Summary
Förster énergie de résonance de transfert (FRET) microscopie est une technique puissante pour surveiller en temps réel des événements de signalisation dans les cellules vivantes en utilisant différents biocapteurs en tant que journalistes. Ici, nous décrivons comment construire un épifluorescence personnalisée FRET système d'imagerie à partir de composants disponibles dans le commerce et la façon de l'utiliser pour des expériences de FRET.
Abstract
Förster énergie de résonance de transfert (FRET) microscopie continue de gagner un intérêt croissant en tant que technique de suivi en temps réel des événements biochimiques et de signalisation dans les cellules vivantes et les tissus. Par rapport aux méthodes classiques biochimiques, cette nouvelle technologie est caractérisée par la résolution temporelle et spatiale. Expériences de FRET utiliser différents génétiquement codés biocapteurs qui peuvent être exprimées et imagée au fil du temps in situ ou in vivo 1-2. Biocapteurs typiques peuvent signaler supporte interactions protéine-protéine par mesure de FRET entre une paire fluorophore marqué de protéines ou de changements conformationnels de la protéine unique qui abrite donneur et fluorophores accepteurs reliés entre eux par un groupement de liaison pour une molécule d'intérêt 3-4. Biocapteurs pour bimoléculaires interactions protéine-protéine, par exemple, construit conçu pour surveiller la protéine G d'activation dans les cellules 5, tandis que les capteurs unimoléculaires meaSuring changements conformationnels sont largement utilisés pour des messagers de la seconde image tels que le calcium 6, AMPc 7-8, inositol phosphates 9 et cGMP 10-11. Ici, nous décrivons comment construire un épifluorescence personnalisée FRET système d'imagerie à partir de simples composants disponibles dans le commerce et la façon de contrôler l'ensemble de l'installation en utilisant le logiciel gratuit Micro-Manager. Cet instrument simple mais puissant est conçu pour des mesures de routine ou plus sophistiquées FRET dans des cellules vivantes. Les images acquises sont traitées à l'aide d'auto-écrite plug-ins de visualiser les changements dans les taux de FRET en temps réel au cours des expériences avant d'être stockées dans un format graphique compatible avec le build-in freeware ImageJ utilisé pour l'analyse ultérieure des données. Ce système à faible coût se caractérise par une grande flexibilité et peut être utilisé avec succès pour contrôler divers événements biochimiques et des molécules de signalisation par une pléthore de biocapteurs disponibles FRET dans des cellules vivantes et des tissus. A titre d'exemple, nous démontrons homment utiliser ce système d'imagerie pour effectuer un suivi en temps réel de l'AMPc dans des cellules vivantes 293A lors de la stimulation avec un agoniste des récepteurs β-adrénergiques et bloqueur.
Protocol
1. Mise en place d'un FRET microscope d'imagerie
En principe, toute microscope à fluorescence inversé qui est disponible dans le laboratoire et dispose d'un port de l'appareil peut être adapté à l'imagerie FRET. La configuration finale devrait inclure les éléments suivants essentiels: un microscope, une source lumineuse avec ou sans obturation supplémentaire, un séparateur de faisceau pour l'émission de lumière et d'une caméra CCD (voir Figure 1). Les dispositifs de matériel, en particulier la source de lumière, l'obturateur et la caméra sont intégrés et contrôlés par le logiciel d'imagerie qui permet l'acquisition d'images et d'analyse. Ci-dessous nous décrivons une procédure pour assembler un simple système de FRET à partir de composants disponibles dans le commerce.
