Summary

FRET mikroskopi af Real-time overvågning af signalering begivenheder i levende celler Brug unimolekylær Biosensorer

Published: August 20, 2012
doi:

Summary

Förster resonans (FRET) mikroskopi er en kraftfuld teknik til real-time overvågning af signalering begivenheder i levende celler ved hjælp af forskellige biosensorer som reportere. Her beskriver vi, hvordan man opbygger et tilpasset epifluorescens FRET imaging system fra kommercielt tilgængelige komponenter, og hvordan man bruger det til FRET eksperimenter.

Abstract

Förster resonans (FRET) mikroskopi fortsætter med at vinde stigende interesse som en teknik til real-time overvågning af biokemiske og signalere begivenheder i levende celler og væv. Sammenlignet med klassiske biokemiske metoder, er denne nye teknologi kendetegnet ved høj tidslig og rumlig opløsning. FRET forsøg bruge forskellige genetisk kodede biosensorer, som kan udtrykkes og afbildet over tid in situ eller in vivo 1-2. Typiske biosensorer kan enten rapportere protein-protein-interaktioner ved at måle FRET mellem en fluorofor-mærket par proteiner eller konformationelle ændringer i et enkelt protein, der huser donor-og acceptor-fluoroforer indbyrdes forbundet med en bindingsdel til et molekyle af interesse 3-4. Bimolekylære biosensorer for protein-protein interaktioner indbefatter for eksempel, konstruktioner designet til at overvåge G-protein-aktivering i celler 5, mens de unimolekylær sensorer meaSuring konformationelle ændringer er almindeligt anvendt til billede second messengers, såsom calcium 6, cAMP 7-8, inositolphosphater 9 og cGMP 10-11. Her beskriver vi, hvordan man opbygger et tilpasset epifluorescens FRET imaging system fra enkelte kommercielt tilgængelige komponenter og hvordan du kan styre hele opsætningen ved hjælp af Micro-Manager freeware. Denne enkle, men kraftfulde instrument er designet til rutinemæssige eller mere sofistikerede FRET målinger i levende celler. Erhvervede billeder behandles ved hjælp af selvstændig skriftlig plug-ins til at visualisere ændringer i FRET forhold i real-tid under alle eksperimenter, før de lagres i et grafikprogram format kompatibelt med den indbyggede ImageJ freeware anvendes til efterfølgende dataanalyse. Dette billige system er kendetegnet ved høj fleksibilitet og kan med succes anvendes til at overvåge forskellige biokemiske begivenheder og signaleringsmolekyler af et væld af tilgængelige FRET biosensorer i levende celler og væv. Som et eksempel udviser vi how at bruge denne afbildningssystem til at udføre tidstro overvågning af cAMP i levende 293A-celler ved stimulering med en β-adrenerg receptoragonist og blokker.

Protocol

1. Opsætning af en FRET Imaging mikroskop I princippet kan en inverteret fluorescensmikroskop, som er tilgængelig i laboratoriet og har et kamera port tilpasses til FRET billeddannelse. Den endelige setup skal indeholde følgende vigtige komponenter: et mikroskop, en lyskilde med eller uden yderligere lukker, en bjælke-splitter for emission lys og en CCD-kamera (se figur 1). De hardwareenheder, især den lyskilde, lukkeren og kameraet er integreret i og styret af imaging so…

Discussion

i denne protokol, viser vi, hvordan man opbygger en simpel billig, men kraftig FRET imaging system til rutinemæssige applikationer med en bred vifte af tilgængelige biosensorer. Systemet præsenteres her er designet til CFP og YFP eller lignende typer fluorescerende proteiner, som donor-acceptor-par. Samtidig har andre individuelle biosensorer bliver tilgængelige som bruger for eksempel grønne og røde fluorescerende proteiner 14. At tilpasse det beskrevne system for andre farver, skal passende lyskilder …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne vil gerne takke Anke Rüttgeroth og Karina Zimmermann til teknisk bistand. Dette arbejde blev støttet af Deutsche Forschungsgemeinschaft (tilskud NI 1301/1-1 til VON) og universitetet i Göttingen Medical Center ("pro Futura" tilskud til VON).

