Protein misfolding Syklisk Forsterkning av Prioner

Summary

Protein misfolding syklisk forsterkning (PMCA) er en in vitro test for studiet av prion konvertering og sil og arter barrierer. Den kan også brukes som en prion deteksjon assay.

Abstract

Prioner er smittestoffer som forårsaker uunngåelig dødelig overførbar spongiform encefalopati (TSE) hos dyr og mennesker ^9,18. Prionproteinet har to distinkte isoformer, den ikke-infeksiøs vert-kodet protein (PrP ^C) og infeksiøs protein (PrP ^Sc), en unormalt-foldet isoform av PrP ^{C 8.}

En av utfordringene ved å jobbe med prion agenter er den lange inkubasjonstiden før utviklingen av kliniske tegn som følger vert vaksinasjon ^13. Dette tradisjonelt mandat lange og dyre dyr bioassay studier. Videre er de biokjemiske og biofysiske egenskaper PrP ^Sc dårlig karakterisert på grunn av deres uvanlige konformasjon og aggregering stater.

PrP ^Sc kan frø omdannelsen av PrP ^C til PrP ^Sc in vitro ^14. PMCA er en in vitro teknikk som tar Advantage av denne evnen hjelp sonikering og inkubering sykluser å produsere store mengder av PrP ^Sc, i en akselererende hastighet, fra et system som inneholder overskytende mengder PrP ^C og små mengder av PrP ^Sc frø ^19. Denne teknikken har vist seg å effektivt rekapitulere arten og belastning spesifisitet av PrP ^Sc konvertering fra PrP ^C, for å etterligne prion belastning forstyrrelser, og å forsterke svært lave nivåer av PrP ^Sc fra infiserte vev, væsker, og miljøprøver ^{6,7,16, 23.}

Dette papiret beskriver PMCA protokollen, inkludert anbefalinger for å minimere forurensning, genererer konsistente resultater, og kvantifisering disse resultatene. Vi diskuterer også flere PMCA programmer, inkludert produksjon og karakterisering av smittsomme prion stammer, prion belastning forstyrrelser, og påvisning av prioner i miljøet.

Protocol

1. Klargjøre utstyr

1. Bruk en Misonix 3000 eller Misonix 4000 sonikator (Farmingdale, NY) som er koblet til en Thermo Electron Neslab EX-7 vannbad (Newington, NH) å holde en konstant temperatur på 37 ° C. Sonicate prøvene i 200 ul tynnveggede PCR rør strimler med domed caps hentet fra Thermo Scientific (Waltham, MA).
2. En helt ny sonikator krever en "break-in" periode med kontinuerlig drift ^9. En to-måneders innkjøringsperiode består av en 40-sek sonikering burst og 10-minutters inkubasjon sykluser med amplituden nivået satt til 10 år. Man bør observere erosjon gjennom overflaten av titan mikroplate horn (Figur 1, felt B). Det sirkulerende vann vil se hvit blakket på grunn av erosjon av titanet mikroplate horn. Erstatte dette vannet daglig.
3. Forsterkningen av PrP ^Sc vil variere gjennom mikroplate horn. Den beste PrP ^Sc forsterkning effektivitet kan oppnås innenforen radius på 5 cm fra sentrum av mikroplate horn (Se Figur 1, felt C).
4. En runde av PMCA består 144 sykluser. Hver syklus består av 5 sek sonikering og 10 min inkubasjon. Dette vil grovt innebære til 24 timers per runde PMCA.
5. Utgangseffekten av sonikering, vises på sonikator kontrollpanel, varierer med antallet PCR-rørene til stede i sin sonikator stativet og temperaturen av det sirkulerende vannet fra vannbadet. Sikre at vannet er ekvilibrert ved 37 ° C, og ikke fylle mer enn 30% av sonikator undergrunnettverk takstativ (Figur 1, felt C). Spre PCR-rørene gjennom mikroplate horn. Ha minst én rad av tomrom mellom PCR rørstrips og tillater ikke mer enn fire rør koblet sammen pr stripe (Figur 1, felt C).
6. Styrken av sonikering er kritisk for en vellykket prion stamme forsterkning. Mens sonicating, tilpasse lydstyrken til å ha en effektvarierer mellom 155 ~ 170 watt. I vårt laboratorium kraften er satt til seks og sju for Misonix 3000 og Misonix 4000, henholdsvis.
7. Bruke destillert vann i vannbad for å unngå ansamlinger hardt vann flekker. Erstatte dette vannet ukentlig. I løpet av inkubasjon og sonikering sykluser, vil vann kondens oppstå inne mikroplate horn lokket. For å unngå kondens, legge til et lite akvarium varme puten på toppen av sonikator kabinett boksen som vist i Figur 1, panel A.

