Summary
העברת אנרגית פורסטר תהודה (סריג) מיקרוסקופית היא טכניקה רבה עצמה לניטור בזמן אמת של אירועי איתות בתאים חיים באמצעות חיישנים ביולוגיים שונים כעיתונאים. כאן אנו מתארים כיצד לבנות epifluorescence אישית סריג מערכת הדמיה ממרכיבים מסחריים זמינים וכיצד להשתמש בו לניסויי סריג.
Abstract
העברת אנרגית פורסטר תהודה (סריג) מיקרוסקופיה ממשיכה לצבור עניין גובר כטכניקה לניטור בזמן אמת של אירועים ביוכימיים ואיתות בתאים ורקמות חיות. בהשוואה לשיטות קלסיות ביוכימיים, טכנולוגיה חדשנית זו מתאפיינת ברזולוציה של זמן ומרחב גבוהה. סריג ניסויים להשתמש biosensors השונה גנטי מקודד אשר יכול לבוא לידי ביטוי, וצלם לאורך הזמן באתר או בvivo 1-2. biosensors הטיפוסי יכול לדווח על אינטראקציות בין חלבונים על ידי מדידת הסריג בין זוג fluorophore מתויג-של חלבונים או שינויים קונפורמציה בחלבון יחיד שמטפחים תורם וfluorophores acceptor מקושר עם מחצית מחייבת למולקולה של עניין 3-4. biosensors bimolecular לאינטראקציות בין חלבונים כולל, למשל, בונה נועד לפקח הפעלת G-חלבון בתאים 5, בעוד חיישני unimolecular meaשינויים קונפורמציה Suring נמצאים בשימוש נרחב לשליחים שניים תמונה כגון סידן 6, 7-8 מחנה, פוספטים אינוסיטול 9 ו cGMP 10-11. כאן אנו מתארים כיצד לבנות epifluorescence אישית סריג מערכת הדמיה ממרכיבים זמינים מסחרי בודדים ואיך לשלוט בכל ההתקנה באמצעות מנהל freeware-מייקרו. מכשיר פשוט אך רב עצמה זו נועד למדידות שגרתיות או מתוחכמות יותר סריג בתאים חיים. תמונות נרכשות מעובדות באמצעות תוספות עצמיות כתובות לדמיין שינויים ביחס סריג בזמן האמת במהלך כל ניסויים לפני שמאוחסן בתבנית גרפית תואם עם build-בfreeware ImageJ משמש לניתוח נתונים שלאחר מכן. עלות מערכת נמוכה זה מאופיין בגמישות גבוהה וניתן להשתמש בו בהצלחה לניטור אירועים ביוכימיים שונים ומולקולות איתות על ידי שפע של סריג biosensors זמין בתאים ורקמות חיות. כדוגמה, אנחנו מדגימים hאוו לשימוש במערכת הדמיה זה כדי לבצע ניטור בזמן אמת של cAMP בתאי 293A חיים על גירוי עם אגוניסט וחסמי רצפטור β-adrenergic.
Protocol
1. הגדרת סריג מיקרוסקופ הדמיה
בעיקרון, כל מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך אשר זמין במעבדה ויש לו יציאת מצלמה יכול להיות מותאם לסריג הדמיה. ההגדרה האחרונה צריכה לכלול את המרכיבים הבאים החשובים: מיקרוסקופ, מקור אור, עם או בלי תריס נוסף, קורה מפצל לאור פליטה וCCD-מצלמה (ראה איור 1). התקני החומרה, ובמיוחד את מקור האור, הצמצם והמצלמה משולבים ונשלטים על ידי תוכנת ההדמיה המאפשרת רכישה של תמונה וניתוח. להלן תיאור הליך להרכיב מערכת פשוטה סריג מהמרכיבים זמינים מסחרי.