- Connectez votre source de lumière au microscope. Par exemple, utilisez une seule diode émettant de la lumière de longueur d'onde (p CoolLED E-100, 440 nm) qui excite sélectivement accrue protéine fluorescente cyan (CFP) utilisé comme donneur de FRET dans la plupart des biocapteurs. Elle peut être directement et facilement connecté au port éclairage à épifluorescence du microscope. Il existe aussi des longueurs d'onde multiples LED disponibles qui peuvent être reliés d'une manière similaire. Au lieu de LED, d'autres sources de lumière classiques tels que XBO75 xénon lampe à arc (souvent utilisé pour les microscopes Olympus et Zeiss) ou lampe au mercure HBO (généralement installé sur les microscopes Nikon) peuvent être utilisés. Dans le cas d'une lampe fluorescente, vous devrez aussi placer un obturateur entre la lampe et le port éclairage pour activer la commande assistée par logiciel de la lumière d'excitation arrivant sur l'échantillon. CoolLED ne nécessite pas d'obturation supplémentaire, car il peut être directement activé et désactivé par le logiciel. L'inconvénient des systèmes à LED monochromes ya un nombre limité de longueurs d'onde d'excitation, tandis qu'une lampe fluorescente avec divers ensembles de filtres est une option plus flexible, en particulier lorsque l'on travaille avec des biocapteurs multiples et bimoléculaire. Alternativement, les sources lumineuses (par exemple monochromateur Polychrome V, TILLPhotonics) peut êtreutilisés, ils ont généralement un volet intégré qui peut être contrôlé via logiciel un signal de déclenchement.
- Placer un cube de filtre approprié dans le microscope. Pour les contrôles de mesures de FRET avec la PCP et une meilleure protéine fluorescente jaune (YFP) ou un de leurs variants comme une paire FRET, nous utilisons un simple cube filtre contenant un filtre d'excitation ET436/30M (qui peut être omise lorsque la LED est utilisé, mais il est indispensable lors de l'utilisation d'une lampe au xénon ou au mercure au lieu de DEL) et un miroir dichroïque DCLP455. Le microscope doit également être équipé d'un objectif approprié pour une microscopie de fluorescence bonne résolution, par exemple avec un plan-fluor, Plan-Neofluar ou un plan-apochromatique 40x, 60x ou 100x huile immersion objectif.
- Allumez la lumière fluorescente et vérifier si la tache lumineuse est répartie uniformément dans tout le champ de vision. Si ce n'est pas le cas, un alignement supplémentaire de la diode ou de la lampe est nécessaire pour réaliser l'éclairage optimal de l'échantillon. Cela peut être performed en utilisant les vis qui positionnent la diode ou la lampe dans l'espace.
- Connecter le séparateur de faisceau par l'intermédiaire d'une monture C à l'un des ports d'émission du microscope. Par exemple, utilisez la DualView DV2 (Photométrie) qui divise la lumière en deux émissions (donneur et accepteur) canaux qui peuvent être surveillés simultanément sur une puce CCD caméra unique. Sinon, il ya d'autres produits comparables tels que Optosplit (Cairn de recherche) ou un séparateur de faisceau intégré au Hamamatsu ORCA-D2 à double longueur d'onde caméra. Pour le CFP / YFP paire FRET, nous utilisons la 05-EM filtrer mis contenant le 505dcxr miroir dichroïque, plus ET480/30M et filtres d'émission pour ET535/40M CFP et YFP, respectivement, ce qui est fourni avec le DV2. Au lieu d'un diviseur de faisceau, deux blocs de filtres pour le donneur (contenant le filtre d'excitation pour ET436/30M PCP, le miroir dichroïque et DCLP455 le filtre d'émission PCP) et accepteurs (PCP contenant le filtre d'excitation, et la YFP DCLP455 filtre d'émission) canaux sont utilisés ende nombreux systèmes de FRET. Alternativement, un cube de filtre sans filtre d'émission et une position d'émission automatique de la roue filtre avant de l'appareil peut être installé. Dans ce cas, un microscope motorisé ou les suppléants roue de filtre entre les deux positions d'émission filtre à l'intérieur ~ 200-300 ms pour effectuer l'imagerie ratiométrique. Ce léger retard est acceptable lorsque l'imagerie plutôt lent processus intracellulaires, comme les signaux AMPc, où l'acquisition véritablement simultanée des deux canaux n'est pas critique.
- Branchez la caméra CCD (utilisation par exemple ORCA-03G ou ORCA-R2 à partir de Hamamatsu Photonics) au séparateur de faisceau. Utilisez un câble FireWire pour connecter l'appareil photo à l'interface IEEE1394 ordinateur, comme décrit dans le manuel fourni avec l'appareil. Installez les pilotes de caméra sans allumer l'appareil photo.
- Enfin, pour établir la communication entre l'ordinateur et la source de lumière, connectez l'Arduino carte E / S (par exemple utiliser Arduino Duemilanove ou Uno Arduino) de la LED ou to l'obturateur à l'aide d'un câble BNC qui devrait contenir une simple prise de courant BNC LED sur le côté et deux fils simples sur l'autre extrémité reliée à l'GND (0) et 8 de la carte comme indiqué sur la figure 2. Le conseil assemblé peut être connecté directement à un port USB de votre ordinateur.
