Proteína amplificação cíclica misfolding de príons

Summary

Proteína de amplificação cíclica misfolding (PMCA) é um ensaio in vitro em para o estudo da conversão de prião e as barreiras de tensão e espécies. Também pode ser utilizado como um ensaio de detecção de prião.

Abstract

Os príons são os agentes infecciosos que causam a encefalopatia espongiforme inevitavelmente fatal transmissível (EET) em animais e seres humanos ^9,18. A proteína de prião tem duas isoformas distintas, a não infecciosa da proteína codificada hospedeira (PrP ^C) e a proteína infecciosa (PrP ^Sc), uma isoforma anormal de dobrado PrP ^{C 8.}

Um dos desafios de trabalhar com agentes prião é o longo período de incubação antes do desenvolvimento de sinais clínicos após a inoculação de acolhimento ^13. Isto tradicionalmente, imposto estudos bioensaio longas e caras animais. Além disso, as propriedades bioquímicas e biofísicas da PrP ^Sc ainda são pouco caracterizados devido à sua conformação invulgar e estados de agregação.

^PrPSc pode semear a conversão da PrP ^{C e} PrP ^Sc in vitro ^14. PMCA é uma técnica in vitro, em que toma advantage desta capacidade utilizando ciclos de sonicação e a incubação para a produção de grandes quantidades de PrP ^Sc, a uma taxa acelerada, a partir de um sistema contendo quantidades em excesso de PrP ^C e pequenas quantidades de sementes a PrP ^{Sc 19.} Esta técnica provou ser eficaz para recapitular a especificidade de espécie e estirpe de PrP ^Sc conversão da PrP ^C, para emular interferência estirpe do prião, e para amplificar os níveis muito baixos de PrP ^Sc em tecidos infectados, fluidos e amostras ambientais ^{6,7,16, 23.}

Este trabalho detalha o protocolo PMCA, incluindo recomendações para minimizar a contaminação, gerando resultados consistentes, e quantificar esses resultados. Também discutimos várias aplicações PMCA, incluindo a geração e caracterização de cepas de príon infeccioso, interferência tensão prião, e na detecção de príons no ambiente.

Protocol

1. Preparando o Equipamento

1. Usar um 3000 Misonix ou sonicador Misonix 4000 (Farmingdale, NY) ligado a um banho de Thermo Electron Neslab EX-7 água (Newington, NH) para manter uma temperatura constante de 37 ° C. Sonicar as amostras em 200 uL de paredes finas tiras de tubos PCR com tampas abobadadas obtidos a partir de Thermo Scientific (Waltham, MA).
2. A sonicador novo requer um "break-in" período de operação contínua ^9. Uma quebra-in período de dois meses é composto por uma onda de ultra-sons de 40 seg e ciclos de 10 minutos de incubação com o nível de amplitude definida para 10. Deve-se observar a erosão ao longo da superfície da microplaca titânio corno (Figura 1, painel B). A circulação de água vai ficar turva branca, devido à erosão da microplaca de titânio chifre. Substituir essa água por dia.
3. A amplificação da PrP ^Sc irá variar ao longo da trompa de microplacas. A melhor eficiência de amplificação da PrP ^Sc pode ser obtida dentro deum raio de 5 cm a partir do centro do feixe de microplacas (Ver Figura 1, Painel C).
4. Uma rodada de PMCA consiste 144 ciclos. Cada ciclo é constituído por cinco segundos de sonicação e 10 minutos de incubação. Isso vai implicar cerca de 24 horas por rodada de PMCA.
5. A saída de energia de ultra-sons, exibido no painel de controle do sonicador, varia de acordo com o número de tubos de PCR presentes na prateleira do sonicador e a temperatura da água de circulação do banho de água. Certifique-se de que a água é equilibrado a 37 ° C, e não encha mais do que 30% de cremalheira do sonicador do tubo (Figura 1, painel C). Espalhe os tubos de PCR através do chifre microplaca. Ter pelo menos uma linha de espaço vazio entre as tiras de tubos de PCR e permitir não mais do que quatro tubos ligados entre si por tiras (Figura 1, painel C).
6. A força de sonicação é crítica para uma amplificação bem sucedida de prião estirpe. Enquanto sonicando, ajustar a amplitude de ter uma saída de potênciavariando entre 155 ~ 170 watts. Em nosso laboratório o nível de energia está definido para seis e sete para o 3000 Misonix e Misonix 4000, respectivamente.
7. Uso de água destilada em banho de água para evitar a acumulação manchas de água dura. Substituir este semanário água. Durante os ciclos de incubação e de sonicação, a condensação de água irá ocorrer no interior da tampa de chifre de microplacas. Para evitar a condensação, coloque um bloco de calor pequeno aquário para o topo da caixa do sonicador do invólucro, conforme mostrado na Figura 1, o painel A.

