Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Proteinfehlfaltungen Cyclic Amplification von Prionen

Published: November 7, 2012 doi: 10.3791/4075
Automatic Translation
1, 2, 2
1Department of Civil Engineering, University of Nebraska at Lincoln, 2Department of Medical Microbiology and Immunology, Creighton University

Summary

Proteinfehlfaltung zyklischen Amplifikation (PMCA) ist ein in vitro-Assay zur Untersuchung von Prionen Umwandlung und Dehnung und Artgrenzen. Es kann auch als ein Prion-Nachweis-Assay verwendet werden.

Abstract

Prionen sind infektiöse Agenzien, die unweigerlich tödlichen übertragbaren spongiformen Enzephalopathie (TSE) verursachen bei Menschen und Tieren 9,18. Das Prionprotein hat zwei verschiedene Isoformen, die nicht-infektiösen Host-codierte Protein (PrP C) und das infektiöse Protein (PrP Sc), eine abnormal gefaltete Isoform von PrP C 8.

Eine der Herausforderungen bei der Arbeit mit Prion-Agenten ist die lange Inkubationszeit vor der Entwicklung von klinischen Anzeichen nach Host Inokulation 13. Das traditionell langen und teuren Tier-Bioassay Studien beauftragt. Darüber hinaus werden die biochemischen und biophysikalischen Eigenschaften von PrP Sc schlecht charakterisiert durch ihre ungewöhnliche Konformation und Aggregation Staaten.

PrP Sc kann Saatgut die Umwandlung von PrP C zu PrP Sc in vitro 14. PMCA ist ein in vitro-Technik, nimmt advantage dieser Fähigkeit mit Ultraschallbehandlung und Inkubation Zyklen, große Mengen an PrP Sc zu erzeugen, mit einer beschleunigten Rate von einer Anlage mit überschüssigen Mengen an PrP C und winzige Mengen des PrP Sc Saatgut 19. Diese Technik hat sich als wirksam rekapitulieren die Art und Stamm von PrP Sc Spezifität Umwandlung von PrP C zu Prionenstamm Interferenz emulieren, und mit sehr geringen Mengen von PrP Sc aus infizierten Geweben, Fluiden, und Umweltproben 6,7,16 amplifizieren, 23.

Dieses Papier Details der PMCA Protokoll, einschließlich Empfehlungen zur Minimierung Kontamination Erzeugung konsistente Ergebnisse und Quantifizierung dieser Ergebnisse. Wir diskutieren auch mehrere PMCA Anwendungen, einschließlich der Erzeugung und Charakterisierung von Prion-Stämme, Prionenstamm Störungen, und der Nachweis von Prionen in der Umwelt.

