Summary
فورستر نقل الطاقة الرنين (الحنق) هو تقنية المجهر قوية لمراقبة الوقت الحقيقي من الأحداث يشير في الخلايا الحية باستخدام أجهزة الاستشعار المختلفة وصحفيين. هنا نحن تصف كيفية بناء epifluorescence مخصصة الحنق نظام التصوير من المكونات المتوفرة تجاريا وكيفية استخدامها لتجارب الحنق.
Abstract
فورستر نقل الطاقة الرنين (الحنق) المجهر تواصل كسب اهتمام متزايد كأسلوب لمراقبة الوقت الحقيقي من الأحداث البيوكيميائية ويشير في الخلايا الحية والأنسجة. بالمقارنة مع الأساليب الكلاسيكية البيوكيميائية، وتتميز هذه التكنولوجيا رواية عالية الدقة الزمنية والمكانية. الحنق تجارب استخدام مختلف وراثيا ترميز أجهزة الاستشعار التي يمكن التعبير عنها وتصويرها على مر الزمن في الموقع أو في الجسم الحي 1-2. يمكن أجهزة الاستشعار التقليدية تقريرا إما البروتين البروتين التفاعلات عن طريق قياس الحنق بين زوج fluorophore الموسومة البروتينات أو تغييرات في بتكوين بروتين واحد الذي يؤوي المانحة ومتقبل fluorophores مترابطة مع شاردة ملزمة لجزيء من مصلحة 3-4. أجهزة الاستشعار عن ثنائي الجزيء البروتين البروتين التفاعلات تشمل، على سبيل المثال، يبني مصممة لرصد بروتين G-التنشيط في خلايا 5، في حين أن أجهزة الاستشعار unimolecular شركة طيران الشرق الأوسطوتستخدم على نطاق واسع التغيرات بتكوين suring لرسل الصورة الثانية مثل الكالسيوم 6، مخيم 7-8، الفوسفات اينوزيتول 9 و المركب 10-11. هنا نحن تصف كيفية بناء epifluorescence مخصصة الحنق نظام التصوير من واحد المكونات المتوفرة تجاريا وكيفية السيطرة على كامل الإعداد باستخدام مجانية الصغرى، مدير. تم تصميم هذه الأداة بسيطة ولكنها قوية لقياسات روتينية أو أكثر تطورا الحنق في الخلايا الحية. تتم معالجة الصور باستخدام المكتسبة الذاتية المكتوبة المكونات الإضافية لرؤية التغييرات في نسبة الحنق في الوقت الحقيقي في أي تجارب قبل أن يتم تخزينها في شكل رسومات متوافقة مع البناء في يماغيج مجانية المستخدمة لتحليل البيانات اللاحقة. ويتميز هذا النظام منخفضة التكلفة من مرونة عالية، ويمكن استخدامها بنجاح لرصد الأحداث البيوكيميائية المختلفة والجزيئات يشير من قبل عدد كبير من أجهزة الاستشعار المتاحة الحنق في الخلايا الحية والأنسجة. وكمثال على ذلك، علينا أن نبرهن حآه لاستخدام هذا النظام لأداء التصوير في الوقت الحقيقي رصد المخيم في الخلايا الحية على التحفيز 293A مع مستقبلات β ناهض الأدرينالية ومانع.
Protocol
1. إنشاء الحنق مجهر التصوير
من حيث المبدأ، يمكن تكييفها أي مضان المجهر المقلوب الذي يتوفر في المختبر ويحتوي على منفذ لكاميرا التصوير الحنق. يجب الإعداد النهائي وتشمل المكونات التالية الحاسمة: مجهر، مصدر الضوء مع أو بدون مصراع إضافية، والحزم الخائن للضوء الانبعاثات وكاميرا CCD-(انظر الشكل 1). يتم دمج الأجهزة، خاصة مصدر الضوء، ومصراع الكاميرا إلى وتسيطر عليها وبرامج التصوير التي تسمح الحصول على الصور والتحليل. أدناه وصفنا إجراء بسيط لتجميع مكونات النظام من الحنق متاحة تجاريا.
