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Immunology and Infection

Mal plegamiento de proteínas priones de amplificación cíclica

Published: November 7, 2012 doi: 10.3791/4075
Automatic Translation
1, 2, 2
1Department of Civil Engineering, University of Nebraska at Lincoln, 2Department of Medical Microbiology and Immunology, Creighton University

Summary

Misfolding proteína amplificación cíclica (EPCP) es un ensayo in vitro para el estudio de la conversión de priones y barreras cepa y especie. También se puede utilizar como un ensayo de detección de priones.

Abstract

Los priones son los agentes infecciosos causantes de la encefalopatía espongiforme transmisible inevitablemente fatal (EET) en los animales y los seres humanos 9,18. La proteína prión tiene dos isoformas distintas, la no infecciosa proteína codificada por el hospedador (PrP C) y la proteína infecciosa (PrP Sc), una isoforma anormal de PrP plegado en C 8.

Uno de los retos de trabajar con agentes de priones es el largo período de incubación antes de la aparición de los signos clínicos después de la inoculación de acogida 13. Este mandato tradicionalmente los estudios en animales largos y caros de bioensayo. Además, las propiedades bioquímicas y biofísicas de PrP Sc están pobremente caracterizados debido a su conformación inusual y estados de agregación.

PrP Sc puede sembrar la conversión de PrP C y PrP Sc in vitro 14. El EPCP es una técnica in vitro que se Advantage de esta capacidad utilizando ciclos de sonicación y la incubación para producir grandes cantidades de PrP Sc, a un ritmo acelerado, a partir de un sistema que contiene cantidades en exceso de PrP C y pequeñas cantidades de la semilla PrP Sc 19. Esta técnica ha demostrado ser eficaz para recapitular la especificidad de especie y cepa de PrP Sc conversión de PrP C, para emular interferencia cepa de priones, y para amplificar los niveles muy bajos de PrP Sc partir de tejidos infectados, fluidos y muestras ambientales 6,7,16, 23.

Este documento detalla el protocolo EPCP, incluyendo recomendaciones para minimizar la contaminación, generando resultados consistentes, y la cuantificación de los resultados. También se discuten varias aplicaciones del EPCP, incluyendo la generación y caracterización de cepas de priones infecciosos, la interferencia cepa de prión, y la detección de priones en el medio ambiente.

Protocol

1. Preparación del Equipo

  1. Utilice un Misonix 3000 o 4000 sonicador Misonix (Farmingdale, NY) conectado a un baño de Thermo Electron Neslab EX-7 agua (Newington, NH) para mantener una temperatura constante de 37 ° C. Sonicar las muestras en 200 ul de paredes delgadas tiras de tubos de PCR con tapas abovedadas obtenidos de Thermo Scientific (Waltham, MA).
  2. Un baño de ultrasonidos nueva marca requiere de un "robo" período de operación continua 9. Un robo de dos meses consiste en una ráfaga de sonicación de 40 segundos y 10 minutos ciclos de incubación con el nivel de amplitud establece en 10. Uno debería observar la erosión a lo largo de la superficie del cuerno de titanio de microplacas (Figura 1, panel B). El agua circulante se verá blanca, turbia debido a la erosión de la bocina de titanio microplaca. Cambie el agua diariamente.
  3. La amplificación de la PrP Sc variará a través de la trompa de microplacas. La mejor eficiencia de amplificación PrP Sc se puede conseguir dentro deun radio de 5 cm desde el centro de la bocina de microplacas (Véase la Figura 1, panel C).
  4. Una ronda de EPCP consiste en 144 ciclos. Cada ciclo consta de 5 segundos sonicación y 10 min de incubación. Esto implicará aproximadamente a 24 horas por ronda del EPCP.
  5. La salida de potencia de la sonicación, se muestra en el panel de control del sonicador, varía con el número de tubos de PCR presentes en la rejilla del sonicador, y la temperatura del agua de circulación del baño de agua. Asegúrese de que el agua se equilibra a 37 ° C, y no llene más de 30% de soporte de tubos de la sonicador (Figura 1, panel C). Extienda los tubos de PCR a través de la trompa de microplacas. Tener al menos una fila de espacios vacíos entre las tiras de tubos PCR y no permitir más de cuatro tubos conectados entre sí por tira (Figura 1, panel C).
  6. La fuerza de la sonicación es crítico para una amplificación prión cepa éxito. Mientras sonicación, ajustar la amplitud de tener una potencia de salidaque oscila entre 155 ~ 170 vatios. En nuestro laboratorio, el nivel de potencia se establece en seis y siete para el 3000 Misonix Misonix y 4000, respectivamente.
  7. El uso de agua destilada en el baño de agua para evitar la acumulación de manchas de agua dura. Reemplazar esta semana el agua. Durante los ciclos de incubación y sonicación, la condensación de agua se produce en el interior de la tapa del cuerno de microplacas. Para evitar la condensación, coloque una almohadilla de calor pequeño acuario a la parte superior de la caja de la carcasa del aparato de ultrasonidos, como se muestra en la Figura 1, panel A.