2. Forberede Prøver

1. Alle prosedyrer som involverer dyr ble godkjent av Creighton University Institutional Animal Care og bruk komité og i samsvar med Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr. Før noen vev samling, må dyret være bedøvet og transcardially perfused hjelp iskald fosfatbuffret saltløsning med 5 mM EDTA ved pH 7,4 for å fjerne blod fra hjernen og unngå inhibering avPMCA reaksjon etter blod ^7. Samle animalsk vev raskt ved hjelp av aseptisk teknikk og har dedikerte Disseksjonsverktøyer for hver prion belastning. Etter disseksjon, plasserer vevet i en 1,5 ml mikrosentrifugerør, flash fryse den på tørris, og lagre det ved -80 ° C til homogenisering.
2. Å forberede PMCA substratet (PrP ^C) oppløsning, homogenisere en uinfisert hamsteren hjerne (UN BH) til en 10% vekt / volum (w / v) løsning med iskald konvertering buffer (se del 3) ved hjelp av en vev Tenbroeck jeksel. Mens homogenisere, være forsiktig så du ikke å få luft inn i jeksel å unngå overdreven skumdannelse av løsningen. Klargjøre løsningen ved sentrifugering ved 500 xg i 30 sek og alikvoter supernatanten i 1,5 ml mikrosentrifugerør. Oppbevar ved -80 ° C inntil videre bruk.
3. Å forberede PMCA frø (PrP ^Sc) løsning, homogenisere et smittsomt materiale (hjerne, milt, lymfeknuter, andre vev eller kontaminert jord) til en 10% vekt / volum-løsning med iskald water og delmengden løsningen i 0,6 ml mikrosentrifugerør. Oppbevar ved -80 ° C inntil videre bruk.

3. Forbereder Konvertering Buffer

1. Vei 0,5093 g av Triton X-100 i en 50 ml volumetrisk kolbe (resultatet er en 1% sluttkonsentrasjon av Triton X-100) (Sigma-Aldrich GmbH; Steinheim, Tyskland).
2. Legg en komplett Protease Inhibitor Tablet (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Tyskland).
3. Legg 0,0931 g av EDTA (dette vil resultere i en 5 mM endelig konsentrasjon av EDTA) (Mallinckrodt Baker Inc. Phillipsburg, NJ).
4. Juster pH-verdien til 7,4 med 1 N NaOH.
5. Juster volumet til 50 ml med Dulbeccos fosfatbufret saltløsning (DPBS) (Mediatech Inc. Manassas, VA).
6. Filtrer løsningen gjennom et 0,45 um nitrocellulosemembran med en vakuumfiltrering apparat. Konverteringen buffer kan lagres ved 4 ° C for ikke mer enn en måned.