2. Mise en place du logiciel d'imagerie
Pour contrôler et synchroniser la source de lumière avec capture d'image par la caméra, un logiciel d'imagerie doit être installé sur l'ordinateur. Il existe plusieurs logiciels disponibles dans le commerce, y compris MetaFluor (Molecular Devices), Slidebook (imagerie intelligente Innovations), VisiView (Systèmes Visitron). Ici, nous démontrons l'utilisation de l'open-source Micro-Manager freeware qui offre un degré élevé de flexibilité à faible coût de l'imagerie.
- Télécharger ce logiciel à http://valelab.ucsf.edu/ ~ MM / MMwiki / index.php / Micro-Manager_Version_Archive. Nous vous recommandons d'installer la version 1.4.5 qui est facilement configurable dans nos mains.
- Connectez la carte Arduino à un port USB de votre ordinateur. Télécharger le logiciel pour contrôler la carte Arduino à partir http://www.arduino.cc/en/Main/software . Suivez les instructions qui se trouvent sur ce site et exécuter ce logiciel une seule fois avant le début du Micro-Manager. Téléchargez un code pour l'utilisation de la carte avec le logiciel Micro-Manager. Le code peut être téléchargé à l'adresse http://valelab.ucsf.edu/ ~ MM / MMwiki / index.php / Arduino .
- Allumez le LED et la caméra. Démarrez le logiciel et configurer Micro-Manager communication avec la caméra et LED (autre source de lumière et l'obturateur) en sélectionnant Outils> Assistant de configuration matérielle (voir figure 3). Ajoutez les composants requis, y compris votre appareil photo(C.-à Hamamatsu_ DCAM) et Arduino Conseil (ajouter Arduino-Switch, Hub Arduino Arduino et d'obturation des dispositifs). Au cours des prochaines étapes, utilisez les paramètres par défaut proposées par l'assistant. Enregistrer la nouvelle configuration lorsque vous y êtes invité par l'Assistant.
- Utilisez le menu principal pour ouvrir Outils> Navigateur propriété de périphériques. Descendez jusqu'à "Etat Commutateur Arduino" et sélectionner "1". Fermez la boîte de dialogue. Assurez-vous que l '«auto-obturation" case est cochée dans la boîte de dialogue principale du logiciel. Appuyez sur Fichier> Enregistrer l'état du système pour enregistrer la configuration du logiciel qui devrait être ouvert à tout moment après le démarrage du logiciel. Ceci permettra d'établir la communication entre le conseil et le logiciel nécessaires pour exécuter l'acquisition d'images.
- Appuyez sur "Live" pour contrôler le signal provenant de la caméra. Assurez-vous que la lumière fluorescente qui se passe tout le temps "en direct" ou "Snap" est sélectionnée. Avant de commencer les premières mesures, suivez les instructions fournies avec votre séparateur de faisceau pour parformer l'alignement optique de deux canaux.
3. Culture cellulaire et Transfections
- Préparer les plaques à 6 puits avec autoclave rondes 24 mm en verre coverslides (1 coverslide par puits). Sinon, à fond de verre en culture cellulaire plats peuvent être utilisés.
- Plaque 293A cellules sur les assiettes ou plats à D-MEM (milieu supplémenté avec 10% de SVF, 1% de L-glutamine et 1% solution de pénicilline / streptomycine) de telle sorte que les cellules atteignent 50-70% de confluence après une journée.
- 24 h après l'étalement, transfecter des cellules dans un banc à flux laminaire avec un capteur de FRET plasmide selon la méthode de transfection au phosphate de calcium (voir 3,5). plasmides biocapteurs AMPc peut être obtenu à partir de notre groupe sur demande. Le lecteur est également renvoyé aux examens approfondis 7,8 décrivant autres biocapteurs AMPc disponibles.
- Avant la transfection de cellules pour la première fois, la préparation de réactifs de transfection. Maquillage de 2,5 M CaCl 2 et de solutions 2xBBS (ce dernier contenant1,5 mM de Na 2 HPO 4, 50 mM de BES, 280 mM de NaCl, ajusté à pH 6,95 avec NaOH) dans l'eau désionisée. Filtrat stérile des solutions à l'aide d'un filtre ordinaire 0,2 um.
