Summary
فرخ في electroporation البيضة هو الأسلوب الذي يسمح التلاعب الجيني للجنين الطيور. التطبيقات الشائعة لهذه التقنية تشمل تحليل وظيفي من الجينات وعناصر محسن المفترضة. هذا الفيديو يوضح العصبية electroporation أنبوب في الأجنة سمو الفرخ 10. وتناقش تقنية الحقن والتعامل السليم البيض.
Abstract
جعلت حجم كبير والتنمية الخارجية للجنين الدجاج طويلة يجعلها أداة قيمة في دراسة البيولوجيا التطورية. مع ظهور التقنيات البيولوجية الجزيئية ، وأصبح نظام الفرخ مفيدة للدراسة تنظيم الجينات ووظائفها. electroporating بواسطة الحمض النووي الريبي أو يبني في جنين الدجاج النامية ، يمكن التعبير عن الجينات أو ترسيتها من أجل تحليل وظائف الجينات في الجسم الحي. وبالمثل ، يمكن أن تستخدم لرسم خرائط البنى مراسل مصير أو لدراسة العناصر الجينية المفترضة التنظيمية. بالمقارنة مع تجارب مماثلة في الماوس ، وقد فرخ electroporation مزايا يجري سريعة وسهلة وغير مكلفة. هذا الفيديو يوضح أولا كيف لجعل نافذة في قشرة البيضة لمعالجة الجنين. المقبل ، والجنين هو تصور بمحلول مخفف من الحبر الهند حقن تحت الجنين. وتستخدم إبرة الزجاج وماصة لحقن الحمض النووي وصبغ الأخضر السريع في الأنبوب العصبي النامي ، ثم يتم وضع أقطاب البلاتين موازية للجنين وتدار النبضات الكهربائية قصيرة مع مولد النبض. وأخيرا ، ختم الشريط مع البيض ويوضع مرة أخرى في حاضنة لمزيد من التطوير. بالإضافة إلى ذلك ، يظهر الشريط الصحيح التخزين والمناولة والبيض يناقش الأسباب المحتملة لفقدان الجنين electroporation التالية.
Protocol
التعامل مع البيض
- يجوز إبقاء البيض على 13 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد قبل الحضانة دون خسائر كبيرة في البقاء (أ برودة النبيذ الصغيرة مثالية لهذا الغرض).
- قبل الحضانة ، والسماح لتدفئة البيض إلى درجة حرارة الغرفة ، ثم تضعها في ترطيب حاضنة الدجاج تعيين إلى 37.8 درجة مئوية (100 درجة فهرنهايت).
- نحن electroporate الأجنة عادة حوالي 48 ساعة من بداية الحضانة ، وعندما وصلت الجنين همبرغر وهاميلتون 10 مرحلة.
- قد يختلف وقت الحضانة وفقا لهمبرغر المطلوب والمرحلة هاملتون. ودرجة الحرارة الحرجة والانحراف عن درجة الحرارة المثلى تغيير الحضانة فترة حضانة وانخفاض قابلية الجنين.
- أثناء الحضانة ، ينبغي أن يوضع البيض على الجانبين بحيث يكون الجنين في وضع مناسب لelectroporation. فإن الجنين تطفو على السطح من صفار وأنه من المفيد للاحتفال رأس البيضة مع قلم رصاص قبل النوافذ حتى يتسنى لك معرفة من أين قطع.
إعداد
- الحارة يبوفيتش L - 15 وسائل الاعلام الى 37 درجة مئوية. سحب الزجاج الشعيرات الدموية في الإبر. أقطاب موقف وmicromanipulator والاتصال لأقطاب مولد النبض.
النوافذ
- باستخدام المحاقن مع إبرة تحمل كبيرة ، تخترق قذيفة في نهاية صغيرة من البيض.
- مشيرا الإبرة الهبوط بعناية لمنع الفوضى من صفار البيض ، وإزالة حول 5ml من الزلال.
- ختم الحفرة مع قطعة صغيرة من الشريط.