2. Preparação das amostras

1. Todos os procedimentos envolvendo animais foram aprovados pelo Animal Care Institucional e Creighton University Use Comissão e cumprir com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. Antes de qualquer recolha de tecido, o animal deve ser anestesiado e transcardially perfundidos com fosfato arrefecido com gelo, com solução salina tamponada com EDTA 5 mM, pH 7,4, para remover o sangue do cérebro e evitar a inibição daPMCA reação por sangue ^7. Coletar tecidos animais rapidamente, usando técnica asséptica e ter instrumentos de dissecação dedicados para cada cepa príon. Após a dissecação, colocar o tecido em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, flash congelá-lo em gelo seco e armazená-lo a -80 ° C até à homogeneização.
2. Para preparar a solução de substrato PMCA (PrP ^C), homogeneizar o cérebro de hamster não infectadas (UN BH) para uma solução a 10% peso / volume (w / v) com tampão de gelo frio de conversão (ver parte 3), utilizando um triturador de tecidos Tenbroeck. Enquanto homogeneização, tome cuidado para não entrar ar dentro do moedor para evitar o excesso de espuma da solução. Clarificar a solução por centrifugação a 500 xg durante 30 seg e aliquota do sobrenadante em tubos de microcentrífuga de 1,5 ml. Armazenar a -80 ° C até à sua utilização.
3. Para preparar a semente PMCA (PrP ^Sc) de solução, homogeneizar um material infeccioso (gânglios cerebrais, baço, linfa, ou outros tecidos ou solo contaminado), a uma solução a 10% w / v de gelo frio water e alíquota da solução em tubos de microcentrífuga de 0,6 ml. Armazenar a -80 ° C até à sua utilização.

3. Preparando buffer de conversão

1. Pesar 0,5093 g de Triton X-100, num balão volumétrico de 50 ml (resultado é uma concentração final de 1% de Triton X-100) (Sigma-Aldrich GmbH; Steinheim, Alemanha).
2. Adicionar um inibidor de protease completo Tablet (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha).
3. Adicionar 0,0931 g de EDTA (isto irá resultar numa concentração final de 5 mM de EDTA) (Mallinckrodt Baker Inc.; Phillipsburg, NJ).
4. Ajustar o pH para 7,4 com NaOH 1N.
5. Ajustar o volume a 50 ml com fosfato salino tamponado de Dulbecco (DPBS) (Mediatech Inc., Manassas, VA).
6. Filtrar a solução através de uma membrana de nitrocelulose de 0,45 um, com um aparelho de filtração sob vácuo. O buffer de conversão pode ser armazenado a 4 ° C durante não mais de um mês.