- الاتصال مصدر الضوء إلى المجهر. على سبيل المثال، استخدم ينبعث منها ضوء الصمام الثنائي واحدة الطول الموجي (ع CoolLED E-100، 440 نانومتر) الذي يثير انتقائي تعزيز سماوي بروتين فلوري (CFP) يستخدم كأساس المانحة في معظم أجهزة الاستشعار الحنق. يمكن أن تكون مباشرةلي وصلها بسهولة إلى ميناء الإضاءة epifluorescence من المجهر. هناك أيضا متعدد الطول الموجي المصابيح المتاحة والتي يمكن ان تكون مرتبطة على نحو مماثل. بدلا من ذلك يمكن لل، وغيرها من مصادر الضوء LED القياسية مثل XBO75 مصباح قوس الزينون (غالبا ما تستخدم لالمجاهر أوليمبوس وزايس) أو مصباح الزئبق HBO (تثبيت عادة على المجاهر نيكون) يمكن استخدامها. في حالة وجود مصباح الفلورسنت، ويجب أيضا وضع مصراع بين المصباح ومنفذ الإضاءة لتمكين برنامج حاسوبي لمراقبة بمساعدة من الضوء على الإثارة القادمة عينتك. CoolLED لا يتطلب أي إضافية منذ مصراع يمكن أن تحول مباشرة وإيقاف من قبل البرنامج. والعيب من أنظمة LED أحادية اللون هو عدد محدود من موجات الإثارة، في حين أن مصباح الفلورسنت مع مجموعات مختلفة مرشح هو خيار أكثر مرونة، وخصوصا عندما تعمل مع أجهزة الاستشعار المتعددة وثنائي الجزيء. بدلا من ذلك، يمكن أن مصادر الضوء مستوحد اللون (مثل فازة V، TILLPhotonics) يكونتستخدم، بل وعادة ما يكون الغالق المتكاملة التي يمكن أن تكون البرمجيات التحكم فيها عن طريق إشارة الزناد.
- ضع قطعة من المناسب في تصفية المجهر. لقياسات روتينية الحنق مع CFP وتعزيز بروتين فلوري الصفراء (YFP) أو أي من المتغيرات على النحو الحنق على الزوج، ونحن نستخدم مكعب بسيطة تحتوي على عامل تصفية تصفية الإثارة ET436/30M (التي يمكن حذفها عند استخدام LED، ولكن لا غنى عنه و عند استخدام مصباح زينون أو الزئبق بدلا من الصمام) ومرآة مزدوج اللون DCLP455. وينبغي أيضا أن تكون مجهزة المجهر مع الهدف مناسبة لالمجهري مضان حسن القرار، على سبيل المثال مع فلور خطة، خطة neofluar أو خطة لامزيغ-40X، 60X 100X أو النفط الغمر الهدف.
- التبديل على ضوء الفلورسنت وتحقق ما إذا كان يتم توزيع بالتساوي في جميع أنحاء بقعة ضوء مجال الرؤية. إذا لم تكن هذه هي الحالة، مطلوب محاذاة إضافية للLED مصباح أو لتحقيق الإضاءة الأمثل للعينة. هذا يمكن أن يكون ادائهاميد باستخدام مسامير والذي وضع الصمام الثنائي أو على مصباح في الفضاء.
- توصيل الحزم الخائن عن طريق C-جبل بأحد منافذ الانبعاثات المجهر ل. على سبيل المثال، استخدم العرض الثنائي DV2 (Photometrics) الذي يقسم ضوء الانبعاثات إلى قنوات (المانحة ومتقبل) اللذين يمكن رصدها في وقت واحد على شريحة واحدة كاميرا CCD. بدلا من ذلك، هناك منتجات أخرى مماثلة مثل Optosplit (العلامة البحوث) أو الخائن شعاع دمجها في الكاميرا هاماماتسو ثنائي الطول الموجي ORCA-D2. لCFP / YFP الحنق الزوج، ونحن نستخدم 05-EM مرشح مجموعة تحتوي على مرآة مزدوج اللون 505dcxr بالإضافة إلى ET480/30M والمرشحات الانبعاثات ET535/40M لCFP وYFP، على التوالي، والذي تم توفيره مع DV2. بدلا من الحزم الخائن، واثنين من مكعبات مرشح للمتبرع (الذي يحتوي على فلتر الإثارة ET436/30M لCFP، المرآة DCLP455 مزدوج اللون وتصفية الانبعاثات CFP) ومتقبل (CFP يحتوي على فلتر الإثارة، DCLP455 وتصفية الانبعاثات YFP) وتستخدم القنوات فيالعديد من أنظمة الحنق. وبدلا من ذلك، يمكن تثبيت واحد مكعب مرشح دون أي مرشح الانبعاثات وتلقائي موقف الانبعاثات عجلة تصفية امام الكاميرا. في هذه الحالة، المجهر الآلية أو المناوبين عجلة تصفية بين مواقف الانبعاثات 2 ميللي ثانية ضمن تصفية 200-300 ~ لأداء التصوير ratiometric. هذا التأخير بشكل مقبول عند طفيفة التصوير داخل الخلايا بطيئة نوعا ما عمليات، مثل إشارات المخيم حيث الاستحواذ في وقت واحد حقا كل من القنوات ليست حرجة.
- توصيل الكاميرا CCD (على سبيل المثال استخدام ORCA-03G-R2 أو ORCA من الضوئيات هاماماتسو) إلى شاطر الحزمة. استخدم كابل فاير واير لتوصيل الكاميرا إلى واجهة الكمبيوتر IEEE1394، كما هو موضح في دليل المرفقة مع الكاميرا. تثبيت برامج تشغيل الكاميرا دون تبديل على الكاميرا.
