Summary
福斯特共振能量转移（FRET）显微镜是一种功能强大的技术，使用各种生物传感器记者在活细胞中的信号转导事件的实时监控。在这里，我们将介绍如何建立一个自定义的表面荧光共振成像系统从商业上可用的组件和如何使用它的FRET实验。
Abstract
福斯特共振能量转移（FRET）显微镜将继续作为一个在活细胞和组织的生化事件和信号的实时监控技术获得越来越多的关注。与传统的生化方法相比，这种新技术的特点是高时空分辨率的。 FRET实验使用不同的基因编码的生物传感器，它可以表示随着时间的推移， 在现场或在体内 1-2和成像。典型的生物传感器可以报告通过测量FRET的荧光团标记的对蛋白质或构象的变化，在一个单一的蛋白质窝藏景点3-4的分子与结合部分相互连接的供体和受体荧光团之间的蛋白质-蛋白质相互作用。蛋白质-蛋白质相互作用的双分子生物传感器包括，例如，构建设计用于监控电池单元5中的G-蛋白激活，而单 分子传感器测量被广泛地用于图像的第二信使如钙6中，cAMP 7-8，肌醇磷酸盐9和cGMP 10-11一定的构象变化。在这里，我们将介绍如何建立一个定制的萤光共振成像系统，从单一的商业可用的组件，如何控制整个安装使用微管理器免费。这个简单但功能强大的仪器是专为在活细胞中的常规或更复杂的FRET测量。自写插件使用过程中的变化在FRET比在实时可视化图形格式被存储在任何实验之前获得的图像处理兼容内置的ImageJ的免费软件，用于后续的数据分析。这种低成本系统的特点是灵活性高，可以成功地用于监测各种的生化事件和信号分子提供了大量的共振生物传感器在活细胞和组织。作为一个例子，我们展示了ĤOW使用这种成像系统进行实时监控中cAMP现场293A细胞刺激后，与β-肾上腺素能受体激动剂和阻滞剂。
Protocol
1。建立一个共振成像显微镜
原则上，任何倒置荧光显微镜，这是在实验中，有一个摄像头端口，可以适用于FRET成像。最后的安装应包括下列关键组成部分：一台显微镜，一个光源或无需额外的快门，以及一个CCD摄像头（参见图1）发射光的光束分离器，用于。的硬件设备，特别是光源，快门和相机被集成到由成像的图像采集和分析的软件，该软件允许控制。下面我们将介绍一个过程来组装一个简单的共振系统，从商业上可用的组件。
- 将光源的显微镜。例如，使用单波长的发光二极管（CoolLED P E-100，440 nm处），选择性增强型青色荧光蛋白（CFP）作为捐助者中最兴奋的共振生物传感器。它可以直接ly和容易地连接到落射荧光显微镜的照明端口。还有也多波长的LED可用，可以以类似的方式连接。相反，可以使用LED，以及其他如XBO75氙弧灯（通常用于奥林巴斯和蔡司显微镜）或HBO汞灯（通常尼康显微镜上安装）标准光源。在荧光灯的情况下，你也应该放置在灯和照明端口启用辅助软件到您的样品的激发光来控制快门。 CoolLED不要求任何额外的快门，因为它可以直接接通和断开由软件。单色LED系统的缺点是有限数量的激发波长，而与各过滤器组的荧光灯是一种更加灵活的选择，特别是当使用多个和双分子的生物传感器。另外，单色光源（ 如多彩V，TILLPhotonics），他们通常有一个集成的快门，可以通过软件控制触发信号。
- 将适当的过滤器多维数据集在显微镜。对于常规的FRET测量CFP和增强型黄色荧光蛋白（YFP）或它们的变体作为FRET对，我们用一个简单的过滤器立方体包含的ET436/30M激发过滤器（使用LED时，可以省略，但不可缺少的当使用了氙气或汞灯，而不是LED）和一个DCLP455分色镜。显微镜时，应配备适合一个很好的高分辨率荧光显微镜的目标，例如一个计划，氟石，计划NEOFLUAR或计划复消色差透镜40倍，60倍或100倍油浸目标。
- 上的荧光的光开关，并检查是否被均匀地分布在整个视场的光点。如果不是这种情况下，附加的对准的LED或灯泡所需的检体，以达到最佳的照明。这可以是PERFORMED通过使用在空间定位的二极管或灯泡的螺钉。
- 连接通过一个C型的光束分离器一个显微镜的排放端口。例如，使用DV2双屏显示（配光曲线），这将发射光分为两个通道（供体和受体）在一个单一的CCD摄像头芯片可以同时监测。另外，还有一些其他可比较的产品，如Optosplit（大老山研究）或滨松ORCA-D2的双波长的摄像头集成到一个分束器。对于CFP / YFP FRET对，我们使用05-EM过滤器集，其中包含的505dcxr分色镜加ET480/30M和ET535/40M排放过滤器，CFP和YFP，分别提供与DV2。取而代之的是分束器，两个滤波器立方体为供体（含有ET436/30M激发CFP，DCLP455分色镜和CFP发射滤光器的滤波器，用于）和受体（含有的CFP激发滤光器，DCLP455和YFP的发射滤光片）信道被用于在许多共振系统。另外，一个过滤器，可以安装在镜头前没有任何排放过滤器和自动发射滤光片轮位置的立方体。在这种情况下，电动显微镜或两个发射过滤器的位置在〜200-300毫秒内的滤光轮之间交替执行比例式成像。这种轻微的延迟是可以接受的，成像时相当慢的细胞内过程，如cAMP信号，其中真正的同时采集两个通道是不是关键的。