- להתחבר למקור האור שלך למיקרוסקופ. לדוגמה, השתמש בדיודה אחת גל פולטות אור (CoolLED p E-100, 440 ננומטר), אשר באופן סלקטיבי מרגשת את החלבון משופר ציאן ניאון (CFP) המשמש כתורם ברוב סריג biosensors. זה יכול להיות ישירly ולחבר בקלות לנמל תאורת epifluorescence של המיקרוסקופ. ישנם גם נוריות זמינות רבות גל שיכול להיות מחוברת באופן דומה. במקום מקורות LED, אור הסטנדרטי אחרים כגון מנורת XBO75 קסנון קשת (המשמש לעתים קרובות למיקרוסקופי אולימפוס וZeiss) או HBO כספית מנורה (בדרך כלל מותקן על מיקרוסקופי ניקון) יכול להיות בשימוש. במקרה של מנורת ניאון, אתה צריך גם להציב תריס בין המנורה ויציאת תאורה כדי לאפשר שליטה בסיוע תוכנה של אור העירור מגיע אליך לדוגמא. CoolLED אינו דורש כל תריס נוסף מאחר שניתן להדליק ולכבות באופן ישיר על ידי התוכנה. החסרון של מערכות LED יחיד הצבע הוא מספר מצומצם של אורכי גל עירור, בעוד מנורת ניאון עם סטי סינון שונים היא אופציה גמישה יותר, במיוחד כשעובד עם biosensors המרובה וbimolecular. לחלופין, מקורות אור monochromator (למשל הצבעוני V, TILLPhotonics) יכולים להיותהשתמשתי, הם בדרך כלל יש תריס משולב אשר יכול להיות תוכנה נשלטת באמצעות אותות-הדק.
- הנח קוביית מסנן מתאימה למיקרוסקופ. לשגרת מדידות סריג עם CFP וחלבון פלואורסצנטי צהוב משופר (YFP) או כל אחת מהגרסות שלהם כזוג לכעוס, אנו משתמשים בקוביית מסנן פשוט המכילה מסנן עירור ET436/30M (שיכול להיות מושמט כאשר LED משמש, אבל הכרחי בעת שימוש במנורת קסנון או כספית ולא LED) ומראה Dichroic DCLP455. מיקרוסקופ גם צריך להיות מצויד במטרה מתאימה למיקרוסקופ פלואורסצנטי טוב ברזולוציה, למשל עם תכנית-פלואוריד, תכנית-neofluar או תכנית apochromat-40X, אובייקטיבי 60x או 100x נפט טבילה.
- תדליק את אור הניאון ולבדוק אם נקודת האור מופצת באופן שווה על פני שדה הראייה. אם זה לא המקרה, יישור נוסף של ה-LED או המנורה נדרש כדי להשיג את התאורה האופטימלית של הדגימה. זה יכול להיות ביצועיםרפואה באמצעות ברגים שעמדת דיודה או המנורה בחלל.
- חבר את קורה ספליטר באמצעות C-Mount לאחת מיציאות הפליטה של מיקרוסקופ. לדוגמה, השתמש dv2 DualView (Photometrics) שמפצל את אור הפליטה לשני ערוצים (תורם וacceptor) אשר יכול להיות פיקוח במקביל על שבב CCD מצלמה אחת. לחלופין, יש מוצרים דומים אחרים כמו Optosplit (גלעד מחקר) או במפצל אלומה משולב המצלמה כפולת אורך גל ORCA-D2 Hamamatsu. לCFP / YFP זוג לכעוס, אנו משתמשים 05-EM לסנן להגדיר המכיל 505dcxr Dichroic ראי תוספת ET480/30M ומסנני פליטת ET535/40M לCFP וYFP, בהתאמה, המסופק עם dv2. במקום קורה ספליטר, שתי קוביות סינון עבור התורם (המכיל מסנן עירור ET436/30M לCFP, מראת Dichroic DCLP455 וCFP פליטת המסנן) וacceptor (המכיל מסנן עירור CFP, DCLP455 וYFP פליטת המסנן) ערוצים משמשיםרבי סריג מערכות. לחלופין, קוביית מסנן אחד ללא כל סינון פליטה ומיקום גלגל מסנן אוטומטי פליטה לפני המצלמה יכולה להיות מותקנת. במקרה זה, מיקרוסקופ ממונע או ממלאי הגלגל לסנן בין שתי עמדות סינון הפליטה בתוך ~ 200-300 אלפיות לבצע הדמית ratiometric. עיכוב קטין זה מקובל כאשר הדמיה ולא להאט תהליכים תאיים, כגון אותות מחנה, שבו באמת רכישה סימולטנית של שני הערוצים היא לא קריטית.
- חבר את מצלמת CCD (שימוש לדוגמא ORCA-03G או ORCA-R2 מHamamatsu Photonics) למפצל הקרן. השתמש בכבל FireWire לחיבור המצלמה למחשב ממשק IEEE1394, כפי שמתואר במדריך שמסופק עם המצלמה. התקנת מנהלי מצלמה בלי להדליק את המצלמה.