Protocol

Ein. Vorbereiten der Ausrüstung

  1. Verwenden Sie einen Misonix 3000 oder Misonix 4000 Ultraschallgerät (Farmingdale, NY) mit einem Thermo Electron Neslab EX-7 Wasserbad (Newington, NH), um eine konstante Temperatur von 37 ° C zu halten Beschallen die Proben in 200 ul dünnwandigen PCR-Röhrchen Streifen mit gewölbten Deckeln von Thermo Scientific (Waltham, MA) erhalten.
  2. Ein neues Ultraschallgerät benötigt eine "Pause"-Periode des kontinuierlichen Betriebs 9. Eine zweimonatige Einfahrzeit besteht aus einem 40-sec Beschallung Burst und 10-minütigen Inkubation Zyklen mit der Amplitude eingestellt bis 10. Man sollte Erosion der gesamten Oberfläche des Titan Mikroplatte Horn (Abbildung 1, Teil B) zu beobachten. Das zirkulierende Wasser aussehen wird weiß-trüb durch Erosion des Titan Mikroplatten Horn. Ersetzen Sie diese Wasser täglich.
  3. Die Verstärkung des PrP Sc wird während der Mikrotiterplatte Horn variieren. Die beste PrP Sc Amplifikationseffizienz kann innerhalb erhalten werdeneinem Radius von 5 cm von der Mitte der Mikrotiterplatte Horn (Siehe Abbildung 1, Panel C).
  4. Eine Runde PMCA aus 144 Zyklen. Jeder Zyklus besteht aus 5 sec Beschallung und 10 min Inkubation. Dies wird in etwa 24 Stunden pro Runde PMCA ziehen.
  5. Die Leistungsabgabe des Ultraschallbehandlung, auf die Beschallungsvorrichtung Bedienfeld angezeigt werden, variiert mit der Anzahl der PCR-Röhrchen Die in der Sonicator die Zahnstange und der Temperatur des zirkulierenden Wassers aus dem Wasserbad. Stellen Sie sicher, dass das Wasser äquilibriert bei 37 ° C und füllen nicht mehr als 30% der Sonicator die Röhrchenständer (Abbildung 1, Panel C). Verbreiten Sie die PCR-Röhrchen durch die Mikroplatten Horn. Mindestens eine Reihe von leeren Raum zwischen PCR-Röhrchen-Streifen und damit nicht mehr als vier Röhren zusammen pro Streifen verbunden (Abbildung 1, Panel C).
  6. Die Stärke der Ultraschallbehandlung ist entscheidend für eine erfolgreiche Amplifikation Prionenstamm. Während Beschallen, die Amplitude, um eine Ausgangsleistung habenzwischen 155 ~ 170 Watt. In unserem Labor ist die Sendeleistung zu sechs und sieben für die Misonix 3000 und Misonix 4000 bzw. eingestellt.
  7. Verwenden Sie destilliertes Wasser in das Wasserbad zu vermeiden akkumulieren harten Wasserflecken. Ersetzen Sie diese Wasser wöchentlich. Während der Inkubation und Beschallung Zyklen wird Kondenswasser im Inneren des Mikroplatten-horn Deckel auftreten. Zur Vermeidung von Kondensation, bringen ein kleines Aquarium Heizkissen an die Spitze des Sonicator Gehege, wie in Abbildung 1, Panel A gezeigt

2. Vorbereitung der Proben

  1. Alle Verfahren, die Tiere wurden von der Creighton University Institutional Animal Care genehmigt und Verwenden Ausschusses und entsprechen dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren. Vor jedem Gewebe Sammlung, das Tier narkotisiert und muss transkardial perfundiert mit eiskaltem Phosphat gepufferte Kochsalzlösung mit 5 mM EDTA bei pH 7,4, um Blut aus dem Gehirn zu entfernen und verhindern die Inhibierung derPMCA Reaktion durch Blut 7. Sammle tierischen Geweben rasch unter aseptischen Bedingungen und haben engagierte Dissektion Tools für jede Prionenstamm. Nach Dissektion, legen Sie das Gewebe in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, frieren Flash auf Trockeneis, und speichern Sie sie bei -80 ° C bis zur Homogenisierung.
  2. Um die PMCA Substrat (PrP C) herzustellen, homogenisieren eine nicht infizierte Hamsterhirn (UN BH) zu einer 10% Gewicht / Volumen (w / v) Lösung mit eiskaltem Kovertierungspuffers (siehe Teil 3) mit einem Tenbroeck Gewebe Mahlwerk. Während Homogenisieren, darauf achten, nicht die Luft im Inneren der Mühle zu erhalten zu vermeiden übermäßige Schaumbildung der Lösung. Klären der Lösung durch Zentrifugieren bei 500 xg für 30 sec und Aliquot des Überstandes in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Lagerung bei -80 ° C bis zur weiteren Verwendung.
  3. Um die PMCA Saatgut (PrP Sc)-Lösung herzustellen, ein infektiöses Material homogenisieren (Gehirn, Milz, Lymphknoten, Geweben oder anderen kontaminierten Bodens) zu einer 10% w / v Lösung mit eiskaltem water und aliquoten die Lösung in 0,6 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Lagerung bei -80 ° C bis zur weiteren Verwendung.

3. Vorbereiten Conversion Buffer

  1. Wiegen 0,5093 g Triton X-100 in einem 50 ml Messkolben (Ergebnis ist eine 1% Endkonzentration an Triton X-100) (Sigma-Aldrich GmbH, Steinheim, Deutschland).
  2. Fügen Sie eine komplette Protease Inhibitor Tablette (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland).
  3. Hinzufügen 0,0931 g EDTA (diese wird in einem 5 mM Endkonzentration von EDTA führen) (Mallinckrodt Baker Inc.; Phillipsburg, NJ).
  4. Den pH-Wert auf 7,4 mit 1 N NaOH.
  5. Lautstärke auf 50 ml mit Dulbeccos phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS) (Mediatech Inc.; Manassas, VA).
  6. Filtern der Lösung durch einen 0,45 um Nitrocellulosemembran mit einer Vakuumfiltervorrichtung. Die Umwandlung Puffer bei 4 ° C für nicht mehr als einen Monat gelagert werden.