- 连接的CCD摄像机（使用例如ORCA-03G或从Hamamatsu Photonics ORCA-R2）的分束器。使用FireWire电缆将相机连接到计算机接口的IEEE1394，随相机附送的使用手册中的说明。在相机上安装摄像头驱动程序，而无需切换。
- 最后，建立计算机和光源之间的通信，连接Arduino的I / O板（例如阿尔杜伊诺Duemilanove或Arduino的乌诺）的LED或t使用BNC连接线，它应该包含一个正常的BNC插头上的LED侧和两个单导线的另一端上，如在图2中示出的引脚GND（0）和8的电路板连接到o的快门。组装电路板，可直接连接到您的计算机的USB端口。
2。设置的成像软件
来控制和同步的光源与由相机捕获的图像，图像处理软件应安装在计算机上。有几种商业套装软件包括MetaFluor（分子式设备），Slidebook（智能成像创新），VisiView（Visitron系统）。在这里，我们演示了如何使用的开源微管理器的免费软件，它提供了高度的灵活性，低成本成像。
- 下载该软件的http://valelab.ucsf.edu/〜的MM / MMwiki /指数。PHP /微Manager_Version_Archive的。我们建议安装1.4.5发布，这是很容易配置在我们的手中。
- 将Arduino板到您的计算机的USB端口。下载软件来控制Arduino板http://www.arduino.cc/en/Main/software 。按照说明这个网站上找到并运行该软件只是一个时间开始之前，微经理。上传板微Manager软件使用的代码。该代码可以下载，在http://valelab.ucsf.edu/〜的MM / MMwiki /的index.php / Arduino的 。
- 上的LED和摄像头切换。开始的微Manager之间的通信软件和配置的摄像头和LED（光源和快门）选择“工具”>“硬件配置向导（ 见图3）。添加所需的组件，包括您的相机（ 即Hamamatsu_ DCAM）和，Arduino板（添加Arduino的开关，Arduino的轮毂和Arduino的快门装置）。在接下来的步骤中，向导建议使用默认设置。按向导提示时，保存新的系统配置。
- 使用主菜单中打开“工具”>“设备属性浏览器。向下滚动到“Arduino的开关状态”，选择“1”。关闭对话框。确保在主要的软件“对话框中勾选”自动快门“框。按“文件”>“保存系统状态，应随时启动该软件后，打开保存的软件配置。这将建立董事会之间的沟通和所需要的软件进行图像采集。
- 按“实时”监控来自摄像机的信号。确保在任何时间，“现场”或“快照”功能，选择荧光灯。在开始的第一次测量，按照说明您的光束分离器，每形成两个通道的光学对准。
3。细胞培养和转染
- 准备与蒸压轮24毫米玻璃coverslides（1 coverslide每孔）的6孔培养板。或者，玻璃有底的细胞培养皿中都可以使用。
- 铠甲，293A细胞到板或菜在D-MEM培养基（补充了10％FCS，1％L-谷氨酰胺和1％青霉素/链霉素溶液），使细胞达到50-70％汇合后1天。
- 24小时后，电镀，转染的细胞在层流工作台与FRET传感器质粒用磷酸钙转染法（见3.5）。环磷酸腺苷生物传感器的质粒可以从本集团根据要求提供。读者也被称为7,8描述其他可用的环磷酸腺苷生物传感器的综合评论。
- 在转染细胞，用于第一时间前，准备转染试剂。化妆的2.5M的CaCl 2和2xBBS解决方案（后者含有1.5毫摩尔的Na 2 HPO 4，50mM的BES，280 mM氯化钠，用NaOH调整到PH值为6.95），在去离子水中。无菌滤液的解决方案，使用常规的0.2微米的过滤器。
- 要转染6孔板或6玻璃底船菜肴，混合10μg的FRET传感器质粒，加入50μl2.5M CaCl 2溶液和无菌水至500微升。拌匀。
- 加入500μl的2个论坛。充分混匀，孵育10分钟，在室温下的混合物。