- לבסוף, כדי להקים את התקשורת בין המחשב ומקור האור, להתחבר Arduino לוח הקלט / פלט (למשל להשתמש Arduino Duemilanove או Arduino אונו) לLED או לאo התריס באמצעות כבל BNC שאמור להכיל תקע BNC רגיל בצד LED ושני חוטים בודדים בקצה השני הקשור לפיני GND (0) ו 8 של הלוח כפי שמוצג באיור 2. הלוח המורכב יכול להיות מחובר ישירות ליציאת ה-USB של המחשב.
2. הגדרת תוכנת ההדמיה
כדי לשלוט ולסנכרן את מקור האור עם לכידת תמונה על ידי המצלמה, תוכנת הדמיה צריכה להיות מותקנת במחשב. ישנן מספר חבילות תוכנה מסחרית שכוללים MetaFluor (התקנים מולקולריים), Slidebook (Intelligent חידושי Imaging), VisiView (מערכות Visitron). כאן אנו מדגימים את שימוש freeware-מנהל מייקר הקוד פתוח המציע רמה גבוהה של גמישות עבור הדמיה בעלות נמוכה.
- הורד את התוכנה בhttp://valelab.ucsf.edu/ ~ MM / MMwiki / אינדקס.PHP / Micro-Manager_Version_Archive. אנו ממליצים להתקין את 1.4.5 שחרור שניתן להגדרה בקלות בידות שלנו.
- חבור את לוח Arduino ליציאת ה-USB של המחשב. הורד את התוכנה לשליטת Arduino הלוח מhttp://www.arduino.cc/en/Main/software. בצע את ההוראות שנמצאו באתר זה ולהפעיל תוכנה זו רק פעם אחת לפני תחילת מייקרו מנהל. העלה קוד לשימוש בלוח עם תוכנת Micro-Manager. הקוד ניתן להוריד בhttp://valelab.ucsf.edu/ ~ MM / MMwiki / index.php / Arduino.
- הפעל את הנורית והמצלמה. הפעל את התוכנה ולהגדיר תקשורת, מנהל מייקרו עם המצלמה ונורית (מקור אור אחר ותריס) על ידי בחירת כלים> חומרת אשף תצורה (ראה איור 3). הוסף את הרכיבים הדרושים, כולל המצלמה שלך(כלומר Hamamatsu_ DCAM) וArduino Board (להוסיף Arduino-Switch, Arduino-Hub ומכשירי Arduino-Shutter). במהלך השלבים הבאים, להשתמש בהגדרות ברירת המחדל שהוצעו על ידי האשף. לשמור את תצורת המערכת החדשה כאשר יתבקשו על ידי האשף.
- השתמש בתפריט הראשי כדי לפתוח כלים> דפדפן נכס התקנים. גלול מטה אל "מדינת חלף Arduino" ובחר באפשרות "1". סגור את הדו השיח. ודא כי "התריס אוטומטי" התיבה מסומנת בשיח התוכנה הראשית. לחץ קובץ> שמירת מצב מערכת כדי לשמור את תצורת התוכנה שאמורה להיות פתוחות בכל עת לאחר הפעלת התוכנה. זה יקבע את התקשורת בין הלוח ואת התוכנה הדרושה כדי לבצע רכישה של תמונה.
- לחץ על כפתור "חי" כדי לפקח על האות שמגיעה מהמצלמה. ודא שאור ניאון ממשיך כל עת "חי" או פונקציה "צמד" נבחרה. לפני שתתחיל את המדידות הראשונות, בצע את ההוראות שסופקו עם מפצל הקורה שלך לכליוצר יישור האופטי של שני הערוצים.
3. תא תרבות וtransfections
- הכן את הצלחות 6 היטב עם 24 coverslides autoclaved העגול מ"מ זכוכית (coverslide 1 לטוב). לחלופין, מנות עם רצפת זכוכית תא תרבות ניתן להשתמש.
- צלחת 293A תאים לצלחות או הצלחות במדיום D-MEM (בתוספת 10% FCS, 1% L-גלוטמין ו 1% פתרון פניצילין / סטרפטומיצין), כך שהתאים מגיעים 50-70% confluency לאחר יום אחד.
- 24 שעות לאחר ציפוי, transfect התאים בזרימה למינרית ספסל עם חיישן סריג פלסמיד באמצעות שיטת transfection סידן זרח (ראה 3.5). פלסמידים biosensor cAMP ניתן לקבל מהקבוצה שלנו על פי דרישה. הקורא הוא גם התייחס לביקורות המקיפות 7,8 מתארות biosensors cAMP הזמין אחר.