2. Preparación de las muestras

  1. Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Cuidado de Animales institucional Creighton University y el empleo Comisión y cumplir con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Antes de que cualquier recogida de tejido, el animal debe ser anestesiados y perfundidos transcardialmente con fosfato enfriada con hielo una solución salina tamponada con 5 mM de EDTA a pH 7,4 para eliminar la sangre desde el cerebro y evitar la inhibición de laEPCP reacción por la sangre 7. Recoge los tejidos animales rápidamente utilizando una técnica aséptica y tienen herramientas específicas para cada cepa de disección prión. Después de la disección, colocar el tejido en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, flash que se congele en hielo seco, y almacenar a -80 ° C hasta la homogeneización.
  2. Para preparar el sustrato EPCP (PrP C) solución, homogeneizar un cerebro de hámster infectado (ONU BH) a un 10% peso / volumen (w / v) de solución con tampón de conversión enfriado con hielo (véase la parte 3), utilizando un triturador de tejidos Tenbroeck. Mientras homogeneizar, tenga cuidado de no tener aire en el interior del molino para evitar una excesiva formación de espuma en la solución. Aclarar la solución por centrifugación a 500 xg durante 30 seg y alícuota del sobrenadante en tubos de 1,5 ml de microcentrífuga. Almacenar a -80 ° C hasta su uso posterior.
  3. Para preparar la semilla EPCP (PrP Sc) solución, homogeneizar un material infeccioso (nodos cerebro, bazo, linfáticos, otros tejidos o el suelo contaminado) a un 10% w / v solución con wate hielo fríor y alícuota de la solución en tubos de microcentrífuga de 0,6 ml. Almacenar a -80 ° C hasta su uso posterior.

3. Preparación de Buffer de conversión

  1. Pesar 0,5093 g de Triton X-100 en un matraz aforado de 50 ml (el resultado es una concentración final de 1% de Triton X-100) (Sigma-Aldrich GmbH, Steinheim, Alemania).
  2. Añadir una inhibidor de proteasa completo Tablet (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania).
  3. Añadir 0,0931 g de EDTA (esto dará lugar a una concentración final 5 mM de EDTA) (Mallinckrodt Baker, Inc.; Phillipsburg, NJ).
  4. Ajustar el pH a 7,4 con NaOH 1N.
  5. Ajustar el volumen a 50 ml con fosfato de Dulbecco Buffered Saline (DPBS) (Mediatech Inc.; Manassas, VA).
  6. Filtrar la solución a través de una membrana de 0,45 micras de nitrocelulosa con un aparato de filtración a vacío. El tampón de conversión se puede almacenar a 4 ° C durante no más de un mes.

