סריג מיקרוסקופי לניטור בזמן אמת של אירועי איתות בתאים חיים באמצעות Biosensors Unimolecular
Summary
העברת אנרגית פורסטר תהודה (סריג) מיקרוסקופית היא טכניקה רבה עצמה לניטור בזמן אמת של אירועי איתות בתאים חיים באמצעות חיישנים ביולוגיים שונים כעיתונאים. כאן אנו מתארים כיצד לבנות epifluorescence אישית סריג מערכת הדמיה ממרכיבים מסחריים זמינים וכיצד להשתמש בו לניסויי סריג.
Abstract
העברת אנרגית פורסטר תהודה (סריג) מיקרוסקופיה ממשיכה לצבור עניין גובר כטכניקה לניטור בזמן אמת של אירועים ביוכימיים ואיתות בתאים ורקמות חיות. בהשוואה לשיטות קלסיות ביוכימיים, טכנולוגיה חדשנית זו מתאפיינת ברזולוציה של זמן ומרחב גבוהה. סריג ניסויים להשתמש biosensors השונה גנטי מקודד אשר יכול לבוא לידי ביטוי, וצלם לאורך הזמן באתר או בvivo 1-2. biosensors הטיפוסי יכול לדווח על אינטראקציות בין חלבונים על ידי מדידת הסריג בין זוג fluorophore מתויג-של חלבונים או שינויים קונפורמציה בחלבון יחיד שמטפחים תורם וfluorophores acceptor מקושר עם מחצית מחייבת למולקולה של עניין 3-4. biosensors bimolecular לאינטראקציות בין חלבונים כולל, למשל, בונה נועד לפקח הפעלת G-חלבון בתאים 5, בעוד חיישני unimolecular meaשינויים קונפורמציה Suring נמצאים בשימוש נרחב לשליחים שניים תמונה כגון סידן 6, 7-8 מחנה, פוספטים אינוסיטול 9 ו cGMP 10-11. כאן אנו מתארים כיצד לבנות epifluorescence אישית סריג מערכת הדמיה ממרכיבים זמינים מסחרי בודדים ואיך לשלוט בכל ההתקנה באמצעות מנהל freeware-מייקרו. מכשיר פשוט אך רב עצמה זו נועד למדידות שגרתיות או מתוחכמות יותר סריג בתאים חיים. תמונות נרכשות מעובדות באמצעות תוספות עצמיות כתובות לדמיין שינויים ביחס סריג בזמן האמת במהלך כל ניסויים לפני שמאוחסן בתבנית גרפית תואם עם build-בfreeware ImageJ משמש לניתוח נתונים שלאחר מכן. עלות מערכת נמוכה זה מאופיין בגמישות גבוהה וניתן להשתמש בו בהצלחה לניטור אירועים ביוכימיים שונים ומולקולות איתות על ידי שפע של סריג biosensors זמין בתאים ורקמות חיות. כדוגמה, אנחנו מדגימים hאוו לשימוש במערכת הדמיה זה כדי לבצע ניטור בזמן אמת של cAMP בתאי 293A חיים על גירוי עם אגוניסט וחסמי רצפטור β-adrenergic.
Protocol
Discussion
בפרוטוקול זה, אנו מדגימים כיצד לבנות מערכה בעלות נמוכה אבל חזקה סריג פשוטה ליישומי הדמיה שיגרתי עם מגוון רחב של חיישנים ביולוגיים זמינים. המערכת שהוצגה כאן מיועדת לCFP וYFP, או סוגים דומים של חלבוני ניאון, כזוג-acceptor התורם. בינתיים, biosensors הבודד האחר שיהיו זמין להשתמש למשל…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות לאנקת רוטגרות' וקארינה צימרמן לסיוע טכני. עבודה זו נתמכה על ידי Forschungsgemeinschaft דויטשה (מענק NI 1301/1-1 לפון) ואוניברסיטת גטינגן במרכז רפואי ("פרו Futura" מענק לפון).