4. Forsterkning av Prion Stammer Bruke PMCA

1. Fortynn PMCA såkorn i PMCA substratet i et forhold på 1:20 (dvs. blanding 5 pl av den PMCA frø og 95 pl av den PMCA substratet) i en PCR-rør. Fjerne og lagre en 15 pl alikvot ved -80 ° C i unsonicated kontroll; denne unsonicated kontroll som skal benyttes til å kvantifisere PrP ^Sc forsterkning via proteinase K (PK) fordøyelse etterfulgt av Western blot (WB) analyse. En ekstra unsonicated kontroll kan genereres ved å plassere en andre 15 pl alikvot ved 37 ° C for varigheten av PMCA reaksjonen. Minimum tre repetisjoner er nødvendig for statistiske formål.
2. Underlagt resten av prøven (70 pl) til en runde av PMCA som avbildet på figur 1, Panel A. Shake rør hver 5 hr å unngå vann kondens på den kuppelformede hetten av PCR-røret.
3. Utvalgets rør bør spunnet ned og forsiktig virvlet (være forsiktig at løsningen ikke gå inn i hvelvet cap) før åpning etter noen prosedyre for å sikre homogeneity og unngå potensiell forurensning.
4. For seriell PMCA (sPMCA) av korte inkubasjonstid stammer (dvs. HY TME, HaCWD eller 263K), fortynne sonikert materiale i et forhold på 1:20 ved å overføre 5 pl av den sonikert prøven fra runde en inn 95 pl av ferskt uinfisert hjerne homogenat (figur 2, panel B).
5. For sPMCA av lange inkubasjonstiden stammer (dvs. DY TME, 139H, 22CH, 22AH, eller ME7H) fortynnes sonikert materiale i et forhold på 01:01 ved å overføre 50 ul av sonikert prøven fra runde en i 50 pl av ferskt uinfisert hjerne homogenat (figur 2, panel B).
6. Fjern to 15 pl aliquoter fra tidligere fortynnet sonikert blanding (fra trinn 4,4 eller 4,5), og lagre en av dem ved -80 ° C og den andre ved 37 ° C (unsonicated kontrolløsninger for PMCA runde to). Utsett restene til en PMCA runde to.
7. Denne prosedyren kan gjentas på ubestemt tid. I vårt laboratorium, vihar utført opp til femten PMCA runder, med tøyingsegenskapene gjenværende uendret.
8. PK fordøye prøvene. For en typisk WB, bland 5 ul PK 80 ug / ml til 5 ul prøve (denne løsningen vil ha en endelig konsentrasjon på PK 40 ug / ml) og inkuber ved 37 ° C i én time. Tilsett 10 pl gel lasting buffer. Koke dette løsningen i 10 min. La løsningen avkjøles og laste 10 pl til gelen.
9. Å beregne suksessen forsterkning utføre en WB analyse på PK-fordøyd prøvene for å estimere mengden av amplifisert PrP ^Sc ved å sammenligne dem til enten, de unsonicated kontrollene ^20,21 Figur 2, Panel C eller til kjente mengder av PK-ufordøyd rekombinant PrP.

5. Unngå kryssforurensning

Kritiske trinn må tas for å redusere kryss-kontaminering og forekomst av falske positiver grunnet de novo dannelse av proteaseresistente produkter.

Bruke en dedikert sett med Disseksjonsverktøyer (dvs. tang, pinsett, saks) for prøvetaking for hver prion belastning.

Før homogenisering uinfiserte hjerner skal brukes som en PMCA substrat, tørk pipettene med 1% blekemiddel. Bløtlegg sonikator er PCR rør rack, vev homogenizers, og PCR rør lagring stativer med 1% blekemiddel i 10 min og skyll grundig med destillert vann.

Dekk arbeidsområdet med en frisk Versi-Dry Lab soaker hver gang en ny prøven skal homogeniseres, er en ny PMCA eksperiment for å være forberedt, eller når aliquoting mellom sPMCA runder.

Bruk nye hansker hver gang nye prøver håndteres (spesielt når du overfører alikvoter mellom sPMCA runder).

Bruk korte sonikering bursts for hver PMCA syklus. Sykluser av 5 sek sonikering kombinert med 10 min inkubasjon er tilstrekkelig til å forsterke prioner uten å generere de novo PrP ^{Sc 1,20,21,23,24.} Som andre laboratorier har vist, økersonikering tid, øker sonikering amplitude og utvide antallet PMCA sykluser øker sannsynligheten for de novo PrP ^Sc formasjon ^2.