- לפני transfecting תאים בפעם הראשונה, להכין ריאגנטים transfection. איפור 2.5 מ 'CaCl 2 ופתרוני 2xBBS (האחרון המכיל1.5 המ"מ Na 2 HPO 4, 50 BES המ"מ, 280 המ"מ NaCl, להתאים ל-pH 6.95 עם NaOH) במי deionized. סטרילי תסנין את הפתרונים באמצעות מסנן 0.2 מיקרומטר רגיל.
- 10 מיקרוגרם לtransfect צלחת 6-טובה או 6 מנות עם רצפת זכוכית, לערבב סריג של החיישן, 50 μl פלסמיד של 2 פתרון 2.5M CaCl ומים סטריליים עד 500 μl. מערבב היטב.
- הוסף 500 μl של BBS 2x. מערבב היטב ודגירה את התערובת במשך 10 דקות בטמפרטורת חדר.
- 165 μl פיפטה של תערובת transfection dropwise על כל באר או מאכל. בעדינות מערבב את הצלחת והחזירה אותו לחממה. תאים הם בדרך כלל מוכנים למדידות סריג 24 שעות לאחר transfection. ודא שתאים לא הגיעו confluency בנקודה זו, שכן דבר עלול להשפיע על הפעילות של כמה קולטנים על פני קרום תא.
4. סריג מדידות בתאים חיים
- לפני המדידה בפעם הראשונה, להכין את חיץ סריג המכיל 144 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1mM MgCl 2, 2 המ"מ CaCl 2, 10 מ"מ HEPES במי deionized וכוון את ה-pH ל 7.3 עם NaOH. לדלל את התרכובות כדי לשמש בניסויי ההדמיה שלך עם חיץ סריג.
- הפעל את תוכנת ההדמיה. טען תצורת מערכת הוגדרה בעבר. בחר> מצב מערכת טעינת קובץ כדי לבחור את מצב המערכת שהוגדר בעבר.
- הר coverslide עם תאי 293A transfected חסיד בהדמיה הקאמרית (קאמרי תא Attofluor למשל). לשטוף את תאי פעם אחת עם סריג חיץ ולהוסיף 400 μl של סריג חיץ. בעת השימוש בכלים עם רצפת זכוכית תא התרבות לשטוף את התאים החסידים ולהוסיף 2 מ"ל של החיץ למנה. אנו מבצעים את כל המדידות בטמפרטורת חדר במאגר הסריג המכיל HEPES, כך שהמס '2 שליטת CO הוא הכרחית.
- שים קצת שמן טבילה על המטרה ולהעביר את חדר הדמיה על מיקרוסקופ. התמקד בשכבת התאים באמצעות אור קוף.
- הפעל את lig הניאוןHT ידי לחיצה על הכפתור "החי", ובחר תא לצורך הניסוי. בחר תא עם חיישן ביטוי אופטימלי, כלומר, זה צריך להיות לא בהיר מדי ולא חלש מדי. לאחר מציאת תא מתאים, כבה את אור ניאון אופן מיידי כדי למנוע photobleaching של חיישן סריג.
- התאם את זמן החשיפה תחת "הגדרות המצלמה" (בדרך כלל 10-50 אלפיות) בדרך שמובילה ליחס אות לרעש טוב של התמונה נרכשה לאחר הלחיצה על הכפתור "הצמד". זמני עירור ארוכים מדי עלולים לגרום לphotobleaching, בעוד שזמנים קצרים מדי באיכות תמונה נמוכה.
- לחץ על "ACQ Multi-D". כפתור ולהגדיר את מספר נקודתי זמן ואת מרווח הזמן לרכישת תמונה. לחיישן שלנו cAMP-הסריג, אנו רוכשים תמונה אחת כל 5 שניות.
- התחל את המדידות על ידי לחיצה על הכפתור "רכישה".
- במהלך כל מדידה, ניתן להשתמש בשוטר "לדאוג מקוונים" תוספת (זמין במוסף באינטרנט, כל התוספות חייבות להיותמטען לתיקייה "plugins" של תוכנת מנהל מייקרו לפני שאתם מתחילים אותה) לפקח על סריג היחס משתנה באופן מקוון. הפעלת תוסף זה ובחר אזור של עניין בתמונת יחס סריג שימוש באפשרות "בחירת תוכנות עיבוד". הוסף את האזור למנהל ROI ולחץ על הכפתור "קבל הממוצע" בחלון "זמן סדרת המנתח". סריג עקבות יחס יוצג. כדי לעדכן את העקבות בזמן המדידה, יש להפעיל את "FRETratioOnline2" תוספת ולחץ על הכפתור "GetAverage".