- وأخيرا، لتأسيس اتصال بين الكمبيوتر ومصدر الضوء، قم بتوصيل I / O اردوينو متنها (على سبيل المثال استخدام اردوينو Duemilanove أو أونو اردوينو) إلى LED أو تييا مصراع باستخدام كبل BNC الذي ينبغي أن يحتوي على المكونات الطبيعية BNC على الجانب الصمام واثنين من الأسلاك واحد على الطرف الآخر متصلا في GND دبابيس (0) و 8 من المجلس كما هو مبين في الشكل 2. يمكن تجميعها لوحة توصيل USB مباشرة إلى منفذ جهاز الكمبيوتر الخاص بك.
2. إعداد برامج التصوير
لمراقبة ومزامنة مع مصدر الضوء التقاط الصور بواسطة الكاميرا، يجب تثبيت برامج التصوير على جهاز الكمبيوتر. هناك العديد من حزم البرامج المتاحة تجاريا بما في ذلك MetaFluor (الأجهزة الجزيئية)، Slidebook (الذكي التصوير الابتكارات)، VisiView (نظم Visitron). نحن هنا لشرح استخدام مجاني للالصغرى، مدير مفتوح المصدر الذي يوفر درجة عالية من المرونة للتصوير منخفضة التكلفة.
- تحميل هذا البرنامج في http://valelab.ucsf.edu/ ~ MM / MMwiki / مؤشر.PHP / الصغرى، Manager_Version_Archive. نوصي تثبيت الإصدار 1.4.5 الذي هو شكلي بسهولة في أيدينا.
- ربط مجلس اردوينو إلى منفذ USB لجهاز الكمبيوتر الخاص بك. تحميل برنامج للسيطرة على مجلس اردوينو من http://www.arduino.cc/en/Main/software . اتبع الإرشادات الموجودة على هذا الموقع وتشغيل هذا البرنامج مرة واحدة فقط قبل بدء الصغرى، مدير. تحميل رمز لاستخدام لوحة الصغرى، مع مدير البرنامج. ويمكن تحميل التعليمات البرمجية في http://valelab.ucsf.edu/ ~ MM / MMwiki / index.php / اردوينو .
- التبديل على LED والكاميرا. بدء تشغيل البرنامج وتكوين الصغرى، مدير الاتصالات مع الكاميرا وLED (مصدر الضوء وغيرها من مصراع) عن طريق اختيار أدوات> معالج تكوين الأجهزة (انظر الشكل 3). إضافة المكونات المطلوبة بما في ذلك الكاميرا(أي Hamamatsu_ DCAM) واردوينو المجلس (إضافة اردوينو التبديل، محور اردوينو والأجهزة اردوينو-مصراع). خلال الخطوات التالية، استخدام الإعدادات الافتراضية المقترحة من قبل المعالج. حفظ التكوين النظام الجديد عند المطالبة من قبل المعالج.
- استخدام القائمة الرئيسية لفتح أدوات> متصفح عقارات الأجهزة. انتقل لأسفل إلى "الدولة التبديل اردوينو" وحدد "1". إغلاق مربع الحوار. تأكد من أن لتكتك "لصناعة السيارات في مصراع" مربع الحوار في البرامج الرئيسية. اضغط ملف> حفظ حالة النظام لإنقاذ برامج التكوين التي يجب ان يفتح في أي وقت بعد بدء البرنامج. وهذا تأسيس اتصال بين المجلس والبرمجيات اللازمة لأداء الحصول على الصور.
- اضغط على "لايف" الزر لرصد إشارة القادمة من الكاميرا. تأكد من أن ضوء الفلورسنت يمضي "لايف" في أي وقت أو تحديد "عض" وظيفة. قبل البدء في القياسات الأولى، اتبع التعليمات المرفقة مع الحزمة الخائن للكلتشكيل محاذاة البصرية من كل القنوات.
3. زراعة الخلايا وTransfections
- إعداد لوحات 6 تعقيمها بشكل جيد مع الجولة 24 مم الزجاج coverslides (1 coverslide لكل بئر). وبدلا من ذلك، يمكن استخدام الزجاج ذات قاع خلية ثقافة الأطباق.
- لوحة 293A الخلايا على لوحات أو أطباق في D-MEM المتوسطة (تستكمل مع FCS 10٪، 1٪ الجلوتامين L-و 1٪ البنسلين / الستربتوميسين الحل) بحيث تصل إلى الخلايا 50-70٪ confluency بعد يوم واحد.
