In Ovo Electroporations von HH Stage 10 Hühnerembryonen

Summary

Küken in ovo Elektroporation ist eine Technik, die genetische Manipulation der Vogelembryo ermöglicht. Typische Anwendungen für diese Technik sind die funktionelle Analyse von Genen und vermeintlichen Enhancer-Elemente. Dieses Video zeigt Neuralrohr Elektroporation in HH 10 Hühnerembryonen. Injektionstechnik und ordnungsgemäße Eibehandlung werden diskutiert.

Abstract

Größe und externe Entwicklung des Hühnerembryo schon lange gemacht, ein wertvolles Werkzeug in der Studie der Entwicklungsbiologie. Mit dem Aufkommen von molekularbiologischen Techniken, hat das Küken zu einem nützlichen System, in dem Gen-Regulation und Funktion zu studieren. Durch Elektroporation DNA-oder RNA-Konstrukte in den Entwicklungsländern Hühnerembryo können Gene exprimiert werden können oder nach unten, um in vivo Funktion von Genen zu analysieren klopfte. Ebenso kann Reporter-Konstrukte für das Schicksal Mapping verwendet werden oder zur vermeintlichen Gen regulatorische Elemente zu untersuchen. Im Vergleich zu ähnlichen Versuchen in der Maus hat chick Elektroporation den Vorteil, dass schnell, einfach und kostengünstig. Dieses Video zeigt zunächst, wie man ein Fenster in die Eischale zu machen, um den Embryo zu manipulieren. Anschließend wird der Embryo sichtbar gemacht mit einer verdünnten Lösung von Tusche unter den Embryo injiziert. Ein Glas Nadel und Pipette werden verwendet, um DNA und Fast Green Farbstoff in die Entwicklung des Neuralrohrs, dann Platin-Elektroden sind parallel zu den Embryo gelegt und kurze elektrische Impulse werden mit einem Impulsgeber verabreicht zu injizieren. Schließlich wird das Ei mit Klebeband verschlossen und wieder in einen Inkubator für die weitere Entwicklung. Zusätzlich zeigt das Video richtigen Ei Lagerung und Handhabung und diskutiert mögliche Ursachen des Embryos Verlust nach der Elektroporation.

Protocol

Egg Handling

1. Eier können bei 13 ° C aufbewahrt werden bis zu einer Woche vor der Inkubation ohne signifikanten Verlust der Lebensfähigkeit (eine kleine Wein-Kühler eignet sich ideal für diesen Zweck).
2. Vor der Inkubation, damit Eier auf Raumtemperatur, dann in einem befeuchteten Inkubator Huhn auf 37,8 eingestellt warmen ° C (100 ° F).
3. Wir in der Regel elektroporieren Embryonen etwa 48 Stunden nach Beginn der Inkubation, wenn der Embryo hat Hamburger und Hamilton Stufe 10 erreicht hat.
4. Die Zeit der Inkubation kann je nach gewünschten Hamburger und Hamilton Bühne variieren. Temperatur ist von entscheidender Bedeutung und eine Abweichung von optimalen Inkubationstemperatur verändert die Inkubationszeit und Abnahme Embryo Lebensfähigkeit.
5. Während der Inkubation sollten die Eier auf ihren Seiten gehalten werden, damit der Embryo richtig wird für die Elektroporation positioniert werden. Der Embryo wird oben auf dem Dotter schwimmen und es ist hilfreich, um die Spitze des Ei mit einem Bleistift vor Windowing, so dass Sie, wo zu schneiden wissen.

Vorbereitung

1. Warm Leibovitz L-15 Medien bis 37 ° C. Pull Glaskapillaren in Nadeln. Position Elektroden und Mikromanipulator und verbinden Elektroden an den Impulsgenerator.