- Pour transfecter une plaque à 6 puits ou 6 plats à fond de verre, mélanger 10 ug de plasmide capteur FRET, 50 ul de 2,5 M solution de CaCl 2 et de l'eau stérile jusqu'à 500 pi. Mélangez bien.
- Ajouter 500 ul de 2x BBS. Bien mélanger et incuber le mélange pendant 10 min à température ambiante.
- Pipeter 165 pi du mélange de transfection goutte à goutte sur chaque puits ou un plat. Incorporer délicatement la plaque et remettez-le dans l'incubateur. Les cellules sont généralement prêt pour mesures de FRET 24 heures après la transfection. Assurez-vous que les cellules ont atteint la confluence pas à ce point, car cela peut affecter l'activité de plusieurs récepteurs de surface cellulaire.
4. FRET mesures en cellules vivantes
- Avant de mesurer pour la première fois, préparer le tampon de FRET contenant 144 mM NaCl, 5,4 mM de KCl, 1mM de MgCl2, CaCl2 2 mM, HEPES 10 mM dans de l'eau déminéralisée et ajuster le pH à 7,3 avec NaOH. Diluer les composés à utiliser dans vos expériences d'imagerie avec le tampon de FRET.
- Démarrez le logiciel d'imagerie. Charger la configuration système précédemment défini. Sélectionnez Fichier> Charger l'état du système à choisir l'état du système préalablement configuré.
- Monter un coverslide avec adhérentes des cellules transfectées 293A dans la chambre d'imagerie (par exemple: cellule Attofluor chambre). Laver les cellules une fois avec FRET tampon et ajouter 400 ul de tampon de FRET. Lors de l'utilisation de verre à fond de culture de cellules plats laver les cellules adhérentes et ajouter 2 ml de tampon par plat. Nous effectuons toutes les mesures à température ambiante dans le tampon HEPES contenant FRET, de sorte que pas de CO 2 de contrôle est nécessaire.
- Mettez un peu d'huile d'immersion sur l'objectif et le transfert de la chambre d'imagerie sur le microscope. Concentrez-vous sur la couche de cellules en utilisant la lumière de transillumination.
- Allumez le lig fluorescenteht en appuyant sur le "Live", et sélectionnez une cellule pour l'expérience. Choisissez une cellule avec une expression optimale du capteur, ce qui signifie qu'il ne doit pas être trop clair ni trop sombre. Après avoir trouvé une cellule appropriée, éteignez la lumière fluorescente immédiatement pour éviter photoblanchiment de la sonde FRET.
- Réglez le temps d'exposition à la rubrique «Réglages de l'appareil" (généralement 10-50 msec) dans un chemin qui mène à un bon rapport signal sur bruit de l'image acquise après avoir appuyé sur le bouton "Snap". Temps d'excitation trop longtemps peut entraîner photoblanchiment, alors que trop peu reprises en résultat une qualité d'image faible.
- Appuyez sur le "Multi-D Acq." bouton et définissez le nombre de points dans le temps et l'intervalle de temps d'acquisition d'images. Pour notre AMPc-FRET capteur, nous acquérons une image toutes les 5 s.
- Le début des mesures en appuyant sur le bouton «Importer».
- Au cours de toute mesure, on peut utiliser la fonction "FRET en ligne" plug-in (disponible dans le supplément en ligne, tous les plug-ins doivent être flicIED dans le dossier «plugins» de votre logiciel de Micro-Manager avant de le démarrer) pour surveiller les changements de rapport en ligne FRET. Exécuter ce plug-in et sélectionnez une région d'intérêt dans l'image en utilisant le ratio de FRET "sélections à main levée" outil. Ajouter de la région dans le gestionnaire de ROI et appuyez sur la "moyenne Get" dans la "série d'analyseurs Time" fenêtre. Le FRET trace rapport sera affiché. Pour mettre à jour la trace pendant la mesure, exécutez le "FRETratioOnline2" plug-in et cliquez sur "GetAverage" bouton.
- Dès que le FRET ratio a atteint un point de référence stable appliquer le composé désiré en précision, il pipetage dans le plat / chambre. Pour traiter les cellules avec des composés pharmacologiques, un système de perfusion au lieu de pipetage simple peut être utilisé à ce stade.
- Après avoir terminé l'expérience, à l'exception de la pile time-lapse d'images. Retirer la chambre de mesure du microscope et nettoyez l'objectif avec un tissu objectif.
- Retour à l'étape 4.3 de répéter la mesure avec unenouvel échantillon.
5. Hors ligne Analyse des données
Données d'imagerie FRET peut être analysée hors ligne à tout moment après l'expérience en utilisant le logiciel ImageJ. En complément de ce protocole, nous fournissons le "FREToffline" plug-in utilisé dans notre laboratoire pour séparer les images acquises dans des canaux de donneur et d'accepteur et de mesurer les intensités de fluorescence dans les régions d'intérêt multiples. Ces intensités peuvent en outre être copié et collé dans une feuille de calcul Excel ou l'origine pour calculer le ratio de FRET corrigée. Pour visualiser le FRET changements de biocapteurs unimoléculaires, ratiometry simple est souvent utilisé. Dans ce cas, seul le fluorophore donneur (PCP) est excité, et deux images sont prises à des pics d'émission CFP et YFP. Le calcul YFP / CFP rapport (parfois aussi appelé FRET / PCP ratio) représente le degré de FRET entre les deux fluorophores. Dans des biocapteurs unimoléculaires, le nombre de groupements PCP et YFP sont égaux, de sorte que la ratiometry simple est sufficace pour représenter le FRET efficacité 12.
- Utilisez le logiciel ImageJ pour ouvrir le fichier d'expérience en sélectionnant Plug-ins> Micro-Manager> Ouvrir Micro-Gestionnaire de fichiers.
- Exécutez le "FREToffline" plug-in qui divise la pile time-lapse en PCP et des chaînes YFP.
- Si une correction est nécessaire, ceci peut être réalisé en utilisant le logiciel ImageJ.
- Cliquez sur la pile YFP des images et sélectionner une ou plusieurs régions d'intérêt en utilisant le «sélections à main levée" outil et les ajouter à la "MultiMeasure" plug-in fenêtre en appuyant sur la bouton "Ajouter".
- Sélectionnez les régions d'intérêt dans le "MultiMeasure" fenêtre et appuyez sur "Multi" pour obtenir un tableau avec des valeurs moyennes de gris pour chaque cadre et chaque région. Copier les données dans le presse-papiers en sélectionnant tout en appuyant sur Ctrl + A et en appuyant sur Ctrl + C. Ouvrez une feuille de calcul Excel ou Origine et coller les données en appuyant sur Ctrl + V.
Les mesures effectuées par le programme peuvent être configurés sous Analyser> Paramétrage de M easurements où vous pouvez définir les paramètres à mesurer. En général, nous ne sélectionner que "Mean valeur de gris" dans cette boîte de dialogue. - Cliquez sur la pile d'images PCP. Effectuez la même que celle décrite au point 5.5. Collez les données d'intensité de la PCP dans la même feuille de calcul Excel ou origine.
- Utilisation d'Excel ou logiciel Origin, calculer le rapport corrigé FRET. Lorsque simples biocapteurs unimoléculaires à chaîne unique sont imagés, nous corrigeons seulement pour la bleedthrough de la fluorescence du donneur dans le canal accepteur. Dans ce cas, la correction accepteur / donneur rapport est:
Ratio = (YFP - B x PCP) / CFP
Où B est le facteur de correction qui peut être déterminé par la transfection de cellules avec le plasmide de la PCP et de la mesure d'un pourcentage de la fluorescence du donneur dans le canal YFP (B = YFP / PCP). L'omission de cette correction pour des biocapteurs unimoléculaires est possible, car elle ne concernerait que l'amplitude globale de la réponse FRET sans aucun effet qualitatif sur la forme de la courbe.
