Summary
Ovo elektroporasyon Civciv kuş embriyonun genetik manipülasyon sağlayan bir tekniktir. Bu tekniğin yaygın uygulamalar genlerin fonksiyonel analiz ve olası artırıcı unsurları içerir. Bu video HH 10 civciv embriyosunda nöral tüp elektroporasyon göstermektedir. Enjeksiyon tekniği ve uygun yumurta taşıma tartışılmıştır.
Abstract
Büyük boy ve tavuk embriyo dış gelişimi kadar değerli bir araç gelişimsel biyoloji çalışma yaptık. Piliç, moleküler biyoloji teknikleri gelişiyle ile gen regülasyonu ve fonksiyonu incelemek için yararlı bir sistem haline gelmiştir. , Genler, gelişmekte olan tavuk embriyonun içine DNA veya RNA yapıları electroporating ifade veya in vivo gen fonksiyonu analiz etmek için yere serdi. Benzer şekilde, muhabir yapıları kaderi haritalama için kullanılan ya da varsayılan gen düzenleyici unsurları incelemek. Fare benzeri deneyler karşılaştırıldığında, civciv elektroporasyon, hızlı, kolay ve ucuz olma avantajları vardır. Bu video ilk embriyo kabuğu işlemek için bir pencere nasıl gösteriyor. Sonra, embriyo, embriyo altına enjekte Hindistan mürekkep bir çözelti ile görüntülendi. Bir bardak iğne ve pipet gelişmekte olan nöral tüp, daha sonra platin elektrotlar embriyo paralel olarak yerleştirilir ve kısa bir darbe jeneratörü elektrik darbeleri ile yönetilmektedir DNA ve Hızlı Yeşil boya enjekte etmek için kullanılır. Son olarak, yumurta bandı ile mühürlenir ve daha da geliştirilmesi için bir inkübatör içine geri yerleştirilir. Ayrıca uygun yumurta depolama ve işleme, video gösterileri ve embriyo kaybı aşağıdaki elektroporasyon olası nedenleri açıklanır.
Protocol
Yumurta taşıma
- Yumurta canlılığının önemli bir kayıp olmadan (küçük bir şarap soğutucusu, bu amaç için idealdir) kuluçka için bir hafta öncesine kadar 13 ° C'de muhafaza edilebilir.
- Inkübasyondan önce, yumurtalar inkübatör 37.8 nemlendirilmiş bir tavuk, sonra oda sıcaklığında, yer ısınmasını bekleyin ° C (100 ° F).
- Biz genellikle inkübasyon başlangıcında, embriyo Hamburger ve Hamilton aşamada 10 ulaşmıştır embriyolar yaklaşık 48 saat electroporate.
- Inkübasyon süresi istenen Hamburger ve Hamilton sahne göre değişebilir. Sıcaklık en iyi inkübasyon sıcaklığı kritik ve sapma, inkübasyon süresi ve azalma embriyo canlılığı değiştirecektir.
- İnkübasyon sırasında, yumurta, embriyo elektroporasyon için doğru konumda olacaktır, böylece onların yüzüne muhafaza edilmelidir. Embriyo, yumurta sarısı üst şamandıra ve burada kesmek için biliyorum pencereleme önce bir kalem ile yumurtanın üst işaretlemek için yararlı olur.
Hazırlık
- 37 ° C'ye kadar Sıcak Leibovitz L-15 medya Cam kılcal damarlar iğne içine çekin. Pozisyon elektrotlar ve mikromanipülatör ve darbe jeneratörü elektrotları bağlamak.
Pencereleme
- Delmek küçük sonunda yumurta kabuğu, İğne çapı büyük olan bir şırınga yardımıyla.
- Yumurta sarısı kesintileri önlemek için dikkatli bir şekilde aşağı iğne işaret ederek, albumin 5ml hakkında çıkarın.
- Küçük bir parça bant ile delik Seal.
- Başka bir parça bant (4x4 cm) yumurtanın üst kapağı.
- Kavisli makas kullanarak ve embriyo bozabilir özen, çalışmak için bir pencere sağlamak için yetecek büyüklükte bir delik kesti.
İsteğe Bağlı: nöral tüp görselleştirmek için, embriyo altında 26 iğne (kan ring dışına embriyo altında iğneyi) ile çözüm mürekkep enjekte edilir. Hindistan mürekkep Hanks veya benzer steril bir tampon çözelti ile 1:05 seyreltilmelidir.
Enjeksiyon ve Elektroporasyon
- Cımbız kullanarak istenilen çapa kapiller uç kesme
- Ağız pipet kullanarak, plazmid / Hızlı Yeşil boya ile kılcal yükleyin.
- Size doğru kafa ile embriyo yerleştirin ve nöral tüp içine iğne sığ bir açıyla yerleştirin.
- Plazmid çözüm boya tüm alanı doldurana kadar nöral tüp lümeni içine enjekte edilir.
Not: ucu daha geniş nöral tüp çapı var dikkatli olun. Genel olarak, optimum uç boyutu kapiller sıvı çekmek için ne kadar kolay ya da zor elde edilip edilmediğini söylemek mümkün olacaktır. Aşırı direnç varsa, açılış muhtemelen çok küçük ve ucu kadar yüksek tekrar kırılmış olmalı. Çok az veya hiç direnç varsa, açılması çok büyük ve yeni bir iğne kullanılması gerekir.
- Embriyo üzerinde steril L-15 medya Yeri 1-2 damla.
- Hemen 1 saniyelik aralıklarla 50 mseconds için 10-24 volt embriyonun her iki tarafta nöral tüp paralel elektrotlar, ve darbe 5 kat yerleştirin. Düzgün bir şekilde çalışıp çalışmadığını elektrotlar yakın kabarcıklar göreceksiniz.
- Dikkatle, elektrotlar kaldırmak L-15, 5 damla embriyoların üstüne koydu ve bant ile yumurta mühür. Kurutma elektroporasyon aşağıdaki embriyo kaybı için önemli bir etken olduğu gibi yumurta, mühürlenmiş olduğunu emin olun.
- Inkübatör içine yerleştirin yumurta, pencere yüzü yukarı, ve H & H aşamada istenilen ulaşana kadar inkübe edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol HH10 civciv embriyosunda nöral tüp elektroporasyon için bir adım adım kılavuz sağlar. Tekniği gösteren ek olarak, yumurta taşıma ve depolama için kılavuzlar da verilir. Bu teknik, genetik analizi için geniş bir uygulama yelpazesine sahiptir ve deney kolaylığı ve düşük maliyetli birçok laboratuvar için de uygun hale getirir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chicken egg incubator | humidified, set to 37.80°C (100F). | ||
| Pulse generator | Genetronics | BTX T820 | Square wave generator or comparable |
| Electrodes | our electrodes were made from 0.25 mm diameter platinum wire and were 5 mm long and spaced 1 mm apart | ||
| Connecter cables | |||
| Micromanipulator | |||
| Dissecting scope | with large working distance | ||
| Glass capillaries | and capillary puller or commercial glass needles | ||
| Leibovitz’s L-15 media | |||
| chicken eggs | fertilized | ||
| Curved scissors | |||
| 10 ml syringe | |||
| Large bore needle | 16-18G | ||
| Mouth pipette | |||
| India ink | |||
| Insulin syringe/syringe | |||
| Plasmid DNA | ≥ 1μg/μl in sterile TE or 1X PBS containing 0.05% Fast Green dye |
References
- 'Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression. Nat Cell Biol. 1, 203-207 (1999).