- ברגע שהגיע לסריג יחס בסיס יציב להחיל את המתחם הרצוי על ידי pipetting אותו במדויק למנה / הקאמרית. כדי לטפל בתאים עם תרכובות תרופתיות, מערכת זלוף במקום pipetting הפשוט יכולה לשמש בשלב זה.
- לאחר שסיים את הניסוי, שמור את מחסנית זמן לשגות של תמונות. הסר את תא המדידה ממיקרוסקופ ולנקות את מטרת שימוש ברקמות מטרה.
- חזור לשלב 4.3 לחזור על המדידה עםמדגם חדש.
5. ניתוח נתונים לא מקוון
סריג נתוני הדמיה ניתן לנתח מחובר בכל עת לאחר הניסוי באמצעות תוכנת ImageJ. כתוספת לפרוטוקול זה, אנו מספקים את תוספת "FREToffline" שימוש במעבדה שלנו לפצל את התמונות שנרכשו לאפיקים תורמים וacceptor ולמדוד עוצמות ניאון באזורים שונים של עניין. עוצמות אלה נוספות יכולות להיות העתקה להדביק גיליון אלקטרוני של Excel או מקור כדי לחשב את היחס תקן סריג. כדי להמחיש את השינויים של סריג biosensors unimolecular, ratiometry פשוט משמש לעתים קרובות. במקרה זה, רק fluorophore התורם (CFP) הוא נרגש, ושתי תמונות שצולמו בפסגות פליטת CFP וYFP. יחס YFP / CFP מחושב (לעתים מכונה גם יחס סריג / CFP) מייצג את מידת הסריג בין שני fluorophores. בbiosensors unimolecular, את המספרים של moieties YFP CFP ושווים, כך שratiometry הפשוט הוא sufficient לייצג סריג יעילות 12.
- השתמש בתוכנת ImageJ כדי לפתוח את הקובץ על ידי בחירת הניסוי> Micro-מנהל קבצים> פתחו מייקר מנהל תוספים.
- הפעל את התוסף "FREToffline" שמפצל את מחסנית זמן לשגות בCFP פרט וערוצי YFP.
- אם תיקון רקע דרוש, זה יכול להתבצע באמצעות תוכנות ImageJ.
- לחץ על מחסנית YFP של תמונות ולבחור באחת או בכמה אזורים של עניין שימוש באפשרות "בחירת תוכנות עיבוד" ולהוסיף אותם ל" MultiMeasure "תוספת חלון על ידי לחיצה על הכפתור" הוסף ".
- בחר את האזורים של אינטרסים בחלון "MultiMeasure" ולחץ על "רב" כדי להשיג שולחן עם ערכים אפורים מתכוונים לכל מסגרת ולכל אזור. העתק את הנתונים ללוח על ידי בחירה כל באמצעות Ctrl + ועל ידי לחיצה על Ctrl + C. פתח גיליון אלקטרוני של Excel או מקור ולהדביק את הנתונים על ידי לחיצה על Ctrl + V.
המדידות שבוצעו על ידי התכנית יכולות להיות מוגדרות על פי ניתוח> הסט M easurements בו אתה יכול להגדיר את הפרמטרים כדי להימדד. בדרך כלל אנחנו בוחרים רק "Mean ערך אפור" בשיח הזה. - לחץ על מחסנית CFP של תמונות. לבצע את אותו כפי שמתואר ב5.5. הדבק את נתוני עצמת CFP לאותו גיליון אלקטרוני Excel או מקור.
- באמצעות Excel או תוכנת מקור, לחשב את היחס תקן סריג. כאשר biosensors unimolecular אחת שרשרת פשוט הם צלמו, אנחנו מתקנים רק לbleedthrough של קרינת התורם לערוץ acceptor. במקרה זה, היחס תקן acceptor / תורם הוא:
יחס = (YFP - B x CFP) / CFP
איפה B הוא גורם התיקון שניתן לקבוע על ידי transfecting תאים עם CFP פלסמיד ומדידת אחוז של קרינת התורם בYFP הערוץ (B = YFP / CFP). השמטת תיקון זה לbiosensors unimolecular היא אפשרית, שכן הוא ישפיע על המשרעת הכוללת של תגובת סריג רק בלי כל השפעה איכותית על הצורה של העקומה.