- 吸取165μL转染混合溶液到每口井或菜。轻轻地搅动板，并把它放回孵化器。 FRET测量转染24小时后，细胞通常都愿意。确保细胞没有达到会合在这一点上，因为这可能影响几个细胞表面受体的活性。
4。在活细胞中的荧光共振能量转移测量
- 在第一时间测量之前，准备FRET的缓冲液含有144毫摩尔NaCl，5.4 mM KCl中，1毫摩尔MgCl 2，2mM的的CaCl 2，10 mM HEPES的在去离子水中，并用NaOH将pH调节至7.3。稀释成像实验与FRET缓冲器中要使用的化合物。
- 启动图像处理软件。加载先前定义系统配置。选择“文件”>“加载系统状态选择先前配置的系统状态。
- 安装一个coverslide贴壁转染293A细胞成像室（ 如 Attofluor细胞室）。洗涤细胞，用荧光共振能量转移缓冲液和荧光共振能量转移缓冲液中加入400μl。当使用玻璃有底细胞培养皿洗涤贴壁细胞和缓冲每个培养皿中加入2毫升。我们执行所有测量FRET的缓冲液HEPES，所以，在室温下在无CO 2的控制是必要的。
- 把一些浸油到目标转移到显微镜的成像室。专注于细胞层采用透射光。
- 上的荧光韧带切换HT按“实时”按钮，选择一个单元格的实验。选择一个单元格与的最佳传感器表达，这意味着它应该不是太亮，不是太暗。找到一个合适的细胞后，立即关掉日光灯，以避免漂白FRET传感器。
- 在“相机设置”的方式，导致一个很好的信号与噪声的比例，按“对齐”按钮后，所获取的图像（通常是10至50毫秒）调整曝光时间。 ，激发时间太长，可能会导致在漂白，过于短的时间内产生的图像质量低。
- 按“多-D ACQ”。按钮和设置的时间点，并进行图像采集的时间间隔的数目。我们的营地-FRET传感器，我们获得了一个形象，每5秒。
- 按“采集”按钮开始测量。
- 在任何测量过程中，可以使用“FRET在线”插件（可在网上补充 ，所有的插件必须是缔约方会议IED微Manager软件的“插件”文件夹，然后再启动它）来监视FRET比例的变化。运行此插件，并在FRET比图像使用“写意选择”工具选择一个区域的利益。加入区域的ROI经理，按“平均”按钮，在“时间序列分析”窗口。 FRET比跟踪将被显示。在测量过程中，要更新跟踪运行的“FRETratioOnline2”插件，按“GetAverage”按钮。
- 只要FRET的比例已经达到稳定的基线适用通过准确地移液入菜/腔室所需的化合物。具有药理化合物处理细胞，而不是简单的移液灌注系统可以使用在这个阶段。
- 在实验完成后，保存时间的推移堆栈的图像。删除从显微镜和测量室，清洁使用目标组织的目标。
- 返回到步骤4.3重复测量与新的样本。
5。离线数据分析
共振成像数据可以进行离线分析实验后，在任何时候使用ImageJ软件。作为此协议的补充，我们提供的的“FREToffline”插件，在我们的实验室获得的图像分割成供体和受体通道，并测量荧光强度在多个地区的利益。这些强度可以进一步复制粘贴到Excel或地电子表格，计算修正后的FRET比率。可视化的FRET单分子生物传感器的变化，简单谱仪经常被使用。在这种情况下，唯一的供体荧光团（CFP），被激发，并且采取两个图像在CFP和YFP的发射峰。计算出的比率YFP / CFP（有时也简称为FRET / CFP比）表示的两个荧光团之间的FRET的程度。在单分子的生物传感器，CFP和YFP部分的数目是相等的，因此，简单的能谱仪是足够cient来表示的荧光共振能量转移效率12。
- 使用ImageJ软件打开实验文件，选择“插件>微管理”>“打开”微管理文件。
- 运行“FREToffline的”插电式，其中拆分成单个的CFP和YFP通道的时间推移的堆栈。
- 如果背景校正是必需的，这可以使用ImageJ软件进行。
- 点击的YFP堆栈的图像，并选择一个或几个区域使用的“写意选择”工具的兴趣，并把它们添加到“MultiMeasure”插件窗口中按“添加”按钮。
- 选择该地区的利益在“MultiMeasure”的窗口，然后按“多”，获得一个表的每一帧，每个区域的平均灰度值。将数据复制到剪贴板中选择使用Ctrl + A，按Ctrl + C通过按Ctrl + V，打开Excel或地电子表格，并粘贴数据
由程序执行的测量可以被配置在分析>集M的easurements，在这里你可以定义要测量的参数。我们通常只选择“平均灰度值”在此对话框中。 - 点击进入CFP堆栈的图像。执行5.5中所描述的相同。 CFP强度数据粘贴到同一个Excel在地电子表格中。
- 使用Excel或Origin软件，计算修正后的FRET比率。当简单的单链单分子生物传感器的成像，我们修正的供体荧光只为bleedthrough的进入受体通道。在这种情况下，校正后的受主/施主比是：
