FRET mikroskopi af Real-time overvågning af signalering begivenheder i levende celler Brug unimolekylær Biosensorer
Summary
Förster resonans (FRET) mikroskopi er en kraftfuld teknik til real-time overvågning af signalering begivenheder i levende celler ved hjælp af forskellige biosensorer som reportere. Her beskriver vi, hvordan man opbygger et tilpasset epifluorescens FRET imaging system fra kommercielt tilgængelige komponenter, og hvordan man bruger det til FRET eksperimenter.
Abstract
Förster resonans (FRET) mikroskopi fortsætter med at vinde stigende interesse som en teknik til real-time overvågning af biokemiske og signalere begivenheder i levende celler og væv. Sammenlignet med klassiske biokemiske metoder, er denne nye teknologi kendetegnet ved høj tidslig og rumlig opløsning. FRET forsøg bruge forskellige genetisk kodede biosensorer, som kan udtrykkes og afbildet over tid in situ eller in vivo 1-2. Typiske biosensorer kan enten rapportere protein-protein-interaktioner ved at måle FRET mellem en fluorofor-mærket par proteiner eller konformationelle ændringer i et enkelt protein, der huser donor-og acceptor-fluoroforer indbyrdes forbundet med en bindingsdel til et molekyle af interesse 3-4. Bimolekylære biosensorer for protein-protein interaktioner indbefatter for eksempel, konstruktioner designet til at overvåge G-protein-aktivering i celler 5, mens de unimolekylær sensorer meaSuring konformationelle ændringer er almindeligt anvendt til billede second messengers, såsom calcium 6, cAMP 7-8, inositolphosphater 9 og cGMP 10-11. Her beskriver vi, hvordan man opbygger et tilpasset epifluorescens FRET imaging system fra enkelte kommercielt tilgængelige komponenter og hvordan du kan styre hele opsætningen ved hjælp af Micro-Manager freeware. Denne enkle, men kraftfulde instrument er designet til rutinemæssige eller mere sofistikerede FRET målinger i levende celler. Erhvervede billeder behandles ved hjælp af selvstændig skriftlig plug-ins til at visualisere ændringer i FRET forhold i real-tid under alle eksperimenter, før de lagres i et grafikprogram format kompatibelt med den indbyggede ImageJ freeware anvendes til efterfølgende dataanalyse. Dette billige system er kendetegnet ved høj fleksibilitet og kan med succes anvendes til at overvåge forskellige biokemiske begivenheder og signaleringsmolekyler af et væld af tilgængelige FRET biosensorer i levende celler og væv. Som et eksempel udviser vi how at bruge denne afbildningssystem til at udføre tidstro overvågning af cAMP i levende 293A-celler ved stimulering med en β-adrenerg receptoragonist og blokker.
Protocol
Discussion
i denne protokol, viser vi, hvordan man opbygger en simpel billig, men kraftig FRET imaging system til rutinemæssige applikationer med en bred vifte af tilgængelige biosensorer. Systemet præsenteres her er designet til CFP og YFP eller lignende typer fluorescerende proteiner, som donor-acceptor-par. Samtidig har andre individuelle biosensorer bliver tilgængelige som bruger for eksempel grønne og røde fluorescerende proteiner 14. At tilpasse det beskrevne system for andre farver, skal passende lyskilder …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke Anke Rüttgeroth og Karina Zimmermann til teknisk bistand. Dette arbejde blev støttet af Deutsche Forschungsgemeinschaft (tilskud NI 1301/1-1 til VON) og universitetet i Göttingen Medical Center ("pro Futura" tilskud til VON).