4. Verstärkung des Prion-Stämme mit PMCA

  1. Verdünnt das PMCA Saatgut in den PMCA Substrat in einem Verhältnis von 1:20 (dh Mischung 5 ul der PMCA Saatgut und 95 ul der PMCA Substrat) in einer PCR-Röhrchen. Entfernen und speichern 15 ul Aliquots bei -80 ° C für unsonicated Kontrolle; dies unsonicated Steuerung wird verwendet, um die PrP Sc Verstärkung durch Proteinase K (PK) Verdauung durch Western Blot (WB) Analyse folgt quantifizieren. Eine zusätzliche Kontrolle unsonicated könnte durch Platzieren eines zweiten 15 ul Aliquots bei 37 ° C für die Dauer der PMCA Reaktion erzeugt werden. Ein Minimum von drei Wiederholungen wird für statistische Zwecke benötigten.
  2. Gegenstand der Rest der Probe (70 ul) mit einer Runde der PMCA wie auf Abbildung 1 dargestellt, Panel A Schütteln Röhrchen alle 5 Stunden, um eine Wasserkondensation auf dem gewölbten Deckel des PCR-Röhrchen zu vermeiden.
  3. Die Probe Rohren sollten ausgegliedert werden und sanft gevortext (dabei darauf achten, dass die Lösung nicht in den gewölbter Deckel gehen) vor dem Öffnen nach jedem Verfahren, um sicherzustellen, homogeneity und vermeiden mögliche Kontamination.
  4. Für die serielle PMCA (sPMCA) der kurzen Inkubationszeit Stämme (dh HY TME, HaCWD oder 263K), wird der beschallten Material bei einem Verhältnis von 1:20, indem 5 ul der beschallten Probe von Runde eins in 95 ml frisches infizierten Hirnhomogenat (Abbildung 2, Panel B).
  5. Für sPMCA der langen Inkubationszeit Stämmen (dh DY TME, 139h, 22CH, 22Ah oder ME7H), verdünnt das beschallten Materials in einem Verhältnis von 1:1 durch Transferieren 50 ul der beschallten Probe aus der ersten Runde in 50 ml frisches nichtinfizierten Hirnhomogenat (Abbildung 2, Panel B).
  6. Entfernen Sie die zwei 15 ul Aliquots aus dem zuvor verdünnt beschallten Gemisch (aus den Schritten 4,4 bzw. 4,5) und speichern einer von ihnen bei -80 ° C und die andere bei 37 ° C (unsonicated Control-Lösungen für PMCA Runde zwei). Unterziehen die Überreste einer PMCA Runde zwei.
  7. Dieser Vorgang kann beliebig oft wiederholt werden. In unserem Labor haben wirbis zu fünfzehn PMCA Runden durchgeführt haben, mit den Dehnungs-Eigenschaften bleiben unverändert.
  8. PK verdauen die Proben. Für eine typische WB mischen 5 ul PK 80 ug / ml bis 5 ul Probe (diese Lösung wird eine endgültige PK Konzentration von 40 ug / ml haben) und bei 37 ° C für eine Stunde. Fügen Sie 10 ul Gelladepuffer. Kochen Sie diese Lösung für 10 min. Lassen Sie die Lösung abkühlen und laden 10 ul in das Gel.
  9. Um den Erfolg der Amplifikation zu berechnen führen eine Analyse an den WB PK-verdauten Proben, um die Menge der verstärkten PrP Sc durch Vergleich, um entweder zu schätzen, die unsonicated Steuerelementen 20,21 Abbildung 2, Tafel C oder bekannte Mengen von PK-unverdaute rekombinante PrP.

5. Vermeiden Kreuzkontamination

Critical müssen Maßnahmen ergriffen werden, um Kreuzkontaminationen und das Auftreten von Fehlalarmen durch de novo Bildung von Protease beständige Produkte zu minimieren.