Materials
| Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments |
| BES Buffer Grade | AppliChem | A1062 | |
| CaCl2 dihydrate | Sigma-Aldrich | C5010 | |
| Glass coverslides | Thermo Scientific | 004710781 | Diameter 24 mm |
| Glass-bottomed cell-culture dishes | World Precision Instruments | FD3510-100 | |
| D-MEM medium | Biochrom AG | F0445 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Thermo Scientific | SH30073.02 | |
| L-Glutamine | Biochrom AG | K0283 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| MgCl2 hexahydrate | AppliChem | A4425 | |
| NaCl | AppliChem | A1149 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S9707 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom AG | A2213 | |
| Inverted fluorescent microscope | e.g. Nikon | Request at Nikon | |
| CoolLED | CoolLED | pE-100 | 440 nm |
| DualView | Photometrics | DV2-SYS | |
| DualView filter slider | Photometrics | 05-EM | |
| CFP/YFP filter set | Chroma Technology | 49052 | without the emission filter |
| ORCA-03G camera | Hamamatsu Photonics | C8484-03G02 | |
| Arduino I/O board | Sparkfun Electronics | DEV-00666 | |
| Attofluor cell chamber | Invitrogen | A-7816 | |
| Personal computer with WindowsXP or Windows7 system | Any supplier | Include hard-drive with high capacity |
References
- Zaccolo, M. Use of chimeric fluorescent proteins and fluorescence resonance energy transfer to monitor cellular responses. Circ. Res. 94, 866-873 (2004).
- Mehta, S., Zhang, J. Reporting from the field: genetically encoded fluorescent reporters uncover signaling dynamics in living biological systems. Annu. Rev. Biochem. 80, 375-401 (2011).
- Zhang, J., Campbell, R. E., Ting, A. Y., Tsien, R. Y. Creating new fluorescent probes for cell biology. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3, 906-918 (2002).
- Miyawaki, A. Visualization of the spatial and temporal dynamics of intracellular signaling. Dev. Cell. 4, 295-305 (2003).
- Bunemann, M., Frank, M., Lohse, M. J. Gi protein activation in intact cells involves subunit rearrangement rather than dissociation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 16077-16082 (2003).
- Kotlikoff, M. I. Genetically encoded Ca2+ indicators: using genetics and molecular design to understand complex physiology. J. Physiol. 578, 55-67 (2007).
- Willoughby, D., Cooper, D. M. Live-cell imaging of cAMP dynamics. Nat. Methods. 5, 29-36 (2008).
- Nikolaev, V. O., Lohse, M. J. Monitoring of cAMP synthesis and degradation in living cells. Physiology (Bethesda). 21, 86-92 (2006).
- Tanimura, A. Use of Fluorescence Resonance Energy Transfer-based Biosensors for the Quantitative Analysis of Inositol 1,4,5-Trisphosphate Dynamics in Calcium Oscillations. J. Biol. Chem. 284, 8910-8917 (2009).
- Nikolaev, V. O., Lohse, M. J. Novel techniques for real-time monitoring of cGMP in living cells. Handb. Exp. Pharmacol. , 229-243 (2009).
- Nausch, L. W., Ledoux, J., Bonev, A. D., Nelson, M. T., Dostmann, W. R. Differential patterning of cGMP in vascular smooth muscle cells revealed by single GFP-linked biosensors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 365-370 (2008).
- Borner, S. FRET measurements of intracellular cAMP concentrations and cAMP analog permeability in intact cells. Nat. Protoc. 6, 427-438 (2011).
- Nikolaev, V. O., Bunemann, M., Hein, L., Hannawacker, A., Lohse, M. J. Novel single chain cAMP sensors for receptor-induced signal propagation. J. Biol. Chem. 279, 37215-37218 (2004).
- Hong, K. P., Spitzer, N. C., Nicol, X. Improved molecular toolkit for cAMP studies in live cells. BMC Res. Notes. 4, 241-24 (2011).
- Niino, Y., Hotta, K., Oka, K. Simultaneous live cell imaging using dual FRET sensors with a single excitation light. PLoS One. 4, e6036 (2009).
- Palmer, A. E., Tsien, R. Y. Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators. Nat. Protoc. 1, 1057-1065 (2006).
- Brumbaugh, J., Schleifenbaum, A., Stier, G., Sattler, M., Schultz, C. Single- and dual-parameter FRET kinase probes based on pleckstrin. Nat. Protoc. 1, 1044-1055 (2006).
- Aoki, K., Matsuda, M. Visualization of small GTPase activity with fluorescence resonance energy transfer-based biosensors. Nat. Protoc. 4, 1623-1631 (2009).