איור 1 מציג דוגמה להתאסף מלא סריג התקנת הדמיה המורכבת של מיקרוסקופ ניקון ההפוך, CoolLED, dv2 DualView ומצלמת CCD Hamamatsu ORCA-03G. כדי לבסס את התקשורת בין רכיבי החומרה והמחשוב, הקלט / פלט Arduino הלוח מחובר למחשב וכלCoolLED מוצג באיור 2. כדי לשלוט במקור ותמונת לכידת האור על ידי המצלמה בצורה מסונכרנת, תוכנת מייקר מנהל צריכה להיות מותקנת ומוגדר כהלכה (ראה איור 3). freeware זה ניתן להתאים בקלות לצרכי ניסוי נפרדים על ידי הוספת תוספות הכרחיות. איור 4A מראה גלם נציג סריג עקבות יחס ממדידה באמצעות חיישן cAMP Epac1 מחנות 13 ביטוי בתאי 293A לנטר את ההשפעות של אגוניסט β-adrenergic isoproterenol מיושם בנקודת זמן 150 שניות ו& מתערב; בחוסמי propranolol הוסיפו בנקודת זמן 300 שניות (בוצע כפי שתואר ב4.3-4.10). נתונים אלו יכולים להיות מנותחים ותקנו מחוברים לbleedthrough של CFP לתוך תעלת YFP כמתואר ב5.1-5.7 להשיג תקן סריג עקבות יחס שמוצגות באיור 4 ב. ניסוי נציג זה מראה ירידה איטית בשיעור מעקב סריג על טיפול isoproterenol המצביע על עלייה של cAMP תוך התאי. Propranolol כβ-חוסם הופך את אות isoproterenol, מה שמוביל לירידה בשיעור של cAMP לרמות בסיסיות. שינויים אלו בסריג אות יכול להיות במעקב מקוון במהלך כל ניסויים (כמתואר ב4.9). ניסויים כאלה יכולים להתבצע עם מגוון רחב של חיישנים ביולוגיים נפוצים נועדו לפקח שליחים שניים שונים או תהליכים ביוכימיים.
איור 1. פריסה של סריג התקנת הדמיה המורכבת מCoolLED, במיקרוסקופ verted ניקון, dv2 DualView, ומצלמת ORCA-03G-CCD.
איור 2. Arduino לוח קלט / פלט והחיבורים שלו. הלוח ממוקם בקופסא פלסטיק עצמי רכובה. כבל BNC סטנדרטי מתחבר הוביל לפיני 8 וההארקה (0) של המערכת.
איור 3. מסך מפגין שילוב בין מרכיבי המערכת באמצעות אשף תצורת חומרה.) להפעיל את אשף תצורת החומרה. ב ') הוסף את ההתקנים הנדרשים כאמור ב2.3. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 4. נציג סריג experiment אשר מודד רמות cAMP בתאי 293A transfected עם Epac1 מחנות. ראשית, תאים היו מגורה עם isoproterenol אגוניסט β-adrenergic (100 ננומטר, 30 במסגרת או ב 150 שניות) כדי להגדיל את המחנה (נצפה ירידה בYFP / CFP סריג יחס). תאים טופלו לאחר מכן עם β-חוסם propranolol (10 מיקרומטר, במסגרת 60 או ב 300 שניות) שמוביל לעלייה של יחס סריג, המשקף ירידה במחנה. מקוון) Raw סריג עקבות יחס מאזור אחד של ריבית המתאימה לתא בודד במעקב במהלך הניסוי. ב ') תיקון עקבות יחס לאחר ניתוח נתונים מחובר בוצע כפי שתואר ב5.1-5.7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בפרוטוקול זה, אנו מדגימים כיצד לבנות מערכה בעלות נמוכה אבל חזקה סריג פשוטה ליישומי הדמיה שיגרתי עם מגוון רחב של חיישנים ביולוגיים זמינים. המערכת שהוצגה כאן מיועדת לCFP וYFP, או סוגים דומים של חלבוני ניאון, כזוג-acceptor התורם. בינתיים, biosensors הבודד האחר שיהיו זמין להשתמש למשל חלבוני ניאון ירוקים ואדומים 14. כדי להתאים את המערכת המתוארת לצבעים אחרים, במקורות מתאימים אור ו / או מערכות סינון צריכים להיות נבחרים. במקרה של נורית, עוד שורה האחת LED, למשל 490 ננומטר כדי להלהיב חלבון פלואורסצנטי ירוק יכול לשמש. נוריות בודדות אורך גל יכולות להיות בקלות (תוך שניות) ירד והחליף. לחלופין, יש מערכים זמינים LED שכוללים מספר קווים לרגש חלבוני ניאון שונים (למשל PE-2 CoolLED). כדי לאפשר מדידות עם סריג חלופת זוגות, קוביות סינון ניאון אחרות ניתן להציב לתוך microsc אופ, וסופו של דבר את מסנני פליטת קורה המפצל צריכים להיות מוחלפים. Photometrics מציע מחווני סינון פליטה נוספות לdv2 DualView. חלק מהיישומים שפותחו לאחרונה להשתמש בשתיים או יותר בו זמנית לפקח biosensors תהליכים מרובים באותו הזמן, למחנה דוגמה וcGMP יחד בתא אחד 15. במקרה זה, QuadView (Photometrics) המכיל ארבעה ערוצי פליטה יכולה לשמש, ImageJ תוסף עבור פיצול תמונה והניתוח ניתן אז מותאמים לשימוש עם ארבעה ערוצים ולחשב 2 סריג יחסים. ImageJ תוכנה היא מאוד גמישה במונחים של ניתוח תמונה וייצוג מקוון של התוצאות. תוספות טקסט פשוטות נערכו לאפשר הסתגלות של אלגוריתם תוכנה לצרכימים של כל מערכת הדמית פרט וניסוי. לפעמים זה מאוד מועיל ומציע פתרונות מהירים לבעיות הטכניות, שיכול דורשות זמנים ארוכים כאשר הם צריכים להיות מיושמים בכל חבילת תוכנה מסחרית.