  • Verwenden Sie einen dedizierten Satz Dissektion Tools (zB Zangen, Pinzetten, Scheren) für die Probenentnahme für jeden Prionenstamm.
  • Vor Homogenisieren infizierten Gehirnen als PMCA Substrat verwendet werden, wischen Sie die Pipetten mit 1% Bleichmittel. Weichen Sie das Ultraschallgerät die PCR-Röhrchen Rack, Gewebe Homogenisatoren und PCR-Röhrchen Lagerregale mit 1% Bleichmittel für 10 min und anschließend gründlich mit destilliertem Wasser.
  • Decken Sie die Arbeitsfläche mit einem frischen Versi-Dry Lab Soaker jedes Mal eine neue Probe homogenisiert werden, ist eine neue PMCA Experiment vorbereitet zu sein, oder wenn Aliquotierung zwischen sPMCA Runden.
  • Verwenden Sie neue Handschuhe jedes Mal neue Proben behandelt (vor allem beim Übertragen Aliquots zwischen sPMCA Runden) werden.
  • Verwenden Sie kurze Beschallung Bursts für jeden PMCA Zyklus. Cycles of 5 sec Beschallung mit 10 min Inkubation kombiniert ist ausreichend, um Prionen ohne dass de novo PrP Sc 1,20,21,23,24 verstärken. Wie andere Labors haben gezeigt, Erhöhung derBeschallungszeit, die Erhöhung der Beschallung Amplitude und Erweiterung der Anzahl der PMCA-Zyklen erhöht die Wahrscheinlichkeit für die de novo PrP Sc Bildung 2.

    • Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Proteinfehlfaltung zyklischen Amplifikation (PMCA) wird verwendet, um PrP Sc in vitro 7, 12, 14, 19, 24 zu amplifizieren. Eine erfolgreiche Amplifikation PrP Sc ist durch einen Anstieg der Bandenintensität auf Western Blots des PK-Prionprotein (Migration zwischen 19 und 30 kDa für Hamster abstammenden Prionenstämme), wie in 3 gezeigt ist. Die Zunahme seiner Bandenintensität nach PMCA zeigt Verstärkung des PK-resistente PrP Sc Material. Eine erfolgreiche Amplifikation des Hamsters abgeleiteten Prionproteins HaCWD und DY TME, wird in der WB-Analyse der 3 durch Vergleichen der Bandenintensitäten vor (Spur 5 und 7) und nach (Spuren 4 und 6) PMCA gezeigt.

    PK-Verdau von PrP Sc gefolgt von WB Analyse zeigt einen oberen, mittleren und unteren Band entsprechend der Di-, Mono-und unglykosylierte Prion Protein. Einige Prionenstämme können durch ihre Elemente differenziert werdenctrophoretic Mobilität. Zum Beispiel gibt es eine Zwei-kDa Unterschied Migration zwischen der HaCWD und DY TME Prionenstämme. (Abbildung 3, Spur 1 und 2, jeweils).

    Ein hoher Wiedergabetreue PrP Sc Verstärkung wird durch den PMCA 1, 7, 12, 19, 23, 24 erreicht. Diese hohe Genauigkeit bei PMCA Amplifikation wird durch eine ähnliche elektrophoretische Wanderung der PMCA-amplifizierten Prionenstämme (HaCWD und DY TME) beobachtet, wenn an ihre entsprechenden Samen (Abbildung 3 verglichen; Spuren 1 & 2 & 4 und 6 für HaCWD und DY TME, jeweils).

    Wenn keine Kreuzkontaminationen oder de novo PrP Sc Bildung auftritt, sollte WB Analyse der Mock-Kontrolle PMCA Proben bleiben nach PK-Verdau (Abbildung 3, Bahnen 8 und 9) klar.

    Abbildung 1
    Abbildung 1. Um Kondenswasser zu vermeiden, eine regelmäßige Aquarium Wärme-pad ist über dem Deckel der Mikrotiterplatte Horn (Feld A) platziert. Ein neues Ultraschallgerät sollte erlaubt einen Einbruch im Zeitraum der kontinuierlichen Beschallung für etwa zwei Monate. Werden Panel B zeigt die Erosion auf dem Titan Mikroplatten Horn nach der Einlaufzeit. Panel C zeigt eine mögliche Anordnung von PCR Gefäßstreifen die eine optimale Beschallung der Proben ermöglichen würden.

