은 (UN BH) PMCA 기판입니다. 각 PMCA 원형의 증폭 PRP SC의 정량화는 PMCA 전에 해당 밴드 강도에 의해 PMCA 후 밴드 강도를 나누어 얻어진다.
그림 3. PK - 소화 HaCWD와 DY TME 햄스터 파생 prion의 변종의 서양 되리. PRP SC는 3F4 방지 prion 항체를 사용하여 검출된다. WB의 분석 풍부 (얼룩 강도) 및 PRP SC의 전기 영동을 보여줍니다. PMCA 반응은 HaCWD (레인 4-5) 또는 DY TME (차선 6-7) 에이전트 중 하나에 감염된 햄스터의 뇌 homogenate를 놓는했다. 컨트롤 (차선 5-4와 7-6를 비교) - 자신의 unamplified (PMCA)에 비해 PMCA을 받았습니다 샘플 (PMCA +)는 PRP SC의 풍부한 증가를 보여줍니다. HaCWD와 DY TME (차선 1-2)의 prion 단백질의 전기 영동 마이그레이션의 두 kDa의 차이가 있습니다. 마이그레이션의 차이는 HaCWD와 DY TME의 homogenates을 (각각 레인 4 번과 6 번,)를 사용하여 PMCA 생성 된 샘플에 유지됩니다. 감염되지 않은 뇌 (가짜) homogenate를 놓는 PMCA 반응은 P를 증폭하지RP SC (레인 8). 분자 마커 19과 21 kDa의 위치는 패널의 왼쪽에 표시됩니다.
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Discussion
증폭기 전염성 prion 단백질의 과제는 생체 실험의 긴 잠복 기간 및 비용입니다. PMCA 기술은 전염성 prion 요원을 증폭 할 수있는 비용 효과적인 수단입니다. 여러 실험실 정확하게 체외 7, 9, 12, 14, 19,24에 prion의 긴장을 증폭 할 수 PMCA의 능력을 확인하고 있습니다.
Prion 질환은 종 사이에 전염 될 수 있습니다. Bessen 및 습지 효과적으로 두 개의 햄스터 파생 prion의 변종 5 제작 보낼 수있는 밍크 뇌병증와 햄스터를 주사했습니다. 우아한 연구에서, 말하기 및 동료는 마우스 파생 prion 변형, RML을 확대하려면 sPMCA를 사용 cervid PRP C 표현 형질 전환 생쥐를 사용 - PMCA 기판으로 (TG (CerPrP) 1536 + /)를. 질병의 빠른 발병은 TG의 접종 (CerPrP) 이후에 관찰 된 1,536 + / - PMCA - 적응 재료 12. 마찬가지로, 커트 외이 있습니다. 증폭 할 수 있었다비 cervid 종 PMCA 기판 15을 사용하여 만성 낭비 질환 (CWD), cervids에서 prion 질환. 이 데이터는 prion 질환의 종의 장벽이 PMCA을 통해 체외에서 무시 될 수 있습니다하는 것이 좋습니다.
Bessen과 습지는 긴 잠복 기간 대응, DY TME 3, 5에 비해 햄스터의 짧은 잠복기 변형, HY TME는 빨리 PRP SC 축적이 것으로 나타났습니다. 마찬가지로, 부화 기간 및 축적 속도 사이의 상관 관계는 여러이 햄스터 파생 prion의 변종 1, 23, 24에 PMCA 후 관찰됩니다.
증폭 율은 각 변형에 고유 한 속성입니다. PMCA이 증폭 율을 수량화하는 데 사용되었습니다. 에어 외이 있습니다. 주어진 햄스터 파생 prion 스트레인 1 증폭의 속도를 나타내는 unitless 번호, 칭했다 증폭 계수를 계산 할 수있었습니다.
Prion긴장은 같은 호스트에 존재하면 서로 방해가 될 수 있습니다. 긴 잠복기 변형의 존재는 부화 기간을 연장하거나 질병을 일으킬 수있는 짧은 잠복기 변형의 능력을 차단할 수 있습니다. 잠복기에있는이 확장 기능은 스트레인 간섭을 칭했다있다. 스트레인 간섭이 마우스 10 햄스터 22에서 발생하는 표시되었습니다. 바츠 및 동료 햄스터에 prion 변형 간섭을 공부 PMCA를 사용하고 있습니다. 그들의 결과는 PMCA 실험은 생체 22, 23에서 비슷한 실험의 결과와 상관 관계를 보여준다.
중추 신경계 이외의 PRP SC의 상대적으로 낮은 수준이 때문에, prions는 정확하게 immunohistochemistry에 이어 뇌의 해부를 통해 사후 진단 할 수 있습니다. 이 PRP SC 7 분 양을 증폭의 훌륭한 능력을 보여 주었다부터 PMCA도 햄스터의 소변 sampl에서, 진단 도구로 사용할 수 있습니다에스 11.
prion 에이전트는 열악한 환경 조건을 견딜 수 있으며 16,17 전염성 유지 할 수 있습니다. 그러나 환경에서 PRP SC의 양이 종래의 기술 한테 그런 WB를 사용하여 검색 할 너무 작습니다. PMCA는 이러한 토양과 물 16으로 PRP SC 환경의 대략적인 양, 17, 20, 21 증폭하고 계산하는 데 사용되었습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
우리는 원고의 중요한 읽기에 대한 박사 개밥 바라기 철 마리 라모스 감사드립니다. 이 작품은 연구 자원에 대한 국립 센터 (P20 RR0115635-6, C06 RR17417-01 및 G20RR024001)과 국립 신경 질환 연구소와 스트로크 (2R01 NS052609)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Misonix 3000 | Misonix | S-3000 | |
| Misonix 4000 | Misonix | S-4000 | |
| Tenbr–ck Tissue Grinder | Kontes | 885000-0007 | |
| Neslab EX-7 Water Bath | Thermo Electron | Neslab EX-7 | |
| 0.2 ml PCR Tube Strips | Thermo Scientific | AB-0451 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284-100ML | |
| Complete Protease Inhibitor | Roche | 11 697 498 001 | |
| EDTA | J.T. Baker | 4040-00 | |
| DPBS | Mallinckrodt Baker Mediatech | 21-031-CV | |
| Versi-Dry Lab Soakers | Fisher Scientific | 14 206 28 | |
| Repti Therm Heater | Zoo Med Laboratories, Inc. | RH-4 |
References
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