Representative Results

Protein misfolding syklisk forsterkning (PMCA) blir brukt til å forsterke PrP ^Sc in vitro ^{7, 12, 14, 19, 24.} En vellykket PrP ^Sc amplifikasjon er vist av en økning i bandet intensitet på Western blot av PK-resistent prionproteinet (migrere mellom 19 og 30 kDa for hamster-avledede prion stammer) som vist i figur 3.. Økningen i sitt band intensitet etter PMCA indikerer amplifikasjon av PK-resistent PrP ^Sc materiale. Vellykket amplifikasjon av hamster-avledet prionproteinet, HaCWD og DY TME, er vist i WB analyse av figur 3, ved å sammenligne bandet intensiteter før (kolonnene 5 og 7) og etter (søyle 4 og 6) PMCA.

PK fordøyelsen av PrP ^Sc etterfulgt av WB Analysen viser en øvre, midtre og nedre bånd tilsvarer di-, mono-, og unglycosylated prionproteinet, henholdsvis. Noen prion stammer kan differensieres etter ele deresctrophoretic mobilitet. For eksempel, det er en to-kDa forskjell i migrasjon mellom HaCWD og DY TME prion stammer. (Figur 3, søyle 1 og 2, henholdsvis).

En høy fidelity PrP ^Sc amplifikasjon blir oppnådd ved ^{en PMCA, 7, 12, 19, 23, 24.} Dette high fidelity i PMCA forsterkning er observert av en lignende electrophoretic migrasjon av PMCA-forsterkede prion stammer (HaCWD og DY TME) sammenlignet med de tilsvarende frø (figur 3; baner 1 & 4 og 2 & 6 for HaCWD og DY TME, henholdsvis).

Hvis ingen krysskontaminering eller de novo PrP ^Sc formasjonen forekommer, bør WB analyse av mock kontroll PMCA prøvene forbli klart etter PK fordøyelse (Figur 3, søyle 8 og 9).

Figur 1. Å unngå vann kondens, en vanlig akvarium varme-puten er plassert over lokket mikroplate horn (panel A). En helt ny sonikator bør gis en innkjøringsperiode med kontinuerlig sonikering i ca to måneder. Panel B viser erosjon på titan mikroplate horn etter innkjøringsperioden. Panel C viser et mulig arrangement av PCR rørstrips som ville tillate en optimal sonikering av prøvene.

Figur 2. Flytskjema for PMCA (panel A), sPMCA (panel B), og WB analyse (panel C). PrP ^Sc er PMCA frø og infisert hjernen homogenat (UN BH) er PMCA underlaget. Kvantifisering av den forsterkede PrP ^Sc for hver PMCA runde er oppnådd ved å dele bandet intensitet etter PMCA ved sin tilsvarende bandet intensitet før PMCA.

ys ">
Figur 3. Western blot av PK-fordøyd HaCWD og DY TME hamster-avledet prion stammer. PrP ^Sc er oppdaget ved hjelp av 3F4 anti-prion antistoff. Analyse av WB viser overflod (blot intensitet) og elektroforetisk mobilitet av PrP ^Sc. PMCA reaksjoner ble sådd med hjernen homogenat fra hamstere infisert med enten HaCWD (baner 4-5) eller DY TME (baner 6-7) agenter. Prøver som gjennomgikk PMCA (PMCA +) viser en økning i den PrP ^Sc overflod i forhold til sine unamplified (PMCA -) kontroller (sammenlign kolonnene 5 til 4 og 7-6). Det er en to-kDa forskjell i den elektroforetiske migrasjonen mellom prionsykdommer proteiner av HaCWD og DY TME (søyle 1-2). Denne forskjellen i migrasjon er opprettholdt i de PMCA-genererte prøver ved å bruke HaCWD og DY TME homogenater (baner 4 og 6, henholdsvis). PMCA reaksjoner sådd med infisert hjernen (mock) homogenat klarer å forsterke PRP ^Sc (lane 8). Stedene for de 19 og 21 kDa molekylære markører angitt til venstre for panelet.