- يغطي الجزء العلوي من البيض مع آخر قطعة من الشريط (عن 4x4 سم).
- باستخدام مقص منحني ، ومع الحرص على عدم تعطيل الجنين ، وقطع حفرة واسعة بما يكفي لتوفير إطار للعمل فيه.
اختياري : لتصور الأنبوب العصبي ، وضخ الحبر الحل مع إبرة قياس 26 تحت الجنين (ادخال ابرة تحت الجنين من خارج الحلبة الدم). وينبغي أن تضعف الهند الحبر 01:05 بمحلول معقم أو هانكس مقارنة مخزنة.
الحقن وElectroporation
- كسر غيض الشعرية إلى القطر المطلوب باستخدام الملقط
- باستخدام ماصة الفم ، تحميل شعري مع الصبغة الخضراء البلازميد / السريع.
- موقف الجنين مع رئيس نحوك وادخال الإبرة في الأنبوب العصبي بزاوية ضحلة.
- حقن محلول البلازميد في تجويف الأنبوب العصبي حتى صبغ يملأ الفضاء كله.
ملاحظة : كن حذرا ليس لديهم أكبر قطر الحافة ثم الأنبوب العصبي. عموما ، سوف تكون قادرة على معرفة ما إذا كان قد تحقق حجم الأمثل من قبل طرف مدى سهولة أو صعوبة لسحب السائل إلى الشعيرات الدموية. إذا كان هناك مقاومة حادة ، وفتح هو على الارجح صغيرة جدا ، وينبغي أن تكون مكسورة الطرف مرة أخرى على مستوى اعلى. إذا كان هناك مقاومة تذكر أو لا ، وفتح كبير جدا ويجب استخدام إبرة جديدة.
- مكان 1-2 قطرات من وسائل الاعلام L - 15 العقيمة على الجنين.
- المكان فورا الأقطاب على جانبي الجنين ، موازية لالأنبوب العصبي ، ومرات في 5 نبض 10-24 فولت لمدة 50 mseconds في 1 فترات الثانية. سوف ترى فقاعات بالقرب من الأقطاب الكهربائية اذا عملت بشكل صحيح.
- إزالة بعناية الأقطاب الكهربائية ، وطرح 5 قطرات من L - 15 على رأس الأجنة وختم الشريط مع البيض. تأكد من أن يتم ختم جيدا البيض ، والتجفيف هو المساهم الرئيسي في فقدان الجنين التالية electroporation.
- البيض مرة أخرى إلى مكان الحاضنة ، جنبا نافذة تصل ، واحتضان حتى يصلوا المطلوب H & H المرحلة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هذا البروتوكول يوفر دليل خطوة بخطوة لelectroporation الأنبوب العصبي للأجنة الدجاج HH10. بالإضافة إلى عرض هذه التقنية ، كما تقدم مبادئ توجيهية للتخزين والمناولة من البيض. هذه التقنية لديها مجموعة واسعة من التطبيقات للتحليل الوراثي والتكلفة المنخفضة وسهولة من التجارب يجعلها ممكنة للمختبرات عديدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chicken egg incubator | humidified, set to 37.80°C (100F). | ||
| Pulse generator | Genetronics | BTX T820 | Square wave generator or comparable |
| Electrodes | our electrodes were made from 0.25 mm diameter platinum wire and were 5 mm long and spaced 1 mm apart | ||
| Connecter cables | |||
| Micromanipulator | |||
| Dissecting scope | with large working distance | ||
| Glass capillaries | and capillary puller or commercial glass needles | ||
| Leibovitz’s L-15 media | |||
| chicken eggs | fertilized | ||
| Curved scissors | |||
| 10 ml syringe | |||
| Large bore needle | 16-18G | ||
| Mouth pipette | |||
| India ink | |||
| Insulin syringe/syringe | |||
| Plasmid DNA | ≥ 1μg/μl in sterile TE or 1X PBS containing 0.05% Fast Green dye |
References
- 'Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression. Nat Cell Biol. 1, 203-207 (1999).