4. La amplificación de las cepas de priones mediante el EPCP

  1. Diluir la semilla EPCP en el sustrato EPCP en una proporción de 1:20 (es decir, mezcla de 5 l de la semilla EPCP y 95 l de sustrato de la PMCA) en un tubo de PCR. Retirar y almacenar una parte alícuota de 15 l a -80 ° C para el control de unsonicated; este control unsonicated se utiliza para cuantificar la amplificación PrP Sc través de proteinasa K (PK) seguido por la digestión de Western (WB) análisis. Un control unsonicated adicional podría ser generada por la colocación de una segunda alícuota de 15 l a 37 ° C durante la duración de la reacción EPCP. Un mínimo de tres repeticiones se requiere para fines estadísticos.
  2. Se somete el resto de la muestra (70 l) a una ronda de EPCP como se representa en la Figura 1, Panel A. Se mezcla tubos cada 5 hr para evitar la condensación de agua en la tapa abovedada del tubo de PCR.
  3. Tubos de la muestra deben ser centrifugadas y suavemente vortex (teniendo cuidado de que la solución no va en la tapa abovedada) antes de abrir después de cualquier procedimiento que garantice Homogeneity y evitar la contaminación potencial.
  4. Para serie EPCP (sPMCA) de corto cepas período de incubación (es decir, HY TME, HaCWD, o 263K), diluir el material sonicado en una proporción de 1:20 mediante la transferencia de 5 l de la muestra sometida a ultrasonidos desde la primera ronda en 95 l de fresco no infectada homogeneizado de cerebro (Figura 2, panel B).
  5. Para sPMCA de largos cepas período de incubación (es decir, DY TME, 139H, 22CH, 22AH, o ME7H), diluir el material sonicado en una proporción de 1:1 por transferencia de 50 l de la muestra sometida a ultrasonidos desde la primera ronda en 50 l de fresco no infectada homogeneizado de cerebro (Figura 2, panel B).
  6. 15 Retire los dos alícuotas de la mezcla previamente diluido sonicado (de pasos 4,4 o 4,5) y almacenar uno de ellos a -80 ° C y el otro a 37 ° C (soluciones de control para unsonicated EPCP la segunda ronda). Someter a los restos de una ronda EPCP dos.
  7. Este procedimiento se puede repetir indefinidamente. En nuestro laboratorio, hemoshan realizado hasta quince rounds EPCP, con las propiedades de deformación permanecerán invariables.
  8. PK digerir las muestras. Para un típico WB, mezclar 5 l de PK 80 ug / ml a 5 l de muestra (esta solución tendrá una concentración final de PK de 40 mg / ml) e incubar a 37 ° C durante una hora. Añadir 10 l de tampón de carga de gel. Hervir esta solución durante 10 min. Deje que la solución se enfríe y cargar 10 l en el gel.
  9. Para calcular el éxito de la amplificación de realizar un análisis de WB en las muestras digeridas PK-para estimar la cantidad de PrP Sc amplificado por comparación a cualquiera, los controles unsonicated 20,21 Figura 2, panel C o a cantidades conocidas de PK-sin digerir recombinante PrP.

5. Evitar la contaminación cruzada

Los pasos críticos tienen que ser tomadas para reducir al mínimo la contaminación cruzada y la ocurrencia de falsos positivos debido a la formación de novo de productos resistentes a la proteasa.

  • Utilice un conjunto dedicado de herramientas de disección (es decir, fórceps, pinzas, tijeras) para la recolección de la muestra para cada cepa de prión.
  • Antes de homogeneización de los cerebros no infectadas para ser utilizados como un sustrato de PMCA, limpiar las pipetas con 1% de lejía. Remoje la cremallera sonicador de PCR tubo, homogeneizadores de tejidos, y bastidores de almacenamiento de tubos PCR con 1% de lejía durante 10 minutos y enjuagar con agua destilada.
  • Cubra el área de trabajo con un Soaker Lab fresco Versi-Dry cada vez que una nueva muestra se homogeneiza, un nuevo experimento EPCP es estar preparado, o cuando alícuotas entre rondas sPMCA.
  • Use guantes nuevos cada vez que nuevas muestras se manejan (especialmente cuando se transfieren alícuotas entre rondas sPMCA).
  • Utilice descargas cortas sonicación durante cada ciclo del EPCP. Los ciclos de sonicación 5 sec combinado con 10 minutos de incubación es suficiente para amplificar los priones sin generar de novo PrP Sc 1,20,21,23,24. Como otros laboratorios han demostrado, el aumento de latiempo de sonicación, el aumento de la amplitud de sonicación, y aumentando el número de ciclos de PMCA aumenta la probabilidad de novo de PrP Sc formación 2.

