Summary
蛋白质错误折叠循环放大（PMCA）的的朊病毒转化和应变和物种障碍的研究是在体外试验。它也可以被用作朊病毒检测法。
Abstract
朊病毒是传染性病原体的动物和人类9,18导致的必然致命的传染性海绵状脑病（TSE）。的朊蛋白有两个不同的异构体，非传染性的主机的编码蛋 白（PrP的C）和传染性蛋白（的PrP Sc）的，异常折叠的PrP〜C 8异构体。
朊病毒代理工作所面临的挑战之一是潜伏期长，临床症状主机接种后13前的发展。传统的授权和昂贵的动物生物测定研究。此外，生物化学和生物物理性能差的特点，其特殊的构象和聚集状态的PrP Sc的 。
的PrP sc可以转换的PrPÇ的PrP Sc的种子在体外 14。 PMCA是一种体外技术，需要阿德瓦ntage这种能力，利用超声和孵化周期产生大量的PrP Sc的 ，以更快的速度，从系统中含有过量的PrP C和微量的PrP Sc的种子19。这种技术已被证明，有效地重述物种和应变特异性的PrP Sc的转换，从蛋白Ç，干扰模拟朊病毒应变，并扩增的PrP Sc的非常低的水平，从受感染的组织，体液，及环境样品6,7,16， 23。
本文详细介绍了的PMCA协议，包括减少污染，产生一致的结果，这些结果和量化的建议。我们也讨论了几个的PMCA应用，包括株传染性朊病毒，朊病毒应变干扰，检测朊病毒的环境中产生和表征。
Protocol
1。准备设备
- 使用Misonix 4000 3000或Misonix的超声波仪，（纽约法明达）连接到一个热电NESLAB EX-7水浴（纽因顿，NH），以保持恒定的温度为37°C。超声波清洗的样品在200微升薄壁的PCR管带与赛默飞世尔科技（马萨诸塞州沃尔瑟姆）获得的圆顶帽。
- 一个全新的超声发生器需要一个“磨合”期，连续工作9。甲两个月的磨合期由40秒的超声处理突发和孵育10分钟的周期与振幅电平设置为10。人们应该观察的，钛微孔板角（ 图1，B组）的整个表面的侵蚀。循环水看白色混浊的钛微孔板角的侵蚀。请此水每天更换。
- 放大的PrP Sc的变化整个微孔板角。最好的PrP Sc的扩增效率，可以得到内从喇叭形的微孔板的中心（参见图1，面板C）的半径为5厘米。
- 一个圆形的PMCA由144个时钟周期。每个周期由5秒超声和孵育10分钟。这大约涉及到24小时，每一轮的PMCA。
- 的功率输出的超声处理，超声波发生器的控制面板上显示的，与PCR管中存在的超声波发生器的机架和从水浴中的循环水的温度的数目而变化。确保在37°C的水平衡，不填写超声发生器的管架（ 图1，C组）的30％以上。传播的PCR管通过微孔板角。具有至少一个行的PCR管条带之间的空的空间，并允许不超过四个管连接在一起，每带（ 图1，C组）。
- 超声处理的强度是至关重要的一个成功的朊病毒应变放大。声波处理的同时，调整振幅有一个输出功率在155〜170瓦不等。在我们的实验室中，功率电平被设置为6和7分别为Misonix 3000和Misonix 4000，。
- 在水浴中使用蒸馏水，以避免积累硬水渍。更换这水每周。在孵化和超声循环，冷凝水会发生内部的的微孔板喇叭盖。为避免结露，将图1所示，面板A.超声波仪的外壳中上方的一个小鱼缸加热垫
2。准备样品
- 所有程序，涉及动物，克赖顿大学实验动物护理和使用委员会批准，并遵守实验动物护理和使用指南。在任何组织收集之前，动物必须是麻醉，和transcardially灌注的用冰冷的磷酸盐缓冲生理盐水溶液用5mM EDTA在pH = 7.4，以除去血液从大脑和避免抑制PMCA反应的血液7。迅速收集动物组织使用无菌技术，并有专门的清扫工具，为每个朊应变。解剖后，将组织的1.5 ml离心管，闪光冻结干冰，并将其存储在-80°C至同质化。
- 为了制备PMCA基板（PrP的C）的解决方案，在未感染的仓鼠脑（联合国BH）至10％重量/体积（w / v的）用冰冷的转换缓冲溶液（见第3部分），使用Tenbroeck组织研磨机均匀。在均质过程中，要注意不要让车内空气磨床的解决方案，以避免过多的泡沫。澄清溶液经离心分离，在500×g离心30秒和等分试样在1.5毫升微量离心管的上清液。储存在-80℃，直到进一步使用。
- 为了制备的PMCA种子（的PrP Sc）的溶液，均质传染性物质（脑，脾，淋巴结，以及其他组织或污染土壤）的10％w / v溶液，用冰冷的娃在0.6ml离心管中，r和分装解决方案。储存在-80℃，直到进一步使用。
3。准备转换缓冲区
- 称量0.5093克的Triton X-100的在50毫升容量瓶中（结果最终浓度为1％的Triton X-100）（Sigma-Aldrich公司的联系; Steinheim，德国）。
- 一个完整的的蛋白酶抑制剂平板（罗氏诊断公司，德国曼海姆）。
- 加入的EDTA0.0931克（这将导致在5mM的最终浓度为EDTA）导管（Mallinckrodt，贝克公司;新泽西州菲利普斯堡）。
- 用1N NaOH将pH调节至7.4。
- 调整音量至50毫升，用Dulbecco磷酸盐缓冲液（DPBS）（敏达公司，弗吉尼亚州马纳萨斯）。