תוכן "> כאשר עושים ניסויי סריג, זה הוא חיוני כדי למנוע photobleaching המופיע בעת זמני העירור ארוכים מדי או כאשר דימויי הלקוחים לעתים קרובות מדי. במקרה זה, ניזק כימי פוטון מושרה או שינויים קוולנטיים של fluorophores עלול להתרחש ו הסריג להקטין את היעילות. כדי למנוע photobleaching, אפשר לצמצם את זמן החשיפה ואת תדירות רכישה של תמונה. יש גם הוקם פרוטוקולים 12,16 לתקן לתופעה זו. במהלך ניתוח נתונים, ניתן לתקן את דיבור ההכלאה בין ערוצים תורמים וacceptor (bleedthrough). בעת השימוש unimolecular סריג biosensors (במקרה ותורם fluorophores acceptor תמיד באים לידי ביטוי באותה הרמה) למדידות ratiometric פשוטות, זה יכול להיות מספיק כדי לתקן רק בשביל bleedthrough של התורם לacceptor ערוץ או אפילו להשמיט תיקון זה לגמרי כי זה לא ישפיע באופן איכותי את הצורה של עקומת יחס סריג. bleedthrough של הacceptor דואר לערוץ התורם הוא בדרך כלל זניח. כאשר biosensors bimolecular המורכב משני חלבונים שונים נמצאים בשימוש, אלה עשויים לבוא לידי הביטוי ברמות שונות. במקרה זה, תיקון bleedthrough ותיקון נוסף לעירור YFP הישיר על ידי אור 440 ננומטר הם גם רצויים. אנא, עיין בפרוטוקול 12 פורסם בו כל הליכי התיקון מתוארים בפירוט רב יותר. מידע מקיף נוסף על הפיתוח של חיישנים ביולוגיים, סריג מיקרוסקופיה, מלכודות אפשריות של טכניקה ועל ניתוח הנתונים זמינות בפרוטוקולים 17-18 שפורסמו בעבר. לסיכום, מערכת ההדמיה הפשוטה ורב עצמה המתוארת כאן מספקת פלטפורמה גמישה לניטור אירועים ביוכימיים שונים ומולקולות איתות עם רזולוציה של זמן ומרחב גבוהה בתאים חיים.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות לאנקת רוטגרות' וקארינה צימרמן לסיוע טכני. עבודה זו נתמכה על ידי Forschungsgemeinschaft דויטשה (מענק NI 1301/1-1 לפון) ואוניברסיטת גטינגן במרכז רפואי ("פרו Futura" מענק לפון).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BES Buffer Grade | AppliChem | A1062 | |
| CaCl2 dihydrate | Sigma-Aldrich | C5010 | |
| Glass coverslides | Thermo Scientific | 004710781 | Diameter 24 mm |
| Glass-bottomed cell-culture dishes | World Precision Instruments | FD3510-100 | |
| D-MEM medium | Biochrom AG | F0445 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Thermo Scientific | SH30073.02 | |
| L-Glutamine | Biochrom AG | K0283 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| MgCl2 hexahydrate | AppliChem | A4425 | |
| NaCl | AppliChem | A1149 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S9707 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom AG | A2213 | |
| Inverted fluorescent microscope | e.g. Nikon | Request at Nikon | |
| CoolLED | CoolLED | pE-100 | 440 nm |
| DualView | Photometrics | DV2-SYS | |
| DualView filter slider | Photometrics | 05-EM | |
| CFP/YFP filter set | Chroma Technology | 49052 | without the emission filter |
| ORCA-03G camera | Hamamatsu Photonics | C8484-03G02 | |
| Arduino I/O board | Sparkfun Electronics | DEV-00666 | |
| Attofluor cell chamber | Invitrogen | A-7816 | |
| Personal computer with WindowsXP or Windows7 system | Any supplier | Include hard-drive with high capacity |
References
- Zaccolo, M. Use of chimeric fluorescent proteins and fluorescence resonance energy transfer to monitor cellular responses. Circ. Res. 94, 866-873 (2004).