Materials
| Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments |
| BES Buffer Grade | AppliChem | A1062 | |
| CaCl2 dihydrate | Sigma-Aldrich | C5010 | |
| Glass coverslides | Thermo Scientific | 004710781 | Diameter 24 mm |
| Glass-bottomed cell-culture dishes | World Precision Instruments | FD3510-100 | |
| D-MEM medium | Biochrom AG | F0445 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Thermo Scientific | SH30073.02 | |
| L-Glutamine | Biochrom AG | K0283 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| MgCl2 hexahydrate | AppliChem | A4425 | |
| NaCl | AppliChem | A1149 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S9707 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom AG | A2213 | |
| Inverted fluorescent microscope | e.g. Nikon | Request at Nikon | |
| CoolLED | CoolLED | pE-100 | 440 nm |
| DualView | Photometrics | DV2-SYS | |
| DualView filter slider | Photometrics | 05-EM | |
| CFP/YFP filter set | Chroma Technology | 49052 | without the emission filter |
| ORCA-03G camera | Hamamatsu Photonics | C8484-03G02 | |
| Arduino I/O board | Sparkfun Electronics | DEV-00666 | |
| Attofluor cell chamber | Invitrogen | A-7816 | |
| Personal computer with WindowsXP or Windows7 system | Any supplier | Include hard-drive with high capacity |
References
- Zaccolo, M. Use of chimeric fluorescent proteins and fluorescence resonance energy transfer to monitor cellular responses. Circ. Res. 94, 866-873 (2004).
- Mehta, S., Zhang, J. Reporting from the field: genetically encoded fluorescent reporters uncover signaling dynamics in living biological systems. Annu. Rev. Biochem. 80, 375-401 (2011).
- Zhang, J., Campbell, R. E., Ting, A. Y., Tsien, R. Y. Creating new fluorescent probes for cell biology. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3, 906-918 (2002).
- Miyawaki, A. Visualization of the spatial and temporal dynamics of intracellular signaling. Dev. Cell. 4, 295-305 (2003).
- Bunemann, M., Frank, M., Lohse, M. J. Gi protein activation in intact cells involves subunit rearrangement rather than dissociation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 16077-16082 (2003).
- Kotlikoff, M. I. Genetically encoded Ca2+ indicators: using genetics and molecular design to understand complex physiology. J. Physiol. 578, 55-67 (2007).
- Willoughby, D., Cooper, D. M. Live-cell imaging of cAMP dynamics. Nat. Methods. 5, 29-36 (2008).
- Nikolaev, V. O., Lohse, M. J. Monitoring of cAMP synthesis and degradation in living cells. Physiology (Bethesda). 21, 86-92 (2006).
- Tanimura, A. Use of Fluorescence Resonance Energy Transfer-based Biosensors for the Quantitative Analysis of Inositol 1,4,5-Trisphosphate Dynamics in Calcium Oscillations. J. Biol. Chem. 284, 8910-8917 (2009).
- Nikolaev, V. O., Lohse, M. J. Novel techniques for real-time monitoring of cGMP in living cells. Handb. Exp. Pharmacol. , 229-243 (2009).
- Nausch, L. W., Ledoux, J., Bonev, A. D., Nelson, M. T., Dostmann, W. R. Differential patterning of cGMP in vascular smooth muscle cells revealed by single GFP-linked biosensors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 365-370 (2008).
- Borner, S. FRET measurements of intracellular cAMP concentrations and cAMP analog permeability in intact cells. Nat. Protoc. 6, 427-438 (2011).
- Nikolaev, V. O., Bunemann, M., Hein, L., Hannawacker, A., Lohse, M. J. Novel single chain cAMP sensors for receptor-induced signal propagation. J. Biol. Chem. 279, 37215-37218 (2004).
- Hong, K. P., Spitzer, N. C., Nicol, X. Improved molecular toolkit for cAMP studies in live cells. BMC Res. Notes. 4, 241-24 (2011).
- Niino, Y., Hotta, K., Oka, K. Simultaneous live cell imaging using dual FRET sensors with a single excitation light. PLoS One. 4, e6036 (2009).
- Palmer, A. E., Tsien, R. Y. Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators. Nat. Protoc. 1, 1057-1065 (2006).
- Brumbaugh, J., Schleifenbaum, A., Stier, G., Sattler, M., Schultz, C. Single- and dual-parameter FRET kinase probes based on pleckstrin. Nat. Protoc. 1, 1044-1055 (2006).
- Aoki, K., Matsuda, M. Visualization of small GTPase activity with fluorescence resonance energy transfer-based biosensors. Nat. Protoc. 4, 1623-1631 (2009).