比率=（YFP - B X CFP）/ CFP
其中，B是可以通过与CFP质粒转染细胞，和测量中的，YFP的信道（B = YFP / CFP），供体荧光的百分比确定的校正因子。省略此单分子生物传感器的校正是可能的，因为它只会影响整体的振幅的FRET的响应没有任何定性的影响的曲线的形状。
图1示出了一个例子的完全组装FRET成像设置由尼康倒置显微镜，CoolLED，DV2的双屏显示和滨松ORCA-03G CCD照相机。要建立的硬件组件和计算机之间的通信，在I / O Arduino板被连接到计算机，并连接到CoolLED如在图2中所示。要控制光源的相机和图像采集同步方式，微Manager软件必须安装并正确配置（参见图3）。这个免费软件可以很容易地适应各个实验需要添加必要的插件。 图4A显示了具有代表性的原始FRET比率从测量使用的cAMP传感器Epac1营13在293A细胞中表达的跟踪监测β-肾上腺素能激动剂的影响异丙肾上腺素适用于时间点150秒，＆打赌;-受体阻滞剂普萘洛尔在时间点300秒（进行4.3-4.10中描述的）加入。可以分析这些数据脱机并校正到YFP通道所描述的CFP bleedthrough在5.1-5.7，得到校正后的FRET比迹线示于图4B。这代表实验表明在监测的荧光共振能量转移后，异丙肾上腺素治疗的比例，这表明细胞内cAMP增加缓慢下降。普萘洛尔作为β-受体阻滞剂异丙肾上腺素信号反转，导致cAMP的基础水平减少。 FRET信号可以在线监视期间的所有实验（如4.9中所述）中的这些变化。可以进行这样的实验，用各种常用的生物传感器设计为监视不同的第二信使或生化过程。
图1。布局的共振成像设置由一个CoolLED，尼康显微镜，DV2双屏幕显示转换后，ORCA-03G CCD相机。
图2。Arduino的I / O电路板和它的连接。该板被定位在一个自安装的塑料盒。一个标准的BNC电缆连接的LED的引脚8和电路板的GND（0）。
图3。截图展示集成的系统组件使用的硬件配置向导。A）启动硬件配置向导“。B）添加所需的设备中提到的2.3。 点击这里查看大图 。
图4。代表FRET实验技术T的措施，cAMP水平在293A细胞转染与Epac1营。首先，刺激细胞的β-肾上腺素能激动剂异丙肾上腺素（100nM的，在第30帧，或在150秒），以增加cAMP（YFP / CFP中减少观察到FRET比）。细胞，随后用β-受体阻滞剂心得安（10μM，60帧或300秒），从而导致一个的FRET比增加，减少环磷酸腺苷A）原在线FRET比率从一个地区的利益相应的痕迹在实验过程中监测到一个单细胞。B）修正后比跟踪进行离线数据分析中所描述5.1-5.7。
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Discussion
在该协议中，我们演示了如何构建一个简单的低成本但功能强大的共振成像系统可用的生物传感器具有多种常规应用。这里介绍的系统被设计为CFP和YFP，或类似类型的荧光蛋白，作为供体 - 受体对。与此同时，以及其他个人的生物传感器成为可用的，使用例如绿色和红色荧光蛋白14。为了适应所描述的系统为其他颜色，应选择适当的光源和/或过滤套。在LED，另一个单个LED的行的情况下，例如490纳米激发可以使用绿色荧光蛋白。单波长的LED可以很容易地在几秒钟内拆卸和交换。另外，还有一些LED阵列可包含几行激发各种荧光蛋白（ 例如 PE-2 CoolLED）。要启用测量FRET对的替代，以及其他的荧光滤光器的多维数据集可放置到力显微镜氧化聚乙烯，和最终分束器的发射过滤器应被交换。配光提供了额外的排放过滤器滑块DV2 DualView的。一些最近开发的应用程序同时使用两个或更多的生物传感器监视多个进程在同一时间，例如的cAMP和cGMP在一个小区15一起。在这种情况下，一个QuadView显示（配光），可以使用含有4个发射通道，ImageJ的插件在影像分裂和分析可以然后适于要使用四个信道和来计算两个FRET比率。 ImageJ软件是非常灵活的图像分析和在线代表性成果。简单的文本编辑插件允许任何单独的成像系统和实验的需要，适应的软件算法。这有时是非常有用的技术问题，这需要很长的时间，当他们要实施任何商业软件包，并提供快速的解决方案。