- Mehta, S., Zhang, J. Reporting from the field: genetically encoded fluorescent reporters uncover signaling dynamics in living biological systems. Annu. Rev. Biochem. 80, 375-401 (2011).
- Zhang, J., Campbell, R. E., Ting, A. Y., Tsien, R. Y. Creating new fluorescent probes for cell biology. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3, 906-918 (2002).
- Miyawaki, A. Visualization of the spatial and temporal dynamics of intracellular signaling. Dev. Cell. 4, 295-305 (2003).
- Bunemann, M., Frank, M., Lohse, M. J. Gi protein activation in intact cells involves subunit rearrangement rather than dissociation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 16077-16082 (2003).
- Kotlikoff, M. I. Genetically encoded Ca2+ indicators: using genetics and molecular design to understand complex physiology. J. Physiol. 578, 55-67 (2007).
- Willoughby, D., Cooper, D. M. Live-cell imaging of cAMP dynamics. Nat. Methods. 5, 29-36 (2008).
- Nikolaev, V. O., Lohse, M. J. Monitoring of cAMP synthesis and degradation in living cells. Physiology (Bethesda). 21, 86-92 (2006).
- Tanimura, A. Use of Fluorescence Resonance Energy Transfer-based Biosensors for the Quantitative Analysis of Inositol 1,4,5-Trisphosphate Dynamics in Calcium Oscillations. J. Biol. Chem. 284, 8910-8917 (2009).
- Nikolaev, V. O., Lohse, M. J. Novel techniques for real-time monitoring of cGMP in living cells. Handb. Exp. Pharmacol. , 229-243 (2009).
- Nausch, L. W., Ledoux, J., Bonev, A. D., Nelson, M. T., Dostmann, W. R. Differential patterning of cGMP in vascular smooth muscle cells revealed by single GFP-linked biosensors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 365-370 (2008).
- Borner, S. FRET measurements of intracellular cAMP concentrations and cAMP analog permeability in intact cells. Nat. Protoc. 6, 427-438 (2011).
- Nikolaev, V. O., Bunemann, M., Hein, L., Hannawacker, A., Lohse, M. J. Novel single chain cAMP sensors for receptor-induced signal propagation. J. Biol. Chem. 279, 37215-37218 (2004).
- Hong, K. P., Spitzer, N. C., Nicol, X. Improved molecular toolkit for cAMP studies in live cells. BMC Res. Notes. 4, 241-24 (2011).
- Niino, Y., Hotta, K., Oka, K. Simultaneous live cell imaging using dual FRET sensors with a single excitation light. PLoS One. 4, e6036 (2009).
- Palmer, A. E., Tsien, R. Y. Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators. Nat. Protoc. 1, 1057-1065 (2006).
- Brumbaugh, J., Schleifenbaum, A., Stier, G., Sattler, M., Schultz, C. Single- and dual-parameter FRET kinase probes based on pleckstrin. Nat. Protoc. 1, 1044-1055 (2006).
- Aoki, K., Matsuda, M. Visualization of small GTPase activity with fluorescence resonance energy transfer-based biosensors. Nat. Protoc. 4, 1623-1631 (2009).