- 过滤该溶液，通过0.45μm的硝酸纤维素膜，用真空过滤装置。转换缓冲器可以存储在4℃下不超过1个月。
4。朊病毒菌株的扩增使用PMCA
- 稀释PMCA种子进入PMCA基板到PCR管的比例为1:20（ 即混合5微升PMCA种子和95微升的PMCA基板）。取出并妥善保管15μL上清置于-80°C unsonicated控制，这unsonicated控制将被用来量化的PrP Sc的放大通过蛋白酶K（PK）消化，免疫印迹法（WB）分析。一个额外unsonicated控制可以产生的PMCA反应的持续时间，在37℃下放置一个第二个15微升等分试样。至少重复三次作统计用途。
- 主题的样品（70微升）的其余部分的一个轮的PMCA，如在图1上所示，面板A.摇管上的圆顶的PCR管，以避免水凝结每5小时。
- 样品的管应被剥离下来，轻轻振荡（要小心这样的解决方案不进入圆顶），然后再打开后，任何程序，以确保homogeneity和避免潜在的污染。
- 对于串行PMCA（sPMCA）的短潜伏期株（ 即 HY TME，HaCWD，或263K），超声波处理的材料在1:20的比例稀释，将超声处理5微升的样品，从第一轮为95微升新鲜的未受感染的脑匀浆中（ 图2，图B）。
- 对于sPMCA长潜伏期株（ 即 DY TME，139H，22CH，22AH，或ME7H）的，在以1:1的比例稀释的超声处理的材料通过从圆一个50微升的超声处理的样品转移到50微升新鲜的未感染脑匀浆中（ 图2，图B）。
- 卸下两个15微升等份从预先稀释的超声处理的混合物（来自步骤4.4或4.5）中，并存储其中之一，在-80℃下和在37℃下（unsonicated PMCA第二轮的控制解决方案）。一个PMCA第二轮主题的残余物。
- 此过程可无限地重复。在我们的实验室中，我们已经执行最多15 PMCA轮，与应变性能保持不变的。
- PK消化的样品。对于一个典型的WB混合5μl的PK 80μg/ ml到5μl的样品（此溶液将具有PK的最终浓度为40微克/毫升），并在37℃下孵育一小时。凝胶上样缓冲液中加入10μl。此溶液中煮沸10分钟。让该溶液冷却并加载到凝胶中的10微升。
- 要计算成功扩增执行WB分析估计量放大的PrP Sc的 PK消化的样品进行比较，他们要么，在unsonicated的控制20,21 图2，图C为已知金额的PK-未消化的重组PRP。
5。避免交叉污染
应采取的关键步骤，以减少交叉污染和误报的发生，由于新形成的蛋白酶产品耐。
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Representative Results
蛋白质错误折叠循环放大（PMCA）是用来放大的PrP Sc 在体外培养 7，12，14，19，24。一个成功的PrP Sc的扩增谱带强度的增加，如在图3中所示的PK抗朊病毒蛋白（19和30之间的迁移的kDa的仓鼠派生朊病毒株）的Western印迹上所示。后其谱带强度的增加PMCA表示扩增的PK-抗性的PrP Sc的材料。成功扩增仓鼠派生朊病毒蛋白，HaCWD和DY TME，在WB分析图3所示，通过比较前谱带强度（泳道5和7）和后（泳道4和6）PMCA。
随后经WB分析PK消化的PrP 钪显示的上部，中部和下部的频带相对应的二- ，单- ，和非糖基化的朊蛋白，分别。某些朊病毒株可以区分它们的元素ctrophoretic的流动性。比如，有一个两kDa的差异之间的迁移的HaCWD和DY的TME朊病毒菌株。 （ 图3，分别为泳道1和2）。
一个高保真的PrP Sc的放大是通过的PMCA 1，7，12，19，23，24。这种高的保真度在PMCA扩增的观察到的PMCA扩增朊病毒的菌株（HaCWD和DY TME）由一个类似的电泳迁移到其对应的种子（ 图3，泳道1和4以及2＆6为HaCWD和DY TME的相比时，分别）。
如果没有交叉污染或从头的PrP Sc的形成过程中，WB分析的模拟控制PMCA样品应保持清醒的PK消化后（ 图3，泳道8和9）。
图1。为了避免水的缩合，定期水族馆热垫放置的微孔板喇叭（面板A）上方的盖。全新的超声波仪，应该允许一个磨合期，为期约两个月的连续超声。图B显示的对钛微孔板角的侵蚀后的磨合期。面板C示出了一个可能的安排，将允许获得最佳的超声处理的样品的PCR管条。
图2。sPMCA PMCA（A组），（B组），和WB分析（C组）的流程图。的PrP Sc为PMCA种子和未感染的脑组织匀浆（UN BH）的PMCA基板。的定量是通过以下方式获得的扩增的PrP Sc的为每个PMCA回合后PMCA谱带强度除以由其相应的前谱带强度PMCA。