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    Representative Results

    Misfolding proteína amplificación cíclica (PMCA) se utiliza para amplificar PrP Sc in vitro 7, 12, 14, 19, 24. El éxito de la amplificación PrP Sc se muestra por un aumento en la intensidad de la banda en las transferencias Western de la proteína priónica PK-resistente (migrando entre 19 y 30 kDa para las cepas de priones de hámster derivados) como se muestra en la Figura 3. El aumento de la intensidad de la banda después de su EPCP indica la amplificación del material resistente a la PK-PrP Sc. Amplificación exitosa de la proteína prión de hámster derivado, HaCWD y TME DY, se muestra en el análisis WB de la Figura 3 mediante la comparación de las intensidades de las bandas antes de (carriles 5 y 7) y después (carriles 4 y 6) EPCP.

    Digestión con PK de PrPSc seguido por análisis WB muestra una banda superior, medio e inferior correspondiente a la proteína prión di-, mono-, y no glicosilada, respectivamente. Algunas cepas de priones pueden ser diferenciados por su elemovilidad ctrophoretic. Por ejemplo, hay una diferencia de dos kDa en la migración entre la HaCWD y DY cepas de priones TME. (Figura 3, carriles 1 y 2, respectivamente).

    Una alta fidelidad PrP Sc amplificación se consigue mediante el EPCP 1, 7, 12, 19, 23, 24. Esta alta fidelidad en la amplificación EPCP es observado por una migración similar electroforética de las cepas de priones EPCP-amplificados (HaCWD y TME DY) cuando se compara con sus semillas correspondientes (Figura 3; carriles 1 y 4 y 2 y 6 para HaCWD y TME DY, respectivamente).

    Si no hay contaminación cruzada o de novo PrP Sc se produce la formación, el análisis de WB simulacros de control de muestras EPCP debe quedar claro después de digestión con PK (Figura 3, carriles 8 y 9).

    Figura 1
    Figura 1. Para evitar la condensación de agua, un acuario regular calor almohadilla se coloca por encima de la tapa de la bocina de microplacas (panel A). Un baño de ultrasonidos a estrenar dispongan de un período de rodaje de sonicación continua por cerca de dos meses. El panel B muestra la erosión en el cuerno de titanio microplaca después del período de rodaje. El panel C muestra una posible disposición de tiras de tubos PCR que permita una óptima sonicación de las muestras.

    Figura 2
    Figura 2. Diagrama de flujo para EPCP (panel A), sPMCA (panel B), y análisis WB (panel C). PrP Sc es la semilla del EPCP y el homogeneizado de cerebro infectado (ONU BH) es el sustrato del EPCP. La cuantificación de la amplificación de la PrP Sc para cada ronda EPCP se obtiene dividiendo la intensidad de la banda después de PMCA por su intensidad de la banda correspondiente antes de PMCA.

    ys "> Figura 3
    Figura 3. Western blot de PK-digerido HaCWD y DY TME hámster derivados de cepas de priones. PrP Sc se detecta usando 3F4 anti-anticuerpo prión. Análisis de la WB muestra la abundancia (intensidad blot) y la movilidad electroforética de PrP Sc. Reacciones EPCP se sembraron con homogeneizado de cerebro de hámsters infectados, ya sea con la HaCWD (carriles 4-5) o DY TME (carriles 6-7) agentes. Las muestras que se sometieron a EPCP (EPCP +) muestran un aumento en la abundancia PrP Sc en comparación con sus unamplified (PMCA -) controles (comparar carriles 5 a 4 y 7 a 6). Existe una diferencia de dos kDa en la migración electroforética entre las proteínas priónicas de HaCWD y TME DY (carriles 1-2). Esta diferencia en la migración se mantiene en las muestras EPCP generados utilizando HaCWD y DY homogeneizados de TME (carriles 4 y 6, respectivamente). Reacciones EPCP sembradas con cerebro no infectado (falso) homogeneizado no amplificar PrP Sc (carril 8). Las ubicaciones de los 19 y 21 kDa marcadores moleculares se indican a la izquierda del panel.

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    Discussion

    Desafíos de la amplificación de las proteínas priónicas infecciosas son los períodos de incubación largos y los gastos de los experimentos in vivo. La técnica EPCP es un medio rentable para amplificar los agentes infecciosos de priones. Varios laboratorios han confirmado la capacidad de PMCA para amplificar con precisión las cepas de priones in vitro 7, 9, 12, 14, 19,24.

    Las enfermedades por priones se pueden transmitir entre especies. Bessen y Marsh han inoculado con eficacia hamsters con encefalopatía transmisible del visón, que produjo dos diferentes derivados de hámster-5 cepas de priones. En un elegante estudio, Telling y colaboradores utiliza sPMCA para amplificar el ratón derivado de la cepa de priones, RML, utilizando ratones transgénicos que expresan PrP cérvido C (Tg (CerPrP) 1536 + / -) como sustrato EPCP. Un comienzo rápido de la enfermedad se observó después de la inoculación de Tg (CerPrP) 1536 + / - con el material adaptado EPCP-12. De manera similar, Kurt et al. Fueron capaces de amplificarcaquexia crónica (CWD), una enfermedad de priones en cérvidos, que no se usen especies de cérvidos sustrato EPCP 15. Estos datos sugieren que la barrera de las especies en las enfermedades priónicas pueden ser anuladas in vitro a través de PMCA.

    Bessen y Marsh han demostrado que la cepa de hámster corto período de incubación, HY TME, tiene una más rápida acumulación de PrP Sc en comparación con su contraparte largo período de incubación, DY TME 3, 5. Del mismo modo, esta correlación entre el período de incubación y la tasa de acumulación se observa después de EPCP en varias cepas de priones de hámster derivados de 1, 23, 24.

    La tasa de amplificación es una propiedad intrínseca de cada cepa. EPCP se ha utilizado para cuantificar esta tasa de amplificación. Ayers et al. Fueron capaces de calcular un número sin unidades, denominado coeficiente de amplificación, que representa la velocidad de amplificación para una cepa de prión de hámster dado derivado de 1.

    Prioncepas pueden interferir unos con otros cuando están presentes en el mismo hospedador. La presencia de una cepa de incubación largo período puede extender el período de incubación o incluso bloquear la capacidad de una cepa de incubación corto período de causar enfermedad. Esta extensión en período de incubación se denomina interferencia cepa. Interferencia cepa se ha demostrado que se producen en ratones y hámsters 10 22. Bartz y colaboradores han utilizado para estudiar la interferencia EPCP cepa de priones en hamsters. Sus resultados muestran que los experimentos EPCP se correlacionan con los resultados de un experimento similar in vivo 22, 23.

    Puesto que hay un nivel relativamente bajo de PrP Sc fuera del sistema nervioso central, los priones sólo se pueden diagnosticar post-mortem mediante disección del cerebro seguido por inmunohistoquímica. EPCP se puede utilizar como herramienta de diagnóstico, ya que se ha demostrado una gran capacidad de amplificar pequeñas cantidades de PrP Sc 7, incluso a partir de la orina sampl hámsteres 11.

    El agente prión es capaz de soportar condiciones ambientales duras y seguir siendo infeccioso 16,17. Sin embargo, la cantidad de PrP Sc en el ambiente es demasiado pequeño para ser detectado usando técnicas convencionales tales WB. EPCP ha sido utilizado para amplificar y calcular la cantidad aproximada de PrP Sc el medio ambiente, tales como el suelo y el agua 16, 17, 20, 21.

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    Disclosures

    No hay conflictos de interés declarado.

    Acknowledgments

    Nos gustaría dar las gracias a la Dra. Marie Ramos Vesper Fe para la lectura crítica del manuscrito. Este trabajo fue apoyado por el Centro Nacional para Recursos de Investigación (P20 RR0115635-6, C06 RR17417-01 y G20RR024001) y el Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares (2R01 NS052609).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Misonix 3000 Misonix S-3000
    Misonix 4000 Misonix S-4000
    Tenbr–ck Tissue Grinder Kontes 885000-0007
    Neslab EX-7 Water Bath Thermo Electron Neslab EX-7
    0.2 ml PCR Tube Strips Thermo Scientific AB-0451
    Triton X-100 Sigma Aldrich T9284-100ML
    Complete Protease Inhibitor Roche 11 697 498 001
    EDTA J.T. Baker 4040-00
    DPBS Mallinckrodt Baker Mediatech 21-031-CV
    Versi-Dry Lab Soakers Fisher Scientific 14 206 28
    Repti Therm Heater Zoo Med Laboratories, Inc. RH-4

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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