4. Amplificação de Cepas Prion Usando PMCA

1. Dilui-se a semente para dentro do substrato PMCA PMCA numa proporção de 1:20 (mistura ou seja, 5 ul da semente PMCA e 95 ul do substrato PMCA) para um tubo de PCR. Remover e armazenar-se uma alíquota de 15 uL a -80 ° C para o controle unsonicated; este controlo unsonicated será utilizada para quantificar a PrP ^Sc amplificação através de proteinase K de digestão (PK), seguido por análise Western blot (WB). Um controlo adicional pode ser gerado unsonicated colocando uma aliquota 15 segundo uL a 37 ° C durante a duração da reacção PMCA. Um mínimo de três repetições é necessária para fins estatísticos.
2. Objecto do restante da amostra (70 ul) para um ciclo de PMCA como representado na Figura 1, Painel A. Agitação tubos cada hora 5 para evitar a condensação de água na tampa abaulada do tubo de PCR.
3. Tubos da amostra deve ser girado para baixo e gentilmente agitadas (tendo o cuidado de que a solução não vão para a tampa abobadada) antes de abrir depois de qualquer procedimento para garantir homogeneity e evitar a contaminação potencial.
4. Para PMCA serial (sPMCA) de estirpes de incubação curtos períodos (isto é, HY TME, HaCWD ou 263K), dilui-se o material sonicado a uma proporção de 1:20 em transferir 5 ul da amostra sonicada de uma rodada em 95 ul de uninfected fresco homogenato cerebral (Figura 2, painel B).
5. Para sPMCA de estirpes de incubação longos (por exemplo, período de DY TME, 139H, 22CH, 22AH, ou ME7H), dilui-se o material sonicado a uma proporção de 1:1, transferindo 50 ul da amostra sonicada da rodada em 50 ul de uninfected fresco homogenato cerebral (Figura 2, painel B).
6. Remover duas alíquotas de 15 ul da mistura previamente diluída sonicado (a partir de etapas de 4,4 ou 4,5), e armazenar uma delas a -80 ° C e o outro a 37 ° C (solução de controlo para unsonicated PMCA dois redondos). Submeter os restos de uma rodada PMCA dois.
7. Este procedimento pode ser repetido indefinidamente. Em nosso laboratório, nóster realizado até 15 rodadas PMCA, com as propriedades de tensão permaneçam inalteradas.
8. PK digerir as amostras. Para um típico WB, misturar 5 ul de PK pi 80 ug / ml a 5 de amostra (esta solução irá ter uma concentração final de PK de 40 ug / ml) e incubar a 37 ° C durante uma hora. Adicionar 10 ul de tampão de carga de gel. Ferver esta solução durante 10 min. Deixar a solução arrefecer e 10 ul carregar no gel.
9. Para calcular o sucesso da amplificação realizar uma análise de WB nas amostras PK-digeridas para estimar a quantidade de PrP ^Sc amplificado comparando-os com um ou outro, os controles unsonicated ^20,21 Figura 2, painel C ou a quantidades conhecidas de PK-recombinante não digerido PrP.

5. Evitando a contaminação cruzada

Passos críticos têm de ser tomadas medidas para minimizar a contaminação cruzada e a ocorrência de falsos positivos devido a formação de novo de produtos resistentes a protease.

Use um conjunto dedicado de instrumentos de dissecação (fórceps ou seja, pinças, tesouras) para coleta de amostras para cada estirpe príon.

Antes homogeneizando cérebro não infectados a serem utilizados como substrato PMCA, limpe as pipetas com lixívia a 1%. Mergulhe o rack sonicador do tubo de PCR, homogeneizadores, tecidos e racks de armazenamento de tubos de PCR com água sanitária a 1% por 10 minutos e enxaguar com água destilada.

Cobrir a área de trabalho com um Soaker Lab fresco Versi-Dry cada vez que uma nova amostra deve ser homogeneizada, numa experiência PMCA novo é para ser preparado, ou quando entre alíquotas sPMCA rodadas.

Use luvas novas a cada vez novas amostras são manipulados (especialmente quando a transferência de alíquotas entre as rodadas sPMCA).

Use rajadas curtas de sonicação para cada ciclo PMCA. Ciclos de 5 segundos de sonicação combinado com 10 min de incubação é suficiente para amplificar os priões, sem gerar de novo PrP ^{Sc 1,20,21,23,24.} Como outros laboratórios têm demonstrado, aumentando atempo de sonicação, o aumento da amplitude de sonicação, e estendendo-se o número de ciclos de PMCA aumenta a probabilidade de para PrP ^Sc novo de formação ^2.

Representative Results

Proteína de amplificação cíclica misfolding (PMCA) é usado para amplificar a PrP ^Sc in vitro ^{7, 12, 14, 19, 24.} Uma bem sucedida PrP ^Sc amplificação é mostrado por um aumento na intensidade da banda em Western blots da proteína do prião PK-resistente (migrando entre 19 e 30 kDa para as estirpes derivadas do hamster prion), como mostrado na Figura 3. O aumento da intensidade da banda após a sua PMCA indica a amplificação do material resistente ao PK ^PrPSc. Amplificação bem sucedida da proteína prião de hamster-derivada, HaCWD e DY TME, é mostrado na análise WB da Figura 3 por meio da comparação das intensidades das bandas antes (pistas 5 e 7) e depois (pistas 4 e 6) PMCA.

Digestão PK de PrP ^Sc seguido de análise WB mostra uma banda superior, médio e inferior correspondente à proteína prião di-, mono-, e não glicosilada, respectivamente. Algumas estirpes de priões podem ser diferenciados pelo seu elementomobilidade ctrophoretic. Por exemplo, existe uma diferença de duas kDa em migração entre a HaCWD e estirpes de priões DY TME. (Figura 3, as pistas 1 e 2, respectivamente).

A amplificação de alta fidelidade PrP ^Sc é conseguida pela PMCA ^{1, 7, 12, 19, 23, 24.} Esta alta fidelidade na amplificação PMCA é observada por uma migração electroforética semelhante das estirpes PMCA amplificados priónicas (HaCWD e DY TME), quando comparados com os seus correspondentes sementes (Figura 3; pistas 1 e 4, e 2 e 6 e para HaCWD TME DY, respectivamente).

Se nenhuma contaminação cruzada ou de novo PrP ^Sc formação ocorre, WB análise de amostras de controlo simuladas PMCA deve permanecer límpida após digestão PK (Figura 3, pistas 8 e 9).

Figura 1. Para evitar a condensação de água, um aquário de calor regular de almofada é colocada por cima da tampa do bocal de microplacas (painel A). A nova marca sonicador devem dispor de um período de adaptação de sonicação contínua por cerca de dois meses. O painel B mostra a erosão na microplaca de titânio chifre após o período de arrombamento. O painel C mostra um arranjo possível de tiras de tubos de PCR, que permitiria uma melhor sonicação das amostras.

Figura 2. Fluxograma para PMCA (painel A), sPMCA (painel B), e análise de WB (painel C). PrP ^Sc é a semente PMCA e o homogenato de cérebro infectado (ONU BH) é o substrato PMCA. A quantificação da PrP ^Sc amplificado para cada rodada PMCA é obtida dividindo a intensidade das bandas após PMCA pela intensidade da banda correspondente antes PMCA.

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Figura 3. Western blot de PK-digerido HaCWD e TME DY estirpes derivadas de hamster priónicas. ^PrPSc é detectada utilizando um anticorpo anti-prião 3F4. Análise da WB mostra a abundância (intensidade blot) e da mobilidade electroforética de PrP ^Sc. PMCA reacções foram semeadas com homogenato de cérebro de hamsters infectados com o ou HaCWD (pistas 4-5) ou DY TME (pistas 6-7) agentes. As amostras que foram submetidos PMCA (PMCA +) mostram um aumento na abundância PrP ^Sc, quando comparados com os seus sem amplificação (PMCA -) controles (comparar pistas 5-4 e 7-6). Há uma diferença de dois kDa na migração eletroforética entre as proteínas priónicas de HaCWD TME e DY (pistas 1-2). Esta diferença de migração é mantida nas amostras PMCA gerados usando HaCWD e homogeneizados DY TME (pistas 4 e 6, respectivamente). Reações PMCA semeados com cérebro não infectadas (mock) homogeneizado não amplificar PrP ^Sc (pista 8). As localizações para os 19 e 21 kDa marcadores moleculares são indicados para o lado esquerdo do painel.

Discussion

Desafios da amplificação príons infecciosos são os longos períodos de incubação e as despesas de experimentos in vivo. A técnica PMCA é um meio rentável para ampliar agentes príon infeccioso. Vários laboratórios confirmaram a capacidade de amplificar PMCA com precisão as estirpes de priões in vitro ^{7, 9, 12, 14, 19,24.}

Doenças de priões, pode ser transmitida entre as espécies. Bessen e Marsh efetivamente inoculados hamsters com encefalopatia transmissível de vison, que produziu duas linhagens distintas de hamster derivados príon ^5. Em um elegante estudo, Contar e colegas de trabalho utilizado sPMCA para amplificar o mouse derivada tensão príon, RML, usando camundongos transgênicos expressando cervid PrP ^C (Tg (CerPrP) 1536 + / -) como substrato PMCA. Um rápido início da doença foi observada após a inoculação de Tg (CerPrP) 1536 + / - com o material PMCA adaptada ^12. Do mesmo modo, Kurt et al. Foram capazes de amplificardoença cansaço crônico (CWD), uma doença de príon em cervídeos, usando espécies de cervídeos não PMCA substrato ^15. Estes dados sugerem que a espécie de barreira em doenças priónicas pode ser ignorada na via PMCA vitro.

Bessen e Marsh mostraram que a estirpe do hamster curto período de incubação, HY TME, tem uma rápida PrP ^Sc acumulação quando comparado com o seu homólogo longo período de incubação, DY TME ^{3, 5.} Da mesma forma, esta correlação entre o tempo de incubação e a taxa de acumulação é observada após PMCA em várias estirpes derivadas de hamster prion ^{1, 23, 24.}

A taxa de amplificação é uma propriedade intrínseca a cada estirpe. PMCA tem sido utilizada para quantificar esta taxa de amplificação. Ayers et al. Foram capazes de calcular um número sem unidade, o coeficiente de amplificação denominado, que representa a taxa de amplificação para uma estirpe de prião de hamster dado derivado ^1.

Prionestirpes podem interferir uns com os outros quando presentes no mesmo hospedeiro. A presença de uma estirpe de longo período de incubação pode prolongar o período de incubação, ou mesmo bloquear a capacidade de uma estirpe de curto período de incubação de causar a doença. Esta extensão de tempo de incubação é denominado estirpe interferência. Interferência estirpe tem sido demonstrado que ocorrem em ratinhos e hamsters ^{10 22.} Bartz e colaboradores usaram PMCA para estudar a interferência tensão de príon em hamsters. Os resultados mostram que as experiências PMCA correlacionam com os resultados de uma experiência semelhante, in vivo ^{22, 23.}

Uma vez que existe um nível relativamente baixo de PrP ^Sc fora do sistema nervoso central, os priões só pode ser diagnosticada com precisão por meio de post-mortem dissecação do cérebro seguido por imuno-histoquímica. PMCA pode ser utilizada como ferramenta de diagnóstico, uma vez que mostrou uma grande capacidade de amplificar quantidades mínimas de PrP ^{Sc 7,} mesmo a partir de sampl hamster urinaes ^11.

O agente de prião é capaz de resistir a condições ambientais adversas e permanecem infecciosos ^16,17. No entanto, a quantidade de PrP ^Sc no ambiente é demasiado pequena para ser detectada usando técnicas convencionais, tais WB. PMCA foi utilizada para amplificar e calcular a quantidade aproximada de PrP ^Sc o meio ambiente, tais como do solo e da água ^{16, 17, 20, 21.}

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Misonix 3000	Misonix	S-3000
Misonix 4000	Misonix	S-4000
Tenbr–ck Tissue Grinder	Kontes	885000-0007
Neslab EX-7 Water Bath	Thermo Electron	Neslab EX-7
0.2 ml PCR Tube Strips	Thermo Scientific	AB-0451
Triton X-100	Sigma Aldrich	T9284-100ML
Complete Protease Inhibitor	Roche	11 697 498 001
EDTA	J.T. Baker	4040-00
DPBS	Mallinckrodt Baker Mediatech	21-031-CV
Versi-Dry Lab Soakers	Fisher Scientific	14 206 28
Repti Therm Heater	Zoo Med Laboratories, Inc.	RH-4