Windowing

1. Mit einer Spritze mit großkalibrigen Kanüle, durchbohren die Schale auf dem kleinen Ende des Eies.
2. Und dabei die Nadel vorsichtig nach unten, um Störungen des Dotters zu verhindern, etwa 5 ml Albumin zu entfernen.
3. Dichten Sie das Loch mit einem kleinen Stück Klebeband.
4. Decken Sie die Oberseite des Eies mit einem anderen Stück Klebeband (ca. 4x4 cm).
5. Mit einer gebogenen Schere, und kümmert sich nicht um den Embryo zu stören, schnitt ein Loch gerade groß genug, um ein Fenster in die Arbeit.

Optional: Zur Visualisierung der Neuralrohrdefekte, injizieren Tinte Lösung mit 26-Gauge-Nadel unter dem Embryo (insert Nadel unter der Embryo außerhalb der Blut-Ring). Tusche sollte 1:5 mit Hanks oder vergleichbarer sterile gepufferte Lösung sein.

Injektion und Elektroporation

1. Break the Kapillarspitze auf gewünschten Durchmesser mit einer Pinzette
2. Mit dem Mund pipettieren, laden Sie die Kapillare mit Plasmid / Fast Green Farbstoff.
3. Position der Embryo mit dem Kopf in Ihre Richtung und führen Sie die Nadel in das Neuralrohr in einem flachen Winkel.
4. Spritzen Sie die Plasmid-Lösung in das Lumen des Neuralrohrs bis Farbstoff füllt den gesamten Raum.

Hinweis: Achten Sie darauf, nicht bis zur Spitze größer als Neuralrohr Durchmesser haben. In der Regel werden Sie in der Lage sein zu sagen, ob die optimale Größe der Spitze hat, wie leicht oder schwer es ist, Flüssigkeit in die Kapillare ziehen erzielt worden. Wenn es extreme Beständigkeit, ist die Eröffnung wahrscheinlich zu klein und die Spitze sollte wieder höher werden aufgebrochen. Wenn es wenig oder keinen Widerstand, ist die Öffnung zu groß und eine neue Nadel verwendet werden.

1. Legen Sie 1-2 Tropfen steriler L-15 Medien auf den Embryo.
2. Anschließend wird der Elektroden auf beiden Seiten des Embryos, parallel zu den Neuralrohrdefekten und Puls 5 mal bei 10-24 Volt für 50 mseconds Abstand von 1 Sekunde. Sie werden Luftblasen in der Nähe der Elektroden zu sehen, ob alles korrekt funktioniert.
3. Entfernen Sie vorsichtig Elektroden, legte 5 Tropfen L-15 auf der Oberseite des Embryos und Dichtung das Ei mit Klebeband. Stellen Sie sicher, dass das Ei gut abgedichtet ist, da die Trocknung ein wesentlicher Faktor für Embryo Verlust nach der Elektroporation.
4. Die Eier wieder in den Inkubator, Fenster nach oben, und inkubieren, bis sie H & H-Stufe gewünscht zu erreichen.

Discussion

Dieses Protokoll bietet eine Schritt-für Schritt-Anleitung zum Neuralrohr Elektroporation von HH10 Hühnerembryonen. Zusätzlich zu zeigen, die Technik wird Richtlinien für die Lagerung und Handhabung von Eiern zur Verfügung gestellt. Diese Technik hat eine breite Palette von Anwendungen für die genetische Analyse und die Leichtigkeit und geringen Kosten von Experimenten macht sie möglich für viele Labors.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chicken egg incubator			humidified, set to 37.80°C (100F).
Pulse generator	Genetronics	BTX T820	Square wave generator or comparable
Electrodes			our electrodes were made from 0.25 mm diameter platinum wire and were 5 mm long and spaced 1 mm apart
Connecter cables
Micromanipulator
Dissecting scope			with large working distance
Glass capillaries			and capillary puller or commercial glass needles
Leibovitz’s L-15 media
chicken eggs			fertilized
Curved scissors
10 ml syringe
Large bore needle			16-18G
Mouth pipette
India ink
Insulin syringe/syringe
Plasmid DNA			≥ 1μg/μl in sterile TE or 1X PBS containing 0.05% Fast Green dye