Discussion

Utfordringer for å forsterke smittsomme prion proteiner er de lange inkubasjonsperioder og utgifter in vivo eksperimenter. Den PMCA teknikken er en kostnadseffektiv måte å forsterke smittsomme prion agenter. Flere laboratorier har bekreftet evne PMCA å nøyaktig forsterke prion stammer i ^{7 vitro, 9, 12, 14, 19,24.}

Prionsykdommer kan overføres mellom arter. Bessen og Marsh har effektivt inokulert hamstere med overførbare mink encefalopati, som produserte to forskjellige hamster-avledet prion stammer ^5. I en elegant studie Telling og medarbeidere brukte sPMCA å forsterke mus-avledet prion belastning, RML, ved hjelp av transgene mus som uttrykker cervid PrP ^C (Tg (CerPrP) 1536 + / -) som PMCA substrat. En rask innsettende sykdom ble observert etter inokulering av Tg (CerPrP) 1536 + / - med PMCA-tilpasset materialet ^12. Tilsvarende, var Kurt et al. Stand til å forsterkekronisk sløse sykdom (CWD), en prion sykdom i hjortevilt, bruk av ikke-cervid arter PMCA substrat ^15. Disse dataene antyder at arter barriere i prionsykdommer kan omgås in vitro via PMCA.

Bessen og Marsh har vist at hamsteren korte inkubasjonstid stamme, HY TME, har en raskere PrP ^Sc akkumulering sammenlignet med sin lange inkubasjonstiden motstykke, DY ^{3 TME, 5.} Tilsvarende er denne korrelasjonen mellom inkubasjonsperioden og akkumulering sats observert etter PMCA i flere hamster-avledede prion stammer ^{1, 23, 24.}

Forsterkning rate er en egenskap iboende til hver stamme. PMCA har blitt brukt til å kvantifisere dette forsterkning rate. Ayers et al. Kunne beregne en unitless nummer, betegnet forsterkning koeffisient, som representerer frekvensen av forsterkning for en gitt hamster-avledet prion stamme ^1.

Prionstammer kan forstyrre hverandre når den er tilstede i den samme vert. Tilstedeværelsen av en lang inkubasjonstid belastningen kan forlenge inkubasjonstiden eller blokkere muligheten for en kort inkubasjonstid belastning til å forårsake sykdom. Denne utvidelsen i inkubasjonstiden er betegnet belastning forstyrrelser. Strain interferens har vist seg å forekomme i mus ¹⁰ og hamster ^22. Bartz og medarbeidere har brukt PMCA å studere prion belastning forstyrrelser i hamstere. Deres resultater viser at PMCA eksperimenter korrelerer med funnene i et lignende eksperiment i ^{22 vivo, 23.}

Siden det er et relativt lavt nivå av PrP ^Sc utenfor det sentrale nervesystemet, kan prioner kun nøyaktig diagnostisert obduksjon via disseksjon av hjernen etterfulgt av immunhistokjemi. PMCA kan brukes som diagnostisk verktøy, siden det har vist en stor evne til å forsterke små mengder av PrP ^{Sc 7,} selv fra hamster urin samples ^11.

Prion agent er i stand til å tåle tøffe miljøforhold og forbli smittefarlig ^16,17. Imidlertid er mengden av PrP ^Sc i miljøet for liten til å bli detektert ved hjelp av konvensjonelle teknikker slik WB. PMCA har blitt brukt til å forsterke og beregne den omtrentlige mengde av PrP ^Sc miljøet, for eksempel jord og vann ^{16, 17, 20, 21.}

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Misonix 3000	Misonix	S-3000
Misonix 4000	Misonix	S-4000
Tenbr–ck Tissue Grinder	Kontes	885000-0007
Neslab EX-7 Water Bath	Thermo Electron	Neslab EX-7
0.2 ml PCR Tube Strips	Thermo Scientific	AB-0451
Triton X-100	Sigma Aldrich	T9284-100ML
Complete Protease Inhibitor	Roche	11 697 498 001
EDTA	J.T. Baker	4040-00
DPBS	Mallinckrodt Baker Mediatech	21-031-CV
Versi-Dry Lab Soakers	Fisher Scientific	14 206 28
Repti Therm Heater	Zoo Med Laboratories, Inc.	RH-4