    Abbildung 2
    Abbildung 2. Ablaufdiagramm PMCA (Panel A), sPMCA (Panel B) und WB-Analyse (Panel C). PrP Sc ist die PMCA Saatgut und die infizierten Hirnhomogenat (UN BH) ist die PMCA Substrat. Die Quantifizierung des amplifizierten PrP Sc für jede Runde PMCA wird durch Teilen der Bandenintensität nach PMCA durch seinen entsprechenden Bandenintensität bevor PMCA erhalten.

    ys "> Abbildung 3
    Abbildung 3. Western-Blot von PK-verdaut HaCWD und DY TME hamster-derived Prionenstämme. PrP Sc wird unter Verwendung 3F4 Anti-Prion-Antikörper. Analyse der WB zeigt die Fülle (blot Intensität) und elektrophoretische Mobilität von PrP Sc. PMCA Reaktionen wurden mit Hirnhomogenat von Hamstern entweder mit dem HaCWD (Bahnen 4-5) oder DY TME (Bahnen 6-7) Agenten infiziert ausgesät. Proben, die PMCA unterzog (PMCA +) zeigen einen Anstieg in der PrP Sc Abundanz bei ihrer unverstärkten (PMCA -) gegenüber Kontrollen (vergleiche Spuren 5 bis 4 und 7 bis 6). Es ist ein zwei-kDa Unterschied in der elektrophoretischen Wanderung zwischen den Prionproteine ​​HaCWD und DY TME (Bahnen 1-2). Dieser Unterschied in der Migration in den PMCA generierte Muster mit Hilfe HaCWD und DY TME Homogenate (Spuren 4 bzw. 6) gehalten wird. PMCA Reaktionen mit nicht infizierten Gehirn (mock) Homogenat ausgesät nicht, P verstärkenrP Sc (Spur 8). Die Stellen für die 19 und 21 kDa molekularen Marker werden an der linken Seite der Platte angegeben.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Herausforderungen der Verstärkung infektiöse Prion-Proteine ​​sind die langen Inkubationszeit und die Kosten der In-vivo-Experimente. Die PMCA Technik ist ein kostengünstiges Mittel, um infektiöse Prion-Agenten zu verstärken. Mehreren Laboratorien haben die Fähigkeit, genau zu amplifizieren PMCA Prionenstämme in vitro 7, 9, 12, 14, 19,24 bestätigt.

    Prion-Erkrankungen können zwischen verschiedenen Arten übertragen werden. Bessen und Marsh haben effektiv Hamster mit übertragbaren mink Enzephalopathie, die zwei verschiedene Hamster-derived Prionenstämme 5 hergestellt geimpft. In einer eleganten Studie, Telling und Mitarbeiter nutzten sPMCA die Maus-derived Prionenstamm, RML verstärken, mit transgenen Mäusen, die Hirschartigen PrP C (Tg (CerPrP) 1536 + / -) als PMCA Substrat. Ein schnelles Einsetzen der Krankheit wurde nach Inokulation von Tg (CerPrP) beobachtet 1536 + / - mit dem PMCA-Materials 12 angepasst ist. Ebenso waren Kurt et al. Können zu verstärkenChronic Wasting Disease (CWD), ein Prion Disease bei Hirschartigen, Verwendung von Nicht-Hirschartigen Arten PMCA Substrat 15. Diese Daten legen nahe, dass Spezies-Barriere in Prion-Erkrankungen kann umgangen werden, in vitro über PMCA.

    Bessen und Marsh haben gezeigt, dass der Hamster kurzen Inkubationszeit Stamm, HY TME, eine schnellere PrP Sc Akkumulation hat, wenn seine lange Inkubationszeit Gegenstück, DY TME 3, 5 verglichen. In ähnlicher Weise wird diese Korrelation zwischen der Inkubationszeit und der Anhäufung Rate nach PMCA in mehreren Hamster abstammenden Prionenstämme 1, 23, 24 beobachtet.

    Die Verstärkung beträgt eine Eigenschaft innewohnt jedem Stamm. PMCA wurde verwendet, um dieses Verstärkungsrate quantifizieren. Ayers et al. Konnten eine Zahl ohne Einheit, genannt Verstärkungskoeffizienten, die die Rate der Amplifikation für eine gegebene Hamster abstammenden Prionenstamm 1 für berechnen.