- 24 ساعة بعد الطلاء، وبالنقل الخلايا في الصفحي مقاعد البدلاء تدفق مع جهاز استشعار الحنق البلازميد باستخدام طريقة ترنسفكأيشن الفوسفات الكالسيوم (انظر 3.5). ويمكن الحصول على البلازميدات المجس البيولوجي المخيم من مجموعتنا عند الطلب. ويشار أيضا إلى القارئ إلى استعراضات شاملة تصف 7،8 الأخرى المتاحة أجهزة الاستشعار المخيم.
- قبل بنقل العدوى إلى خلايا للمرة الأولى، وإعداد الكواشف ترنسفكأيشن. تشكل 2.5 م 2 و CaCl حلول 2xBBS (وهذه الأخيرة تحتوي على1.5 مم نا 2 HPO 4 و 50 ملي BES، 280 مم كلوريد الصوديوم، وضبط درجة الحموضة إلى 6.95 مع هيدروكسيد الصوديوم) في الماء منزوع الأيونات. العقيمة الترشيح الحلول باستخدام فلتر 0.2 ميكرومتر العادية.
- لبالنقل لوحة 6 جيدا أو 6 أطباق ذات قاع زجاجي، مزيج من 10 ميكروغرام الحنق استشعار البلازميد، 50 ميكرولتر من 2.5M الحل 2 CaCl والماء المعقم ما يصل إلى 500 ميكرولتر. تخلط جيدا.
- إضافة 500 ميكرولتر من BBS 2X. تخلط جيدا واحتضان الخليط لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- ماصة 165 ميكرولتر من مزيج ترنسفكأيشن نقطه نقطه على كل بئر أو الطبق. يحرك المزيج برفق لوحة ووضعها مرة أخرى في الحاضنة. وعادة ما تكون الخلايا جاهزة للقياسات الحنق 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن. تأكد من أن الخلايا لم تصل confluency في هذه المرحلة، لأن ذلك قد يؤثر على نشاط مستقبلات سطح الخلية عدة.
4. الحنق القياسات في الخلايا الحية
- قبل القياس لأول مرة، وإعداد المخزن المؤقت تحتوي على 144 ملي الحنق كلوريد الصوديوم، 5.4 ملي بوكل، 1ملم MgCl 2، 2 مم CaCl 2، 10 ملم في المياه HEPES منزوع الأيونات وضبط درجة الحموضة إلى 7.3 مع هيدروكسيد الصوديوم. يخفف من المركبات لاستخدامها في تجارب التصوير الخاصة بك مع المخزن المؤقت الحنق.
- بدء تشغيل البرنامج التصوير. تحميل تعريف تكوين النظام سابقا. حدد ملف النظام> تحميل دولة أن تختار تكوين حالة النظام السابق.
- شن coverslide مع الخلايا الملتصقة 293A بالنقل في غرفة التصوير (مثل غرفة خلية Attofluor). غسل الخلايا مرة واحدة مع الحنق العازلة وإضافة 400 ميكرولتر من العازلة الحنق. عند استخدام الزجاج ذات قاع خلية ثقافة غسل الأطباق الخلايا الملتصقة وإضافة 2 مل من المخزن المؤقت لكل طبق. ونحن أداء جميع القياسات في درجة حرارة الغرفة في المخزن المؤقت الحنق التي تحتوي على HEPES، بحيث لا CO 2 التحكم ضروري.
- وضع بعض الغمر النفط على الهدف ونقل غرفة التصوير على المجهر. التركيز على طبقة الخلايا باستخدام الضوء تضوء.
- التبديل على التركي الممتاز الفلورسنتحزب التحرير عن طريق الضغط على "لايف" الزر، وحدد خلية للتجربة. اختيار الخلية مع تعبير الاستشعار الأمثل، وهذا يعني أنه ينبغي أن يكون يست مشرقة جدا وليس قاتمة جدا. بعد العثور على الخلية المناسبة، إيقاف تشغيل ضوء الفلورسنت على الفور لتجنب photobleaching من أجهزة الاستشعار الحنق.
- ضبط زمن التعرض تحت "إعدادات الكاميرا" (عادة 10-50 ميللي ثانية) بطريقة تؤدي إلى نسبة الإشارة إلى الضوضاء جيدة من الصورة المكتسبة بعد الضغط على "عض" الزر. قد أوقات الإثارة وقتا طويلا يؤدي إلى photobleaching، في حين قصيرة جدا نتيجة مرات في جودة الصورة منخفضة.
- اضغط على "موضوع-D ACQ". زر وتعيين عدد من النقاط والوقت الفاصل الزمني لالتقاط صور. لاستشعار المخيمات الحنق دينا، ونحن الحصول على صورة واحدة كل 5 ثوان.
- بدء القياسات عن طريق الضغط على "الحصول على" الزر.