Materials

Name of the reagent/equipment Company Catalogue number Comments
BES Buffer Grade AppliChem A1062  
CaCl2 dihydrate Sigma-Aldrich C5010  
Glass coverslides Thermo Scientific 004710781 Diameter 24 mm
Glass-bottomed cell-culture dishes World Precision Instruments FD3510-100  
D-MEM medium Biochrom AG F0445  
Fetal calf serum (FCS) Thermo Scientific SH30073.02  
L-Glutamine Biochrom AG K0283  
HEPES Sigma H4034  
KCl Sigma P5405  
MgCl2 hexahydrate AppliChem A4425  
NaCl AppliChem A1149  
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S9707  
Penicillin/Streptomycin Biochrom AG A2213  
Inverted fluorescent microscope e.g. Nikon Request at Nikon  
CoolLED CoolLED pE-100 440 nm
DualView Photometrics DV2-SYS  
DualView filter slider Photometrics 05-EM  
CFP/YFP filter set Chroma Technology 49052 without the emission filter
ORCA-03G camera Hamamatsu Photonics C8484-03G02  
Arduino I/O board Sparkfun Electronics DEV-00666  
Attofluor cell chamber Invitrogen A-7816  
Personal computer with WindowsXP or Windows7 system Any supplier   Include hard-drive with high capacity

References

  1. Zaccolo, M. Use of chimeric fluorescent proteins and fluorescence resonance energy transfer to monitor cellular responses. Circ. Res. 94, 866-873 (2004).
  2. Mehta, S., Zhang, J. Reporting from the field: genetically encoded fluorescent reporters uncover signaling dynamics in living biological systems. Annu. Rev. Biochem. 80, 375-401 (2011).
  3. Zhang, J., Campbell, R. E., Ting, A. Y., Tsien, R. Y. Creating new fluorescent probes for cell biology. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3, 906-918 (2002).
  4. Miyawaki, A. Visualization of the spatial and temporal dynamics of intracellular signaling. Dev. Cell. 4, 295-305 (2003).
  5. Bunemann, M., Frank, M., Lohse, M. J. Gi protein activation in intact cells involves subunit rearrangement rather than dissociation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 16077-16082 (2003).
  6. Kotlikoff, M. I. Genetically encoded Ca2+ indicators: using genetics and molecular design to understand complex physiology. J. Physiol. 578, 55-67 (2007).
  7. Willoughby, D., Cooper, D. M. Live-cell imaging of cAMP dynamics. Nat. Methods. 5, 29-36 (2008).
  8. Nikolaev, V. O., Lohse, M. J. Monitoring of cAMP synthesis and degradation in living cells. Physiology (Bethesda). 21, 86-92 (2006).
  9. Tanimura, A. Use of Fluorescence Resonance Energy Transfer-based Biosensors for the Quantitative Analysis of Inositol 1,4,5-Trisphosphate Dynamics in Calcium Oscillations. J. Biol. Chem. 284, 8910-8917 (2009).
  10. Nikolaev, V. O., Lohse, M. J. Novel techniques for real-time monitoring of cGMP in living cells. Handb. Exp. Pharmacol. , 229-243 (2009).
  11. Nausch, L. W., Ledoux, J., Bonev, A. D., Nelson, M. T., Dostmann, W. R. Differential patterning of cGMP in vascular smooth muscle cells revealed by single GFP-linked biosensors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 365-370 (2008).
  12. Borner, S. FRET measurements of intracellular cAMP concentrations and cAMP analog permeability in intact cells. Nat. Protoc. 6, 427-438 (2011).
  13. Nikolaev, V. O., Bunemann, M., Hein, L., Hannawacker, A., Lohse, M. J. Novel single chain cAMP sensors for receptor-induced signal propagation. J. Biol. Chem. 279, 37215-37218 (2004).
  14. Hong, K. P., Spitzer, N. C., Nicol, X. Improved molecular toolkit for cAMP studies in live cells. BMC Res. Notes. 4, 241-24 (2011).
  15. Niino, Y., Hotta, K., Oka, K. Simultaneous live cell imaging using dual FRET sensors with a single excitation light. PLoS One. 4, e6036 (2009).
  16. Palmer, A. E., Tsien, R. Y. Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators. Nat. Protoc. 1, 1057-1065 (2006).
  17. Brumbaugh, J., Schleifenbaum, A., Stier, G., Sattler, M., Schultz, C. Single- and dual-parameter FRET kinase probes based on pleckstrin. Nat. Protoc. 1, 1044-1055 (2006).
  18. Aoki, K., Matsuda, M. Visualization of small GTPase activity with fluorescence resonance energy transfer-based biosensors. Nat. Protoc. 4, 1623-1631 (2009).

Play Video

Cite This Article
Sprenger, J. U., Perera, R. K., Götz, K. R., Nikolaev, V. O. FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors. J. Vis. Exp. (66), e4081, doi:10.3791/4081 (2012).

View Video