    PrionStämme können miteinander interferieren, wenn die in der gleichen Host. Die Anwesenheit eines langen Inkubationszeit Stamm erstrecken kann die Inkubationszeit oder gar blockieren die Fähigkeit einer kurzen Inkubationszeit Stamm eine Krankheit verursachen. Diese Erweiterung in Inkubationszeit Belastung Störungen bezeichnet. Stamm Störungen hat sich gezeigt, in Mäusen und Hamstern 10 22 auftreten. Bartz und Mitarbeiter haben PMCA zur Prionenstamm Störungen bei Hamstern zu studieren. Ihre Ergebnisse zeigen, dass die PMCA Experimente mit den Ergebnissen einer ähnlichen Experiment in vivo 22, 23 korrelieren.

    Da es einen relativ niedrigen Pegel von PrP Sc außerhalb des zentralen Nervensystems können Prionen nur genau diagnostiziert postmortale werden über Präparation des Gehirns durch Immunhistochemie gefolgt. PMCA kann als diagnostisches Werkzeug benutzt werden, da es eine hervorragende Fähigkeit Verstärken winzige Mengen an PrP Sc 7 gezeigt hat, auch aus Hamster-Urin samplES 11.

    Das Prion-Agent ist in der Lage, rauen Umgebungsbedingungen standhalten und infektiös bleiben 16,17. Allerdings ist die Menge an PrP Sc in der Umwelt zu klein, um unter Verwendung herkömmlicher Techniken, wie WB werden. PMCA wurde verwendet, um zu verstärken und berechnen Sie die ungefähre Menge an PrP Sc die Umwelt, wie Boden und Wasser 16, 17, 20, 21.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Keine Interessenskonflikte erklärt.

    Acknowledgments

    Wir möchten Dr. Vesper Fe Marie Ramos für die kritische Durchsicht des Manuskripts danken. Diese Arbeit wurde vom National Center for Research Resources (P20 RR0115635-6, C06 RR17417-01 und G20RR024001) und dem National Institute for Neurological Disorders and Stroke (2R01 NS052609) unterstützt.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Misonix 3000 Misonix S-3000
    Misonix 4000 Misonix S-4000
    Tenbr–ck Tissue Grinder Kontes 885000-0007
    Neslab EX-7 Water Bath Thermo Electron Neslab EX-7
    0.2 ml PCR Tube Strips Thermo Scientific AB-0451
    Triton X-100 Sigma Aldrich T9284-100ML
    Complete Protease Inhibitor Roche 11 697 498 001
    EDTA J.T. Baker 4040-00
    DPBS Mallinckrodt Baker Mediatech 21-031-CV
    Versi-Dry Lab Soakers Fisher Scientific 14 206 28
    Repti Therm Heater Zoo Med Laboratories, Inc. RH-4

