FRET-Mikroskopie zur Echtzeit-Überwachung der Signalisierung Events in lebenden Zellen mit unimolekularen Biosensors
Summary
Förster Resonanz Energie Transfer (FRET)-Mikroskopie ist eine leistungsstarke Technik für die Echtzeit-Überwachung der Signalwege in lebenden Zellen mit verschiedenen Biosensoren als Reporter. Hier beschreiben wir, wie eine benutzerdefinierte Epifluoreszenz bauen FRET Imaging-System aus handelsüblichen Komponenten und wie es zu benutzen für Experimente FRET.
Abstract
Förster-Resonanz-Energie-Transfer (FRET)-Mikroskopie weiterhin zunehmendes Interesse als Technik zur Echtzeit-Überwachung von biochemischen und Signaltransduktion in lebende Zellen und Gewebe zu gewinnen. Im Vergleich zu klassischen biochemischen Methoden wird diese neuartige Technologie durch hohe zeitliche und räumliche Auflösung aus. FRET-Experimente verwenden verschiedene genetisch-codierten Biosensoren, die berechnet und abgebildet werden im Laufe der Zeit in situ oder in vivo 1-2 können. Typische Biosensoren können entweder berichten Protein-Protein-Wechselwirkungen, die durch Messen von FRET zwischen einem Fluorophor-markierten Paar von Proteinen oder Konformationsänderungen in einem einzelnen Protein, das Donor-und Akzeptor-Fluorophoren mit einem Bindungsanteil für ein Molekül von Interesse verbunden 3-4 birgt. Bimolekularen Biosensoren für Protein-Protein-Interaktionen umfassen beispielsweise, konstruiert zur G-Protein-Aktivierung in den Zellen 5 überwachen, während die unimolekularen Sensoren meaSuring Konformationsänderungen werden weit an image Botenstoffe wie Calcium 6, cAMP 7-8, Inositolphosphate 9 und cGMP 10-11 verwendet. Hier beschreiben wir, wie eine benutzerdefinierte Epifluoreszenz bauen FRET Imaging-System aus einzelnen kommerziell verfügbaren Komponenten und wie man das ganze Setup mit dem Micro-Manager freeware steuern. Diese einfache, aber leistungsfähige Gerät ist für den Routine oder mehr anspruchsvolle FRET-Messungen in lebenden Zellen konzipiert. Aufgenommenen Bilder werden unter Verwendung selbst geschriebenen Plug-Ins, um Änderungen in FRET-Verhältnis in Echtzeit während allen Experimenten zu visualisieren, bevor sie in einem Grafik-Format gespeichert werden mit der Build-in ImageJ freeware für spätere Datenanalyse verwendet. Diese Low-Cost-System zeichnet sich durch hohe Flexibilität aus und kann erfolgreich eingesetzt werden, um verschiedene biochemische Vorgänge und Signalmolekülen durch eine Vielzahl von zur Verfügung zu überwachen FRET Biosensoren in lebenden Zellen und Geweben. Als ein Beispiel zeigen wir how diese Bildgebungssystem zu verwenden, um die Echtzeit-Überwachung von cAMP in lebenden 293A-Zellen nach Stimulation mit einem β-adrenergen Rezeptor-Agonisten und-Blocker durchzuführen.
Protocol
Discussion
in diesem Protokoll zeigen wir, wie man eine einfache Low-Cost, aber leistungsstarke FRET Imaging-System für Routine-Anwendungen mit einer Vielzahl von verfügbaren Biosensoren bauen. Das hier vorgestellte System ist für GFP und YFP oder ähnlichen Typen von fluoreszierenden Proteinen, wie die Donor-Akzeptor-Paar. Unterdessen werden andere individuelle Biosensoren zur Verfügung, verwenden zum Beispiel grün und rot fluoreszierenden Proteinen 14. Um das beschriebene System für andere Farben anzupassen, sin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren bedanken sich bei Anke Rüttgeroth und Karina Zimmermann für die technische Unterstützung bedanken. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (Stipendium NI 1301/1-1 bis VON) und der University of Göttingen Medical Center ("pro futura" Zuschuss VON) unterstützt.