- خلال أي قياس، يمكن للمرء استخدام "الحنق على الانترنت" في المكونات (متوفر في الملحق أون لاين، جميع المكونات الإضافية يجب أن يكون شرطيالعبوات الناسفة في مجلد "الإضافات" من البرنامج الصغير مديرك قبل البدء به) لرصد التغيرات الحنق نسبة عبر الإنترنت. تشغيل هذه المكونات في وتحديد منطقة ذات أهمية في الصورة باستخدام نسبة الحنق "الاختيارات حر" الأداة. إضافة إلى مدير المنطقة ROI ثم اضغط على "احصل على متوسط" الموجود في "السلاسل الزمنية محلل" نافذة. سوف يتم عرض الحنق تتبع النسبة. لتحديث تتبع أثناء عملية القياس، قم بتشغيل "FRETratioOnline2" في المكونات ثم اضغط على "GetAverage" الزر.
- بمجرد أن وصلت نسبة الحنق خط أساس مستقر تطبيق مجمع المطلوب من قبل pipetting بدقة عليه في صحن / غرفة. لعلاج الخلايا مع المركبات الدوائية، يمكن استخدام نظام نضح بدلا من pipetting بسيطة في هذه المرحلة.
- بعد الانتهاء من التجربة، حفظ الوقت الفاصل بين كومة من الصور. إزالة غرفة القياس من المجهر وتنظيف الهدف باستخدام الأنسجة الهدف.
- العودة إلى الخطوة 4.3 إلى تكرار القياس معجديد العينة.
5. حاليا تحليل البيانات
ويمكن تحليل البيانات التصوير الحنق حاليا في أي وقت بعد التجربة باستخدام يماغيج البرمجيات. كتكملة لهذا البروتوكول، ونحن نقدم "FREToffline" في المكونات المستخدمة في مختبرنا لتقسيم الصور إلى قنوات المكتسبة المانحة ومتقبل لقياس شدة والفلورية في مناطق متعددة من الفائدة. يمكن لهذه أن تكون شدة مزيد من النسخ لصق جدول بيانات Excel أو الأصل لحساب نسبة تصحيح الحنق. لتصور التغييرات الحنق من أجهزة الاستشعار unimolecular، وكثيرا ما يستخدم ratiometry بسيطة. في هذه الحالة، هو متحمس فقط fluorophore المانحة (CFP)، ويتم أخذ صورتين في قمم الانبعاثات CFP وYFP. وتحسب YFP / CFP نسبة (أحيانا يشار أيضا إلى نسبة الحنق / CFP ع) يمثل درجة الحنق بين fluorophores اثنين. في أجهزة الاستشعار unimolecular، فإن أعداد CFP والأنصاف YFP على قدم المساواة، بحيث ratiometry البسيطة هي suffiآاف لتمثيل كفاءة الحنق 12.
- استخدام البرمجيات يماغيج لفتح الملف عن طريق اختيار تجربة الإضافات> الصغرى، مدير> فتح الصغرى، إدارة الملفات.
- تشغيل "FREToffline" في المكونات التي انشقاقات المكدس في الوقت الفاصل بين CFP الفردية والقنوات YFP.
- إذا كان المطلوب تصحيح الخلفية، يمكن إجراء ذلك باستخدام يماغيج البرمجيات.
- انقر على كومة من YFP الصور واختيار واحد أو عدة مناطق من الاهتمام باستخدام "الاختيارات حر" أداة وإضافتها إلى "MultiMeasure" في المكونات النافذة عن طريق الضغط على الزر "إضافة".
- تحديد مناطق المصالح في إطار "MultiMeasure" ثم اضغط على "موضوع" للحصول على الجدول مع القيم الرمادي يعني لكل إطار ولكل المنطقة. نسخ البيانات إلى الحافظة من خلال تحديد جميع باستخدام Ctrl + A وبالضغط على Ctrl + C. فتح جدول بيانات Excel أو الأصل ولصق البيانات عن طريق الضغط على Ctrl + V.
يمكن تكوين القياسات التي يقوم بها البرنامج في إطار تحليل> مجموعة M easurements حيث يمكنك تحديد للقياس المعلمات. نختار عادة فقط "متوسط القيمة الرمادية" في هذا الحوار. - انقر فوق إلى المكدس CFP من الصور. أداء نفس كما هو موضح في 5.5. لصق البيانات كثافة CFP في نفس إكسل أو جدول المنشأ.
- باستخدام إكسل أو برنامج المنشأ، وحساب نسبة تصحيح الحنق. عندما يتم تصوير بسيط أجهزة الاستشعار واحد unimolecular سلسلة، ونحن فقط من أجل تصحيح bleedthrough من مضان المانحة في قناة متقبل. في هذه الحالة، تصحيح متقبل / النسبة المانحة:
نسبة = (YFP - B X CFP) / CFP
حيث B هو معامل التصحيح الذي يمكن تحديده من خلال بنقل العدوى إلى خلايا CFP مع البلازميد وقياس نسبة مئوية من مضان المانحة في قناة YFP (B = YFP / CFP). إهمال هذا التصحيح لأجهزة الاستشعار unimolecular من الممكن، لأنه سيؤثر فقط السعة الإجمالية للاستجابة الحنق دون أي تأثير نوعي على شكل المنحنى.