La figure 1 montre un exemple d'une. Entièrement assemblé FRET configuration d'imagerie composé d'un microscope inversé Nikon, CoolLED, DV2 DualView et l'Hamamatsu ORCA-03G caméra CCD Pour établir la communication entre les composants matériels de l'ordinateur et, le I / O carte Arduino est connecté à l'ordinateur et à la CoolLED comme le montre la figure 2. Pour contrôler la source de lumière et de capture d'image par la caméra de façon synchronisée, Micro-Manager logiciel doit être installé et configuré correctement (voir figure 3). Ce logiciel gratuit peut être facilement adapté aux besoins individuels expérimentaux en ajoutant plug-ins nécessaires. Figure 4A montre une première représentant FRET trace rapport à partir d'une mesure à l'aide du capteur AMPc Epac1-camps 13 exprimé dans les cellules 293A pour surveiller les effets de la β-adrénergique isoprotérénol appliqué à l'heure du point 150 sec et le parie &a;-bloquant propranolol ajouté à l'heure du point 300 sec (réalisée comme décrit dans 4.3 à 4.10). Ces données peuvent être analysées hors ligne et corrigé pour la bleedthrough de PCP dans le canal YFP comme décrit dans 5.1-5.7 pour obtenir l'. Corrigée FRET trace rapport le montre la figure 4B Cette expérience montre représentant une lente diminution du taux contrôlé lors du traitement FRET isoprotérénol qui indique une augmentation de l'AMPc intracellulaire. Propranolol en tant que β-bloquant inverse le signal d'isoprotérénol, conduisant à une diminution de l'AMPc à des niveaux basaux. Ces changements de signal de FRET peut être contrôlé en ligne au cours des expériences (comme décrit en 4.9). De telles expériences peuvent être réalisées avec une variété de biocapteurs couramment utilisés conçus pour surveiller les différents seconds messagers ou les processus biochimiques.
Mise en figure 1. Du FRET configuration d'imagerie composé d'un CoolLED, enconvertis microscope Nikon, DV2 DualView, et ORCA-03G caméra CCD.
Figure 2. Arduino I / O et ses connexions. La carte est positionnée dans une boîte en matière plastique auto-monté. Un câble BNC standard relie la LED pour les 8 broches et GND (0) du conseil d'administration.
Captures d'écran Figure 3. Démontrant l'intégration des composants du système en utilisant l'assistant de configuration matérielle. A) Lancez l'assistant de configuration matérielle. B) Ajoutez les périphériques requis tel que mentionné à la section 2.3. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 4. Un représentant FRET expérimentationt qui mesure les taux d'AMPc dans les cellules transfectées avec Epac1 293A-camps. Tout d'abord, les cellules ont été stimulées avec l'agoniste isoprotérénol β-adrénergique (100 nM, à l'image 30 ou à 150 secondes) pour augmenter l'AMPc (observée comme une diminution de la YFP / CFP FRET ratio). Les cellules ont ensuite été traités avec le β-bloquant propranolol (10 uM, à l'image 60 ou à 300 sec) ce qui conduit à une augmentation des taux de FRET, reflétant une diminution de l'AMPc. A en ligne) Raw FRET trace rapport d'une région d'intérêt correspondant à une seule cellule surveillée pendant l'expérience. B) corrigée trace rapport après déconnecté analyse des données réalisée comme décrit dans 5.1 à 5.7.
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Discussion
dans ce protocole, nous montrons comment construire un système d'imagerie simple et peu coûteuse mais puissante FRET pour les applications de routine avec une variété de biocapteurs disponibles. Le système présenté ici est conçu pour les CFP et YFP ou des types similaires de protéines fluorescentes, comme la paire donneur-accepteur. Pendant ce temps, d'autres biocapteurs individuels sont disponibles qui utilisent par exemple vert et rouge protéines fluorescentes 14. Pour adapter le système décrit pour d'autres couleurs, les sources lumineuses appropriées et / ou les ensembles de filtre doit être sélectionné. Dans le cas de LED, une autre ligne de LED unique, par exemple 490 nm pour exciter la protéine fluorescente verte peut être utilisée. Seule longueur d'onde LED peuvent être facilement (en quelques secondes) démonté et échangé. Sinon, il ya des tableaux de LED disponibles qui contiennent plusieurs lignes pour exciter différentes protéines fluorescentes (par exemple pE-2 CoolLED). Afin de permettre des mesures de FRET autre paire, les autres cubes fluorescents filtre peut être placé dans la Microsc ope, et, finalement, les émissions de séparateur de faisceau filtres doivent être changés. Photométrie offre curseurs supplémentaires des émissions de filtre pour DV2 DualView. Certaines applications récemment développés utilisent deux ou plusieurs biocapteurs pour surveiller simultanément plusieurs processus en même temps, par exemple pour l'AMPc et du GMPc ensemble dans une cellule 15. Dans ce cas, un QuadView (Photométrie) contenant quatre canaux d'émission peut être utilisé, le ImageJ plug-in pour diviser l'image et l'analyse peut alors être adapté pour être utilisé avec quatre canaux et de calculer deux ratios FRET. Logiciel ImageJ est très flexible en termes d'analyse d'image et la représentation en ligne des résultats. Simple text-éditer les plug-ins permettent une adaptation de l'algorithme du logiciel aux besoins de n'importe quel système d'imagerie individuel et l'expérience. C'est parfois très utile et offre des solutions rapides aux problèmes techniques, ce qui peut nécessiter de longues périodes où ils doivent être mis en œuvre dans n'importe quel logiciel commercial.
contenu "> Quand vous faites expériences de FRET, il est crucial d'éviter photoblanchiment qui apparaît lorsque les temps d'excitation est trop long ou lorsque les images sont prises trop fréquemment. Dans ce cas, une dégradation chimique de photons induite ou modifications covalentes de fluorophores peuvent se produire et diminuer l'efficacité de FRET. Afin d'éviter photoblanchiment, on peut réduire le temps d'exposition et la fréquence d'acquisition des images. Il existe également établi des protocoles 12,16 pour corriger ce phénomène. Lors de l'analyse des données, il est possible de corriger la diaphonie entre canaux donneur et accepteur (bleedthrough). Lorsque vous utilisez unimoléculaire FRET biocapteurs (dans lequel cas, les donneurs et les fluorophores accepteurs sont toujours exprimés au même niveau) pour les mesures ratiométrique simples, il peut être suffisant pour corriger juste pour le bleedthrough du donneur dans l'accepteur canal ou même omettre cette correction tout à fait, car il ne qualitativement affecter la forme de la courbe de taux de FRET. L'bleedthrough d'eaccepteur e dans le canal des bailleurs de fonds est généralement négligeable. Lorsque biocapteurs bimoléculaires composé de deux protéines différentes sont utilisées, elles peuvent être exprimées à différents niveaux. Dans ce cas, la correction bleedthrough et une correction supplémentaire de l'excitation directe YFP par la lumière 440 nm sont également indiquées. Veuillez vous référer à la publication du protocole 12, où toutes les procédures de correction sont décrits plus en détail. Plus d'informations complètes sur le développement de biocapteurs, FRET microscopie, les écueils possibles de la technique et de l'analyse des données sont disponibles dans les protocoles précédemment publiés 17-18. En conclusion, le système d'imagerie simple et puissant décrit ici fournit une plate-forme flexible pour suivre divers événements biochimiques et des molécules de signalisation avec une résolution temporelle et spatiale élevée dans les cellules vivantes.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier Anke Rüttgeroth et Karina Zimmermann pour l'assistance technique. Ce travail a été soutenu par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (subvention NI 1301/1-1 à VON) et de l'Université de Göttingen Medical Center («pro futura" subvention à VON).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BES Buffer Grade | AppliChem | A1062 | |
| CaCl2 dihydrate | Sigma-Aldrich | C5010 | |
| Glass coverslides | Thermo Scientific | 004710781 | Diameter 24 mm |
| Glass-bottomed cell-culture dishes | World Precision Instruments | FD3510-100 | |
| D-MEM medium | Biochrom AG | F0445 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Thermo Scientific | SH30073.02 | |
| L-Glutamine | Biochrom AG | K0283 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| MgCl2 hexahydrate | AppliChem | A4425 | |
| NaCl | AppliChem | A1149 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S9707 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom AG | A2213 | |
| Inverted fluorescent microscope | e.g. Nikon | Request at Nikon | |
| CoolLED | CoolLED | pE-100 | 440 nm |
| DualView | Photometrics | DV2-SYS | |
| DualView filter slider | Photometrics | 05-EM | |
| CFP/YFP filter set | Chroma Technology | 49052 | without the emission filter |
| ORCA-03G camera | Hamamatsu Photonics | C8484-03G02 | |
| Arduino I/O board | Sparkfun Electronics | DEV-00666 | |
| Attofluor cell chamber | Invitrogen | A-7816 | |
| Personal computer with WindowsXP or Windows7 system | Any supplier | Include hard-drive with high capacity |
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