Ферстер резонансный перенос энергии (FRET) микроскопия является мощным средством для мониторинга в реальном времени сигнальных событий в живых клетках с помощью различных биосенсоров, как журналисты. Здесь мы опишем, как создать индивидуальный эпифлуоресцентной FRET системы формирования изображения из коммерчески доступных компонентов и как использовать его для FRET экспериментов.
Ферстер резонансный перенос энергии (FRET) микроскопии продолжает набирать все больший интерес как метод для мониторинга в реальном времени биохимических и сигнальных событий в живых клетках и тканях. По сравнению с классическими биохимическими методами, эта новая технология характеризуется высоким временным и пространственным разрешением. FRET экспериментах используют различные генетически закодированный биосенсоры, которые могут быть выражены и отображаемого с течением времени на месте или в естественных условиях 1-2. Типичные биосенсоров может либо сообщить белок-белковых взаимодействий путем измерения FRET между флуорофором с метками пары белков или конформационных изменений в единый белок, который питает донора и акцептора флуорофоров взаимосвязаны с обязательным фрагментом для молекулы интереса 3-4. Бимолекулярные биосенсоры для белок-белковых взаимодействий относятся, например, строит, предназначенная для контроля G-белок активации в клетках 5, в то время как мономолекулярный датчики измеренияSuring конформационные изменения, которые широко используются для изображения вторичные мессенджеры, такие как кальций 6, цАМФ 7-8, инозитфосфатов 9 и цГМФ 10-11. Здесь мы опишем, как создать индивидуальный эпифлуоресцентной FRET система визуализации от одного коммерчески доступных компонентов и, как контролировать все настройки с помощью Micro-менеджер бесплатно. Этот простой, но мощный инструмент предназначен для регулярного или более сложные FRET измерений в живых клетках. Полученные изображения обрабатываются с помощью самостоятельной письменной плагинов для визуализации изменений в соотношении FRET в режиме реального времени во время любых экспериментов перед сохранением в графическом формате совместимым с встроенным в ImageJ бесплатной использованы для последующего анализа данных. Эта недорогая система характеризуется высокой гибкостью и могут быть успешно использованы для мониторинга различных биохимических событий и сигнальные молекулы множество доступных FRET биосенсоров в живых клетках и тканях. В качестве примера мы покажем, чвл использовать это изображение системы для выполнения мониторинга в реальном времени цАМФ в клетках живых 293А при стимуляции β-адренорецепторов агонистов рецепторов и блокатора.
В этом протоколе, мы покажем, как построить простой недорогой, но мощный FRET системы визуализации для обычных приложений с различных доступных биосенсоров. Система, представленная здесь, предназначена для CFP и YFP или аналогичных типов флуоресцентных белков, как донорно-акцепторных пар. ?…
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы поблагодарить Анке Rüttgeroth и Карина Zimmermann для оказания технической помощи. Эта работа была поддержана Deutsche Forschungsgemeinschaft (грант NI 1301/1-1 фон) и Геттингенском университете Медицинского Центра ("за Futura" грант VON).
Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments |
BES Buffer Grade | AppliChem | A1062 | |
CaCl2 dihydrate | Sigma-Aldrich | C5010 | |
Glass coverslides | Thermo Scientific | 004710781 | Diameter 24 mm |
Glass-bottomed cell-culture dishes | World Precision Instruments | FD3510-100 | |
D-MEM medium | Biochrom AG | F0445 | |
Fetal calf serum (FCS) | Thermo Scientific | SH30073.02 | |
L-Glutamine | Biochrom AG | K0283 | |
HEPES | Sigma | H4034 | |
KCl | Sigma | P5405 | |
MgCl2 hexahydrate | AppliChem | A4425 | |
NaCl | AppliChem | A1149 | |
Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S9707 | |
Penicillin/Streptomycin | Biochrom AG | A2213 | |
Inverted fluorescent microscope | e.g. Nikon | Request at Nikon | |
CoolLED | CoolLED | pE-100 | 440 nm |
DualView | Photometrics | DV2-SYS | |
DualView filter slider | Photometrics | 05-EM | |
CFP/YFP filter set | Chroma Technology | 49052 | without the emission filter |
ORCA-03G camera | Hamamatsu Photonics | C8484-03G02 | |
Arduino I/O board | Sparkfun Electronics | DEV-00666 | |
Attofluor cell chamber | Invitrogen | A-7816 | |
Personal computer with WindowsXP or Windows7 system | Any supplier | Include hard-drive with high capacity |