图3 Western blot检测 PK消化的HaCWD和DY来自TME仓鼠的朊病 毒株。的PrP Sc的使用3F4抗朊病毒的抗体检测。世界银行的分析显示了丰富印迹强度和电泳迁移率的PrP Sc的 。 PMCA接种反应与感染的HaCWD（泳道4-5）或DY TME（泳道6-7）代理从仓鼠脑匀浆。样品接受PMCA（PMCA +）示出了增加的PrP Sc的丰度时相比，其未放大的（PMCA - ）对照组（比较泳道5至4和7至6）。有一个两kDa的差异的HaCWD和DY TME（泳道1-2）之间的朊蛋白的电泳迁移。迁移中的这种差异被保持在PMCA生成样品，使用HaCWD和DY TME匀浆（泳道4和6），分别。 PMCA反应接种与未感染的脑组织匀浆（模拟）无法放大PRP SC（第8泳道）。面板左侧的表示为19和21 kDa的分子标记物的位置。
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Discussion
放大传染性朊病毒蛋白质的挑战是在体内实验中的潜伏期长和费用。 PMCA技术是一种经济有效的手段，放大传染性朊病毒剂。几个实验室已证实的能力PMCA准确放大朊病毒株在体外 7，第9，第12，14，19,24。
朊病毒疾病可以物种之间发送。贝森和湿地，有效地接种仓鼠传染性貂脑病，这就产生了两个不同的地鼠源性朊病毒株5。在一个优雅的学习，告诉和他的同事使用sPMCA来放大鼠标衍生朊应变，RML，利用转基因小鼠表达cervid的PrP C（的Tg（CerPrP）的1536 + / - ）PMCA基板。一种快速疾病发作，观察接种后的Tg（CerPrP）1536 + / -与PMCA适应的材料12。同样，库尔特等。能够放大慢性消耗病（CWD），朊病毒病的鹿，使用的非cervid种PMCA基板15。这些数据表明，朊病毒疾病中的种间屏障可以绕过在体外通过PMCA。
贝森和沼泽，仓鼠的短潜伏期株，HY TME相比，其长对应的潜伏期，的DY TME 3，5，具有更快的PrP Sc的积累。同样地，这种相关性之间的潜伏期和积累率后观察到PMCA几个仓鼠派生的朊病 毒菌株1，23，24中。
的扩增率是每个菌株的固有的属性。 PMCA已被用来量化这种扩增率。 Ayers 等人能够计算出一个无单位的数量，被称为放大系数，表示对于一个给定的的仓鼠派生朊病毒菌株1的扩增率。
朊病毒菌株可以互相干扰，当存在于相同的主机。一个很长的潜伏期株的存在可以延长潜伏期，甚至阻塞引起疾病的潜伏期短，应变能力。这被称为潜伏期延长应变干扰。应变已被证明在小鼠10和仓鼠22发生干扰。巴茨和他的同事使用PMCA研究在仓鼠朊毒体应变干扰。他们的研究结果表明，PMCA实验与一个类似的实验的结果， 在体内 22，23。
中枢神经系统以外的PrP Sc的 ，因为有一个相对较低的水平，朊病毒只能被准确地诊断宰后通过接着用免疫组化的脑的解剖。 PMCA可作为诊断工具，因为它的放大分钟的PrP Sc的7显示出了很大的能力，即使是从仓鼠的尿液SAMPLES 11。
的朊剂是能够承受恶劣的环境条件下，保持传染性16,17。然而，在环境中的PrP Sc的量太小，被检测到使用常规技术，例如WB。 PMCA已用于扩增和计算近似量的PrP Sc的环境，如土壤和水16，17，20，21。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们要感谢Vesper的铁玛丽·拉莫斯博士的批判性阅读的手稿。这项工作是由国家研究资源中心（P20 RR0115635-6，C06 RR17417-01和G20RR024001次）和美国国家神经疾病与中风研究所（2R01 NS052609）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Misonix 3000 | Misonix | S-3000 | |
| Misonix 4000 | Misonix | S-4000 | |
| Tenbr–ck Tissue Grinder | Kontes | 885000-0007 | |
| Neslab EX-7 Water Bath | Thermo Electron | Neslab EX-7 | |
| 0.2 ml PCR Tube Strips | Thermo Scientific | AB-0451 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284-100ML | |
| Complete Protease Inhibitor | Roche | 11 697 498 001 | |
| EDTA | J.T. Baker | 4040-00 | |
| DPBS | Mallinckrodt Baker Mediatech | 21-031-CV | |
| Versi-Dry Lab Soakers | Fisher Scientific | 14 206 28 | |
| Repti Therm Heater | Zoo Med Laboratories, Inc. | RH-4 |
References
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