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Ayers, J. I., Schutt, C. R., Shikiya, R. A., Aguzzi, A., Kincaid, A. E., Bartz, J. C. The strain-encoded relationship between PrP replication, stability and processing in neurons is predictive of the incubation period of disease. PLoS pathogens. 7, e1001317 (2011).
    2. Barria, M. A., Mukherjee, A., Gonzalez-Romero, D., Morales, R., Soto, C. De novo generation of infectious prions in vitro produces a new disease phenotype. PLoS Pathog. 5, e1000421 (2009).
    3. Bessen, R. A., Marsh, R. F. Biochemical and physical properties of the prion protein from two strains of the transmissible mink encephalopathy agent. J. Virol. 66, 2096-2101 (1992).
    4. Bessen, R. A., Marsh, R. F. Distinct PrP properties suggest the molecular basis of strain variation in transmissible mink encephalopathy. J. Virol. 68, 7859-7868 (1994).
    5. Bessen, R. A., Marsh, R. F. Identification of two biologically distinct strains of transmissible mink encephalopathy in hamsters. J. Gen. Virol. 73, 329-334 (1992).
    6. Castilla, J., Gonzalez-Romero, D., Saa, P., Morales, R., De Castro, J., Soto, C. Crossing the species barrier by PrP(Sc) replication in vitro generates unique infectious prions. Cell. 134, 757-768 (2008).
    7. Castilla, J., Morales, R., Saa, P., Barria, M., Gambetti, P., Soto, C. Cell-free propagation of prion strains. EMBO J. 27, 2557-2566 (2008).
    8. Caughey, B., Raymond, G. J. The scrapie-associated form of PrP is made from a cell surface precursor that is both protease- and phospholipase-sensitive. J. Biol. Chem. 266, 18217-18223 (1991).
    9. Deleault, N. R., Harris, B. T., Rees, J. R., Supattapone, S. Formation of native prions from minimal components in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 9741-9746 (2007).
    10. Dickinson, A. G., Fraser, H., Meikle, V. M., Outram, G. W. Competition between different scrapie agents in mice. Nat. New Biol. 237, 244-245 (1972).
    11. Gonzalez-Romero, D., Barria, M. A., Leon, P., Morales, R., Soto, C. Detection of infectious prions in urine. FEBS Lett. 582, 3161-3166 (2008).
    12. Green, K. M., Castilla, J., Seward, T. S., Napier, D. L., Jewell, J. E., Soto, C., Telling, G. C. Accelerated high fidelity prion amplification within and across prion species barriers. PLoS Pathog. 4, e1000139 (2008).
    13. Hadlow, W. J., Race, R. E., Kennedy, R. C. Temporal distribution of transmissible mink encephalopathy virus in mink inoculated subcutaneously. J. Virol. 61, 3235-3240 (1987).
    14. Kocisko, D. A., Come, J. H., Priola, S. A., Chesebro, B., Raymond, G. J., Lansbury, P. T., Caughey, B. Cell-free formation of protease-resistant prion protein. Nature. 370, 471-474 (1994).
    15. Kurt, T. D., Telling, G. C., Zabel, M. D., Hoover, E. A. Trans-species amplification of PrP(CWD) and correlation with rigid loop 170N. Virology. 387, 3235-3240 (2009).
    16. Maddison, B. C., Baker, C. A., Terry, L. A., Bellworthy, S. J., Thorne, L., Rees, H. C., Gough, K. C. Environmental sources of scrapie prions. J. Virol. 84, 11560-11562 (2010).
    17. Nichols, T. A., Pulford, B., Wyckoff, A. C., Meyerett, C., Michel, B., Gertig, K., Hoover, E. A., Jewell, J. E., Telling, G. C., Zabel, M. D. Detection of protease-resistant cervid prion protein in water from a CWD-endemic area. Prion. 3, 171-183 (2009).
    18. Prusiner, S. B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science. 216, 136-144 (1982).
    19. Saborio, G. P., Permanne, B., Soto, C. Sensitive detection of pathological prion protein by cyclic amplification of protein misfolding. Nature. 411, 810-813 (2001).
    20. Saunders, S. E., Bartz, J. C., Vercauteren, K. C., Bartelt-Hunt, S. L. An enzymatic treatment of soil-bound prions effectively inhibits replication. Appl. Environ. Microbiol. 77, 4313-4317 (2011).
    21. Saunders, S. E., Shikiya, R. A., Langenfeld, K., Bartelt-Hunt, S. L., Bartz, J. C. Replication efficiency of soil-bound prions varies with soil type. Journal of virology. , (2011).
    22. Schutt, C. R., Bartz, J. C. Prion interference with multiple prion isolates. Prion. 2, 61-63 (2008).
    23. Shikiya, R. A., Ayers, J. I., Schutt, C. R., Kincaid, A. E., Bartz, J. C. Co-infecting prion strains compete for a limiting cellular resource. Journal of. 84, 5706-5714 (2010).
    24. Shikiya, R. A., Bartz, J. C. In vitro generation of high titer prions. Journal of virology. , (2011).
    25. Weber, P., Giese, A., Piening, N., Mitteregger, G., Thomzig, A., Beekes, M., Kretzschmar, H. A. Generation of genuine prion infectivity by serial PMCA. Veterinary microbiology. 123, 346-357 (2007).

    Tags

    Immunologie Molekularbiologie Genetik Virologie Prion Prion-Erkennung Ultraschall PrP PrP Dehnung, PMCA sPMCA
    Proteinfehlfaltungen Cyclic Amplification von Prionen
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Saunders, S. E., Bartz, J. C.,… More

    Saunders, S. E., Bartz, J. C., Shikiya, R. A. Protein Misfolding Cyclic Amplification of Prions. J. Vis. Exp. (69), e4075, doi:10.3791/4075 (2012).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter