Unimolecular 바이오 센서를 사용하여 라이브 세포에서 이벤트를 신호의 실시간 모니터링을위한 현미경을 안달
Summary
포스터 공명 에너지 전달은 (걱정) 현미경 기자 등 다양한 바이오 센서를 사용하여 라이브 세포에서 이벤트를 신호의 실시간 모니터링을위한 강력한 기술이다. 여기 어떻게 사용자 정의 epifluorescence를 구축하는 것은 상업적으로 이용 가능한 구성 요소와 방법을 실험을 안달을 위해 사용하는 방법에서 영상 시스템을 초조해 설명합니다.
Abstract
포스터 공명 에너지 전달은 (걱정) 현미경 라이브 세포와 조직의 생화학 및 신호 이벤트의 실시간 모니터링을위한 기법으로 증가 관심을 얻기 위해 계속합니다. 클래식 생화학 방법에 비해,이 소설 기술은 높은 시간적 공간적 해상도가 특징입니다. 실험 표현하고 원위치 또는 생체 1-2에 시간이 지남에 따라 이미징 될 수있는 다양한 유전자 인코딩 바이오 센서를 사용 초조해. 일반적인 바이오 센서 중 하나 단백질의 형광 태그 쌍 또는 기증자와 3-4 관심 분자에 대한 구속력있는 잔기와 상호 수용체 fluorophores을 비호하는 단일 단백질의 conformational 변화 사이에 걱정 측정하여 단백질 단백질 상호 작용을 신고 할 수 있습니다. 단백질 단백질 상호 작용에 대한 Bimolecular 바이오 센서 포함, 예를 들어, 동안 unimolecular 센서 MEA, 세포 5 G-단백질 활성화를 모니터링하기위한 구성합니다suring conformational 변화 널리 칼슘 6, 캠프 7-8, 이노시톨 인산염 9 cGMP 10-11과 같은 이미지 초 메신저로 사용됩니다. 여기 어떻게 사용자 정의 epifluorescence를 구축하는 것이 하나의 상업적으로 이용 가능한 구성 요소와 방법 마이크로 관리자 프리웨어를 사용하여 전체 설정을 제어하는 방법에서 영상 시스템을 초조해 설명합니다. 이 간단하지만 강력한 계기는 라이브 셀에 걱정 일상이나보다 정교한 측정을 위해 설계되었습니다. 획득 이미지는 그래픽 형식으로 저장되기 전에 모든 실험을하는 동안 실시간으로 초조해 비율의 변화를 시각적으로 자기 작성된 플러그인을 사용하여 처리됩니다와 호환 빌드 된 다음 데이터 분석에 사용 ImageJ 프리웨어. 이 저렴한 비용으로 시스템이 높은 유연성을 특징으로하며 성공적으로 사용할 수의 과다에 의해 다양한 생화학 행사 및 신호 분자를 모니터링하는 데 사용할 수있는 것은 라이브 세포와 조직에 바이오 센서를 안달. 예를 들어, 우리는 H를 보여β-아드레날린 수용체 작용제 및 차단기가있는 자극시 라이브 293A 세포에서 캠프의 실시간 모니터링을 수행하려면이 이미징 시스템을 사용하는 아야.
Protocol
Discussion
이 프로토콜에서, 우리는 가능한 바이오 센서의 다양한 일상 응용 프로그램에 대한 간단한 저렴한 비용으로하지만 강력한 걱정 이미징 시스템을 구축하는 방법을 보여줍니다. 여기에 제시된 시스템은 기증자 – 수용체 쌍으로 CFP와 YFP, 또는 형광 단백질의 유사한 유형을 위해 설계되었습니다. 한편, 다른 개인의 바이오 센서는 예를 들어 녹색과 적색 형광 단백질에게 14 사용하는 사용할 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 기술 지원을 Anke Rüttgeroth와 카리나 Zimmermann 감사드립니다. 이 작품은 독일 Forschungsgemeinschaft (폰에 부여 NI 1301/1-1)와 괴팅겐 의료 센터의 대학 (폰에 '프로 futura "보조금)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments |
| BES Buffer Grade | AppliChem | A1062 | |
| CaCl2 dihydrate | Sigma-Aldrich | C5010 | |
| Glass coverslides | Thermo Scientific | 004710781 | Diameter 24 mm |
| Glass-bottomed cell-culture dishes | World Precision Instruments | FD3510-100 | |
| D-MEM medium | Biochrom AG | F0445 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Thermo Scientific | SH30073.02 | |
| L-Glutamine | Biochrom AG | K0283 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| MgCl2 hexahydrate | AppliChem | A4425 | |
| NaCl | AppliChem | A1149 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S9707 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom AG | A2213 | |
| Inverted fluorescent microscope | e.g. Nikon | Request at Nikon | |
| CoolLED | CoolLED | pE-100 | 440 nm |
| DualView | Photometrics | DV2-SYS | |
| DualView filter slider | Photometrics | 05-EM | |
| CFP/YFP filter set | Chroma Technology | 49052 | without the emission filter |
| ORCA-03G camera | Hamamatsu Photonics | C8484-03G02 | |
| Arduino I/O board | Sparkfun Electronics | DEV-00666 | |
| Attofluor cell chamber | Invitrogen | A-7816 | |
| Personal computer with WindowsXP or Windows7 system | Any supplier | Include hard-drive with high capacity |
References
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