Materials
| Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments |
| BES Buffer Grade | AppliChem | A1062 | |
| CaCl2 dihydrate | Sigma-Aldrich | C5010 | |
| Glass coverslides | Thermo Scientific | 004710781 | Diameter 24 mm |
| Glass-bottomed cell-culture dishes | World Precision Instruments | FD3510-100 | |
| D-MEM medium | Biochrom AG | F0445 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Thermo Scientific | SH30073.02 | |
| L-Glutamine | Biochrom AG | K0283 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| MgCl2 hexahydrate | AppliChem | A4425 | |
| NaCl | AppliChem | A1149 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S9707 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom AG | A2213 | |
| Inverted fluorescent microscope | e.g. Nikon | Request at Nikon | |
| CoolLED | CoolLED | pE-100 | 440 nm |
| DualView | Photometrics | DV2-SYS | |
| DualView filter slider | Photometrics | 05-EM | |
| CFP/YFP filter set | Chroma Technology | 49052 | without the emission filter |
| ORCA-03G camera | Hamamatsu Photonics | C8484-03G02 | |
| Arduino I/O board | Sparkfun Electronics | DEV-00666 | |
| Attofluor cell chamber | Invitrogen | A-7816 | |
| Personal computer with WindowsXP or Windows7 system | Any supplier | Include hard-drive with high capacity |
References
- Zaccolo, M. Use of chimeric fluorescent proteins and fluorescence resonance energy transfer to monitor cellular responses. Circ. Res. 94, 866-873 (2004).
- Mehta, S., Zhang, J. Reporting from the field: genetically encoded fluorescent reporters uncover signaling dynamics in living biological systems. Annu. Rev. Biochem. 80, 375-401 (2011).
- Zhang, J., Campbell, R. E., Ting, A. Y., Tsien, R. Y. Creating new fluorescent probes for cell biology. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3, 906-918 (2002).
- Miyawaki, A. Visualization of the spatial and temporal dynamics of intracellular signaling. Dev. Cell. 4, 295-305 (2003).
- Bunemann, M., Frank, M., Lohse, M. J. Gi protein activation in intact cells involves subunit rearrangement rather than dissociation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 16077-16082 (2003).
- Kotlikoff, M. I. Genetically encoded Ca2+ indicators: using genetics and molecular design to understand complex physiology. J. Physiol. 578, 55-67 (2007).
- Willoughby, D., Cooper, D. M. Live-cell imaging of cAMP dynamics. Nat. Methods. 5, 29-36 (2008).
- Nikolaev, V. O., Lohse, M. J. Monitoring of cAMP synthesis and degradation in living cells. Physiology (Bethesda). 21, 86-92 (2006).
- Tanimura, A. Use of Fluorescence Resonance Energy Transfer-based Biosensors for the Quantitative Analysis of Inositol 1,4,5-Trisphosphate Dynamics in Calcium Oscillations. J. Biol. Chem. 284, 8910-8917 (2009).
- Nikolaev, V. O., Lohse, M. J. Novel techniques for real-time monitoring of cGMP in living cells. Handb. Exp. Pharmacol. , 229-243 (2009).
- Nausch, L. W., Ledoux, J., Bonev, A. D., Nelson, M. T., Dostmann, W. R. Differential patterning of cGMP in vascular smooth muscle cells revealed by single GFP-linked biosensors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 365-370 (2008).
- Borner, S. FRET measurements of intracellular cAMP concentrations and cAMP analog permeability in intact cells. Nat. Protoc. 6, 427-438 (2011).
- Nikolaev, V. O., Bunemann, M., Hein, L., Hannawacker, A., Lohse, M. J. Novel single chain cAMP sensors for receptor-induced signal propagation. J. Biol. Chem. 279, 37215-37218 (2004).
- Hong, K. P., Spitzer, N. C., Nicol, X. Improved molecular toolkit for cAMP studies in live cells. BMC Res. Notes. 4, 241-24 (2011).
- Niino, Y., Hotta, K., Oka, K. Simultaneous live cell imaging using dual FRET sensors with a single excitation light. PLoS One. 4, e6036 (2009).
- Palmer, A. E., Tsien, R. Y. Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators. Nat. Protoc. 1, 1057-1065 (2006).
- Brumbaugh, J., Schleifenbaum, A., Stier, G., Sattler, M., Schultz, C. Single- and dual-parameter FRET kinase probes based on pleckstrin. Nat. Protoc. 1, 1044-1055 (2006).
- Aoki, K., Matsuda, M. Visualization of small GTPase activity with fluorescence resonance energy transfer-based biosensors. Nat. Protoc. 4, 1623-1631 (2009).