ويظهر الشكل 1 مثالا ل. تجميعها بشكل كامل الحنق الإعداد التصوير يتكون من نيكون المجهر المقلوب، CoolLED، DV2 العرض الثنائي والكاميرا هاماماتسو CCD-03G ORCA لإنشاء اتصال بين مكونات الأجهزة والكمبيوتر، يتم توصيل I / O اردوينو المجلس إلى الكمبيوتر وإلى CoolLED كما هو مبين في الشكل 2. للسيطرة على مصدر الضوء والتقاط الصور بواسطة الكاميرا بطريقة متزامنة، مدير البرمجيات الصغرى، لابد من تركيب وتكوين بشكل صحيح (انظر الشكل 3). يمكن هذا مجانية تكيف بسهولة مع الاحتياجات الفردية التجريبية بإضافة المكونات الإضافية اللازمة. الشكل 4A يظهر الخام ممثل الحنق تتبع نسبة من القياس باستخدام أجهزة الاستشعار المخيم Epac1-13 مخيمات أعرب في الخلايا 293A لرصد آثار β الأدرينالية ناهض تطبيق ايزوبروتيرينول في الوقت ثوانى 150 نقطة والرهان على وألف؛ محصر بروبرانولول وأضاف في الوقت ثوانى 300 نقطة (كما هو موضح في تنفيذ 4،3-4،10). ويمكن تحليل هذه البيانات وتصحيحها متواجد حاليا لbleedthrough من CFP في القناة YFP كما هو موضح في 5،1-5،7 للحصول على. تصحيح الحنق تتبع نسبة هو موضح في الشكل 4B هذه التجربة ممثل انخفاضا بطيئا في نسبة رصد الحنق على العلاج الذي يشير ايزوبروتيرينول بزيادة قدرها المخيم داخل الخلايا. بروبرانولول كما β-مانع عكس إشارة ايزوبروتيرينول، مما يؤدي إلى نقص في المخيم لمستويات القاعدية. هذه التغييرات في الحنق يمكن رصدها عبر الإنترنت في أي إشارة التجارب (كما هو موضح في 4.9). لا يمكن أن يؤديها مثل هذه التجارب مع مجموعة متنوعة من أجهزة الاستشعار المستخدمة عادة مصممة لرصد المرسال الثاني مختلفة أو العمليات البيوكيميائية.
الشكل 1. تخطيط من الحنق الإعداد التصوير تتكون من CoolLED، فيverted نيكون المجهر، DV2 العرض الثنائي، وORCA-03G كاميرا CCD.
الشكل 2. اردوينو I / O مجلس الإدارة وارتباطاتها. يتم وضع لوحة في مربع من البلاستيك الذاتي شنت. كبل BNC القياسية يربط الصمام لدبابيس 8 و GND (0) للمجلس.
الشكل 3. لقطات تظهر التكامل بين مكونات النظام باستخدام معالج تكوين الأجهزة. A) بدء تشغيل معالج تكوين الأجهزة. B) إضافة الأجهزة المطلوبة على النحو المذكور في 2.3. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .
4 الشكل. ممثل الحنق التجربهر الذي يقيس مستويات المخيم في الخلايا transfected مع 293A-مخيمات Epac1. الأولى، تم تحفيز الخلايا مع ايزوبروتيرينول ناهض الأدرينالية β (100 نيوتن متر، في إطار 30 أو ب 150 ثانية) لزيادة المخيم (كما لوحظ انخفاض في YFP / CFP الحنق نسبة). تم علاج الخلايا في وقت لاحق مع محصر β بروبرانولول (10 ميكرومتر، في إطار 60 أو في 300 ثانية) مما يؤدي إلى زيادة نسبة من الحنق، مما يعكس انخفاضا في المخيم. على الانترنت) الخام الحنق تتبع نسبة من منطقة ذات أهمية المقابلة خلية واحدة إلى رصد أثناء التجربة. B) تصحيح التتبع نسبة بعد إجراء متواجد حاليا تحليل البيانات كما هو موضح في 5،1-5،7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذا البروتوكول، ونحن لشرح كيفية بناء نظام التصوير بسيطة منخفضة التكلفة ولكنها قوية للتطبيقات الروتينية الحنق مع مجموعة متنوعة من أجهزة الاستشعار المتاحة. تم تصميم نظام المعروضة هنا لCFP وYFP، أو أنواع مماثلة من البروتينات الفلورية، حيث يتحرك هذا الزوج المانحين متقبل. وفي الوقت نفسه، أجهزة الاستشعار الفردية الأخرى التي تصبح متاحة على سبيل المثال استخدام البروتينات الفلورية الخضراء والحمراء 14. لتكييف النظام المذكور لألوان أخرى، ينبغي اختيار مصادر الضوء المناسب و / أو مجموعات التصفية. في حالة LED، LED آخر سطر واحد، على سبيل المثال 490 نانومتر لإثارة يمكن استخدام بروتين الفلورية الخضراء. يمكن واحد يكون الطول الموجي المصابيح بسهولة (في غضون ثوان) راجلة وتبادلها. بدلا من ذلك، هناك صفائف LED المتاحة والتي تحتوي على عدة خطوط لإثارة البروتينات الفلورية مختلفة (مثل المؤسسة العامة-2 CoolLED). لتمكين القياسات البديلة مع أزواج الحنق، يمكن وضع مكعبات أخرى مرشح الفلورسنت في microsc مكتب مستشار رئيس الوزراء، ويجب في نهاية المطاف أن تبادل الانبعاثات الحزم الخائن المرشحات. Photometrics يقدم المتزلجون الانبعاثات إضافية لتصفية العرض الثنائي DV2. بعض التطبيقات التي تم تطويرها مؤخرا استخدام اثنين أو أكثر من أجهزة الاستشعار في وقت واحد لمراقبة عمليات متعددة في نفس الوقت، لمعسكر سبيل المثال ومتطلبات cGMP معا في خلية واحدة 15. في هذه الحالة، يمكن استخدام QuadView (Photometrics) التي تحتوي على قنوات الانبعاثات الأربعة، يماغيج المكونات في ليمكن تقسيم الصورة والتحليل ثم تكييفها ليتم استخدامها مع أربع قنوات وحساب نسب إلى اثنين من الحنق. يماغيج برنامج مرن جدا من حيث تحليل الصور والتمثيل على شبكة الإنترنت من النتائج. النص بسيط في تحرير المكونات الإضافية تسمح التكيف من الخوارزمية البرنامج لاحتياجات أي نظام التصوير الفردية والتجربة. هذا هو مفيدة للغاية في بعض الأحيان، ويقدم حلول سريعة للمشاكل التقنية، والتي يمكن أن تتطلب أوقات طويلة عندما يكون لديهم لتنفيذها في أي حزمة البرمجيات التجارية.
محتوى "في هذه الحالة عند القيام الحنق التجارب، لا بد من تجنب photobleaching التي تظهر عند العصر الإثارة طويلة جدا أو عندما يتم أخذ الصور في كثير من الأحيان أيضا.>، قد ألحقت أضرارا الكيميائية الناجمة عن الفوتون أو تعديلات التساهمية من fluorophores تحدث و انخفاض كفاءة الحنق. لتجنب photobleaching، يمكن للمرء أن يقلل من زمن التعرض وتكرار الحصول على الصور. ينشأ أيضا بروتوكولات 12،16 لتصحيح هذه الظاهرة. خلال تحليل البيانات، فمن الممكن لتصحيح الحديث المتبادل بين المانحة ومتقبل قنوات (bleedthrough). عند استخدام أجهزة الاستشعار unimolecular الحنق (التي يتم التعبير عنها دائما المانحة وحالة متقبل fluorophores على نفس المستوى) لقياسات ratiometric بسيطة، فإنه يمكن أن يكون كافيا لتصحيح عادل للbleedthrough من الجهة المانحة إلى متقبل قناة أو حذف حتى هذا التصحيح بالمرة لأنه لا يؤثر نوعيا في شكل المنحنى نسبة الحنق. وbleedthrough من المتقبل ه في قناة المانحة عادة لا يكاد يذكر. عند استخدام أجهزة الاستشعار ثنائي الجزيء تتألف من اثنين من البروتينات المختلفة، يمكن التعبير عن هذه على مختلف المستويات. في هذه الحالة، وتصحيح bleedthrough على أن التصحيح إضافية لإثارة YFP مباشرة من ضوء نانومتر 440 هي أيضا من المستحسن. يرجى الرجوع الى بروتوكول نشر 12 حيث يتم وصف جميع إجراءات التصحيح في مزيد من التفاصيل. معلومات شاملة إضافية حول تطوير أجهزة الاستشعار، الحنق المجهر، المزالق المحتملة للتقنية وتحليل البيانات حول متوفرة في البروتوكولات التي تم نشرها مسبقا 17-18. وفي الختام، ونظام التصوير بسيطة وقوية وصفها هنا توفر منصة مرنة لرصد الأحداث البيوكيميائية المختلفة والجزيئات يشير مع ارتفاع القرار الزمنية والمكانية في الخلايا الحية.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
فإن الكتاب أود أن أشكر انكه Rüttgeroth وزيمرمان كارينا للمساعدة التقنية. وأيد هذا العمل من قبل جمعية الألمانية للبحوث (NI 1301/1-1 منحة لVON) وجامعة غوتنغن المركز الطبي ("برو FUTURA" منحة لVON).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BES Buffer Grade | AppliChem | A1062 | |
| CaCl2 dihydrate | Sigma-Aldrich | C5010 | |
| Glass coverslides | Thermo Scientific | 004710781 | Diameter 24 mm |
| Glass-bottomed cell-culture dishes | World Precision Instruments | FD3510-100 | |
| D-MEM medium | Biochrom AG | F0445 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Thermo Scientific | SH30073.02 | |
| L-Glutamine | Biochrom AG | K0283 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| MgCl2 hexahydrate | AppliChem | A4425 | |
| NaCl | AppliChem | A1149 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S9707 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom AG | A2213 | |
| Inverted fluorescent microscope | e.g. Nikon | Request at Nikon | |
| CoolLED | CoolLED | pE-100 | 440 nm |
| DualView | Photometrics | DV2-SYS | |
| DualView filter slider | Photometrics | 05-EM | |
| CFP/YFP filter set | Chroma Technology | 49052 | without the emission filter |
| ORCA-03G camera | Hamamatsu Photonics | C8484-03G02 | |
| Arduino I/O board | Sparkfun Electronics | DEV-00666 | |
| Attofluor cell chamber | Invitrogen | A-7816 | |
| Personal computer with WindowsXP or Windows7 system | Any supplier | Include hard-drive with high capacity |
References
- Zaccolo, M. Use of chimeric fluorescent proteins and fluorescence resonance energy transfer to monitor cellular responses. Circ. Res. 94, 866-873 (2004).
- Mehta, S., Zhang, J. Reporting from the field: genetically encoded fluorescent reporters uncover signaling dynamics in living biological systems. Annu. Rev. Biochem. 80, 375-401 (2011).
- Zhang, J., Campbell, R. E., Ting, A. Y., Tsien, R. Y. Creating new fluorescent probes for cell biology. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3, 906-918 (2002).
- Miyawaki, A. Visualization of the spatial and temporal dynamics of intracellular signaling. Dev. Cell. 4, 295-305 (2003).
- Bunemann, M., Frank, M., Lohse, M. J. Gi protein activation in intact cells involves subunit rearrangement rather than dissociation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 16077-16082 (2003).
- Kotlikoff, M. I. Genetically encoded Ca2+ indicators: using genetics and molecular design to understand complex physiology. J. Physiol. 578, 55-67 (2007).
- Willoughby, D., Cooper, D. M.
- Nikolaev, V. O., Lohse, M. J. Monitoring of cAMP synthesis and degradation in living cells. Physiology (Bethesda). 21, 86-92 (2006).
- Tanimura, A. Use of Fluorescence Resonance Energy Transfer-based Biosensors for the Quantitative Analysis of Inositol 1,4,5-Trisphosphate Dynamics in Calcium Oscillations. J. Biol. Chem. 284, 8910-8917 (2009).
- Nikolaev, V. O., Lohse, M. J. Novel techniques for real-time monitoring of cGMP in living cells. Handb. Exp. Pharmacol. , 229-243 (2009).
- Nausch, L. W., Ledoux, J., Bonev, A. D., Nelson, M. T., Dostmann, W. R. Differential patterning of cGMP in vascular smooth muscle cells revealed by single GFP-linked biosensors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 365-370 (2008).
- Borner, S. FRET measurements of intracellular cAMP concentrations and cAMP analog permeability in intact cells. Nat. Protoc. 6, 427-438 (2011).
- Nikolaev, V. O., Bunemann, M., Hein, L., Hannawacker, A., Lohse, M. J. Novel single chain cAMP sensors for receptor-induced signal propagation. J. Biol. Chem. 279, 37215-37218 (2004).
- Hong, K. P., Spitzer, N. C., Nicol, X. Improved molecular toolkit for cAMP studies in live cells. BMC Res. Notes. 4, 241-24 (2011).
- Niino, Y., Hotta, K., Oka, K. Simultaneous live cell imaging using dual FRET sensors with a single excitation light. PLoS One. 4, e6036 (2009).
- Palmer, A. E., Tsien, R. Y. Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators. Nat. Protoc. 1, 1057-1065 (2006).
- Brumbaugh, J., Schleifenbaum, A., Stier, G., Sattler, M., Schultz, C. Single- and dual-parameter FRET kinase probes based on pleckstrin. Nat. Protoc. 1, 1044-1055 (2006).
- Aoki, K., Matsuda, M. Visualization of small GTPase activity with fluorescence resonance energy transfer-based biosensors. Nat. Protoc. 4, 1623-1631 (2009).