内容“>做FRET实验时，至关重要的是，以避免光漂白时，会出现的激励时间太长或图像时，过于频繁地采取。在这种情况下，一个光子诱导化学损伤或荧光基团的共价修饰，可能会出现与降低FRET效率，为了避免光漂白，一个可以减少的曝光时间和图像采集的频率，也有建立协议12,16纠正这种现象，在数据分析，它是能够校正之间的串扰供体和受体的通道（bleedthrough），当使用单分子FRET简单的比例测量的生物传感器（在这种情况下，供体和受体荧光团总是表示在同一水平的），它可以是足够的纠正只是bleedthrough的供体到受体信道，或什至完全省略此校正，因为它不定性影响FRET比率曲线的形状。bleedthrough的日Ë受体的捐助通道通常是可以忽略不计。当使用两种不同的蛋白质所组成的双分子的生物传感器，这些可表达在不同的水平。在这种情况下，bleedthrough校正和直接YFP由440纳米的光激发一个额外的校正也是可取的。请参阅发布的协议12，在那里所有的校正程序的更详细描述的。其它综合信息，生物传感器的发展，FRET显微镜的技术和有关数据分析，可能存在的缺陷是在先前公布的协议，17日至18日 。总之，这里所描述的简单而强大的成像系统提供了一个灵活的平台，以监测各种的生化事件和信号分子在活细胞中的高时空分辨率。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
作者要感谢安科Rüttgeroth和卡琳娜齐默尔曼的技术援助。这项工作得到了德意志研究联合会（授予NI 1301/1-1 VON）和德国哥廷根大学医学中心（“富利”授予VON）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BES Buffer Grade | AppliChem | A1062 | |
| CaCl2 dihydrate | Sigma-Aldrich | C5010 | |
| Glass coverslides | Thermo Scientific | 004710781 | Diameter 24 mm |
| Glass-bottomed cell-culture dishes | World Precision Instruments | FD3510-100 | |
| D-MEM medium | Biochrom AG | F0445 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Thermo Scientific | SH30073.02 | |
| L-Glutamine | Biochrom AG | K0283 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| MgCl2 hexahydrate | AppliChem | A4425 | |
| NaCl | AppliChem | A1149 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S9707 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom AG | A2213 | |
| Inverted fluorescent microscope | e.g. Nikon | Request at Nikon | |
| CoolLED | CoolLED | pE-100 | 440 nm |
| DualView | Photometrics | DV2-SYS | |
| DualView filter slider | Photometrics | 05-EM | |
| CFP/YFP filter set | Chroma Technology | 49052 | without the emission filter |
| ORCA-03G camera | Hamamatsu Photonics | C8484-03G02 | |
| Arduino I/O board | Sparkfun Electronics | DEV-00666 | |
| Attofluor cell chamber | Invitrogen | A-7816 | |
| Personal computer with WindowsXP or Windows7 system | Any supplier | Include hard-drive with high capacity |
References
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