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Biology

単分子バイオセンサーを用いた生細胞中のシグナル伝達事象をリアルタイムで監視するための顕微鏡のFRET

doi: 10.3791/4081 Published: August 20, 2012

Summary

フェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)顕微鏡は、レポーターとして、様々なバイオセンサーを用いた生細胞中のシグナル伝達事象をリアルタイムで監視するための強力な手法です。ここで我々はどのようにカスタマイズされたエピ蛍光を構築するには市販のコンポーネントと方法実験をFRETのためにそれを使用するからイメージングシステムをFRETについて説明します。

Abstract

フェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)顕微鏡は、生きた細胞や組織の生化学およびシグナリングイベントをリアルタイムに監視するための技術として注目を獲得し続けています。古典的な生化学的方法に比べて、この新しい技術は、高い時間·空間分解能を特徴としている。実験が発現 、in situ または in vivo 1-2 時間をかけて撮影することができる様々な遺伝的にエンコードされたバイオセンサーを使用するFRET。典型的なバイオセンサーは、どちらかのタンパク質の蛍光団タグ付きペアまたはドナーおよび3-4目的の分子に対する結合部位と相互接続アクセプタフルオロフォアを庇護する単一のタンパク質の立体構造変化の間のFRET測定することにより、タンパク質-タンパク質相互作用を報告することができます。タンパク質-タンパク質相互作用のための二分子バイオセンサーとしては、例えば、単分子センサー測定しながら、セル5内のGタンパク質の活性化を監視するために設計され構築基準にするコンフォメーション変化は、広くカルシウムなど6のような画像のセカンドメッセンジャーであるcAMP 7-8、イノシトールリン酸9およびcGMP 10月11日に使用されます。ここでは、カスタマイズされたエピ蛍光を構築する方法について説明し、単一の市販コンポーネントとマイクロマネージャーのフリーウェアを使用して全体の設定を制御するためのイメージングシステムをFRET。このシンプルでありながら強力な楽器は生細胞中のFRETルーチンや、より洗練された測定用に設計されています。取得された画像は、グラフィック形式で格納される前に、任意の実験中にリアルタイムにFRET比の変化を可視化するために、自己記述さ​​れたプラグインを使用して処理されますとの互換性がビルド内の後続のデータ解析に使用ImageJのフリーウェア。この低コストのシステムは高い柔軟性を特徴とし、正常に使用できるの過多により、様々な生化学的イベントやシグナル伝達分子を監視するために使用することができることは生きた細胞や組織におけるバイオセンサーをFRET。例として、我々は時間を示していβ-アドレナリン受容体作動薬と拮抗薬による刺激時のLive 293A細胞内のcAMPのリアルタイム監視を実行するために、このイメージングシステムを使用するための流れ。

Protocol

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1。 FRETイメージング顕微鏡のセットアップ

原則的には、研究室で利用可能で、カメラポートを持つ任意の倒立蛍光顕微鏡は、イメージングをFRETに適合させることができる。顕微鏡、追加のシャッターの有無にかかわらず、光源、放出光とCCDカメラ( 図1を参照)のために、ビームスプリッタ:最終的なセットアップは、以下の重要なコンポーネントを含める必要があります。ハードウェアデバイス、特に光源、シャッター、カメラに統合されており、画像収集と分析を行うことができ、イメージングソフトウェアによって制御されます。以下では、市販のコンポーネントから単純なFRETシステムを組み立てるための手順を説明します。

  1. 顕微鏡に光源を接続します。例えば、選択的にほとんどはバイオセンサーをFRETのドナーとして使用される強化シアン蛍光タンパク質(CFP)を励起単一波長の発光ダイオード(P、E-100、440 nmをCoolLED)を使用します。それが直接することができますLYと簡単に顕微鏡の落射照明用ポートに接続されている。同様の方法で接続することができる利用可能な多波長のLEDもあります。代わりにこのようなXBO75キセノンアークランプ(しばしばオリンパスとツァイスの顕微鏡に使用される)またはHBO水銀ランプ(通常はニコンの顕微鏡にインストールされている)として、LED、その他の標準的な光源を使用することができます。蛍光灯の場合には、また、あなたのサンプルに来る励起光のソフトウェアアシスト制御を可能にするためにランプや照明ポートとの間のシャッターを配置する必要があります。それが直接ソフトウェアによってオンとオフを切り替えることができるのでCoolLEDは、追加のシャッターを必要としません。様々なフィルタセットを持つ蛍光灯が複数と二分子バイオセンサーを操作する際は特に、もっと柔軟な選択肢である間、単一色LEDのシステムの欠点は、励起波長の数が限られています。あるいは、モノクロメータの光源( 例えばポリクロームV、TILLPhotonics)ができる使用される、彼らは通常のトリガ信号を介してソフトウェアを制御することができる統合されたシャッターを持っています。
  2. 顕微鏡に適切なフィルタキューブを置きます。 FRETペアとしてCFPと強化された黄色蛍光タンパク質(YFP)またはそれらの変異体のいずれかで測定をFRETルーチンのために、私たちはLEDが使用されている場合は省略することができますが、不可欠であるET436/30M励起フィルターを(含んでいる単純なフィルタキューブを使用キセノン​​または水銀ランプではなくLED)とDCLP455ダイクロイックミラーを使用しているとき。顕微鏡も計画 - フルオロ、プラン-neofluarまたはプラン·アポクロマート、40倍60倍または100倍の油浸対物レンズと、たとえば、良い分解能蛍光顕微鏡に適した目標に装備する必要があります。
  3. 蛍光灯のスイッチを入れ、光スポットが均等に視野に分散されているかどうかを確認します。この条件が満たされない場合、LEDやランプの追加のアラインメントは、試料の最適な照明を達成するために必要とされています。これは、パフォーマンスすることができます空間内のダイオードやランプを配置し、ネジを使用してのmed。
  4. 顕微鏡の排出ポートのいずれかにCマウントを介してビームスプリッタを接続します。たとえば、同時に単一のCCDカメラチップで監視することができる2つの(ドナーとアクセプター)のチャネルに放出光を分割DV2デュアルビュー(Photometrics)を使用します。あるいは、このようなOptosplit(ケアン研究)または浜松ORCA-D2二波長カメラに組み込まれ、ビームスプリッタなどの他の同等の製品があります。 CFP / YFP FRETペアのために、私たちはフィルタがDV2に付属して505dcxrダイクロイックミラープラスET480/30MそれぞれCFPとYFP用ET535/40Mエミッションフィルタを含む設定05-EMを使用しています。代わりに、ビームスプリッタ、ドナーのための2つのフィルターキューブ(CFP、DCLP455ダイクロイックミラーとCFP発光フィルター用ET436/30M励起フィルターを含む)とアクセプター(CFP励起フィルタ、DCLP455およびYFP発光フィルターを含む)のチャンネルはで使用されている多くはシステムをFRET。あるいは、カメラの前に任意の発光フィルタと自動発光フィルタホイール位置のない一つのフィルターキューブをインストールすることができます。この場合、電動顕微鏡またはレシオメトリックイメージングを実行するために〜200から300ミリ秒以内に2発光フィルターの位置の間のフィルターホイールを交互に行います。イメージングではなく、両チャネルの本当に同時取得は重要ではないのcAMPシグナル、細胞内のプロセスを遅くする場合は、このマイナー遅れは許容されます。
  5. ビームスプリッタにCCDカメラを(例えば浜松ホトニクスからORCA-03GまたはORCA-R2の使用)を接続します。カメラに付属のマニュアルに記載されているように、IEEE1394コンピュータインタフェースにカメラを接続するためのFireWireケーブルを使用します。カメラに切り替えることなく、カメラのドライバをインストールします。
  6. 最後に、コンピュータと光源との間の通信を確立するために、LEDやtにArduinoのI / Oボード(例ArduinoのDuemilanoveやArduinoの宇野のための使用)を接続し図2に示すように、ピンGND(0)して、ボードの8に接続されたLED側ともう一方の端にある2つのシングルワイヤーで通常のBNCプラグが含まれているはずですBNCケーブルを使用してシャッターをO。組み立てられたボードは、直接お使いのコンピュータのUSBポートに接続することができます。

2。イメージングソフトウェアをセットアップする

カメラによる撮像を有する光源を制御し、同期させるには、イメージングソフトウェアをコンピュータにインストールする必要があります。 MetaFluor(Molecular Devices社)、Slidebook(インテリジェント·イメージング·イノベーション)、VisiView(Visitronシステム)など、いくつかの市販のソフトウェアパッケージがあります。ここでは、低コストのイメージングのための高い柔軟性を提供していますオープンソースのマイクロマネージャフリーウェアの使用方法を示しています。

  1. でこのソフトウェアをダウンロードhttp://valelab.ucsf.edu/〜MM / MMwiki /インデックス。PHP /マイクロManager_Version_Archive。我々は簡単に我々の手で設定可能である1.4.5のリリースをインストールすることをお勧めします。
  2. お使いのコンピュータのUSBポートにArduinoのボードを接続します。からArduinoのボードを制御するソフトウェアダウンロードhttp://www.arduino.cc/en/Main/softwareを 。このウェブサイト上で見つけるの指示に従って、このソフトウェアをマイクロマネージャー起動する前に一度だけ実行してください。マイクロManagerソフトウェアでボードを使用するためのコードをアップロードしてください。コードでダウンロードすることができますhttp://valelab.ucsf.edu/〜MM / MMwiki / index.phpを/アルドゥイーノ
  3. LEDやカメラのスイッチを入れます。ソフトウェアを起動し、[ツール]> [ハードウェアの構成ウィザード( 図3を参照)を選択することにより、カメラとLED(他の光源とシャッター)によるマイクロマネージャー通信を構成します。お使いのカメラなどの必要なコンポーネントを追加( すなわちHamamatsu_ DCAM)とArduinoのボード(Arduinoのスイッチアルドゥイーノ-ハブArduinoのシャッターデバイスを追加します)。次のステップの間に、ウィザードによって提案されたデフォルト設定を使用します。ウィザードの指示に従って、新しいシステム構成を保存します。
  4. [ツール]> [デバイスのプロパティブラウザを開くには、メインメニューを使用します。 "Arduinoのスイッチの状態"までスクロールダウンし、 "1"を選択します。ダイアログを閉じます。 "オートシャッター"ボックスがメインソフトウェアのダイアログでチェックされていることを確認してください。ファイルを押して>ソフトウェアを起動した後にいつでも開かれるべきソフトウェアのコンフィギュレーションを保存するにはシステム状態を保存します。これにより、ボードと画像取得を実行するために必要なソフトウェア間の通信を確立します。
  5. カメラからの信号をモニターするために "ライブ"ボタンを押してください。蛍光灯が "ライブ"または "スナップ"機能が選択されている任意の時間に行くことを確認してください。最初の測定を開始する前に、あたりにビームスプリッタに付属の指示に​​従ってください両チャンネルの光学的アライメントを形成している。

3。細胞培養およびトランスフェクション

  1. オートクレーブしたラウンド24ミリメートルのガラスcoverslides(ウェル当たり1 coverslide)で6ウェルプレートを準備します。あるいは、ガラス底細胞培養皿を使用することができます。
  2. 細胞は1日後にコンフルエントに50から70パーセントに到達するようにD-MEM培地でプレート板や皿の上に293A細胞(10%FCS、1%L-グルタミンおよび1%ペニシリン/ストレプトマイシン溶液を補充)。
  3. めっき後の24時間は、リン酸カルシウムトランスフェクション法(3.5参照)を用いてプラスミドFRETセンサーと層流ベンチで細胞をトランスフェクトする。 cAMPのバイオセンサーのプラスミドは、要求に応じて我々のグループから取得することができます。リーダーはまた、他のcAMPバイオセンサーを記述する包括的なレビュー7,8と呼ばれています。
  4. 初めて細胞をトランスフェクトする前に、トランスフェクション試薬を準備します。の2.5M CaCl 2および2xBBSソリューションを構成している(後者は含む1.5mMののNa 2 HPO 4、50mMのBES、280 mMのNaCl、NaOHでpHを6.95に調整)を脱イオン水インチ無菌ろ正規0.2μmのフィルターを使用してソリューションを提供しています。
  5. の6ウェルプレートまたは6ガラス底皿をトランスフェクトするために、ミックス10μgのは、最大500μlに2.5M CaCl 2溶液の滅菌水センサープラスミド50μlをFRET。よく混ぜる。
  6. 2倍のBBSの500μlを添加する。よく混合し、室温で10分間混合物をインキュベートする。
  7. トランスフェクション混合物をピペットで165μLを各ウェルまたは皿の上に滴下した。そっと板をかき混ぜるとインキュベーターに戻します。細胞は、通常、トランスフェクション後24時間測定するFRETの準備ができている。これは、いくつかの細胞表面受容体の活性に影響を及ぼす可能性があるので、細胞が、この時点でコンフルエントに達していないことを確認してください。

4。生細胞内で測定するFRET

  1. 初めて測定する前に、144 mMのNaCl、5.4 mMのKClを、1を含むFRETバッファを用意mMのMgCl 2、2mMのCaCl 2、脱イオン水で10mMのHEPESおよびNaOHで7.3にpHを調整する。 FRETバッファを使用してイメージング実験で使用される化合物を希釈します。
  2. イメージングソフトウェアを起動します。以前に定義されたシステムコンフィギュレーションをロードします。以前に構成されたシステム状態を選択し[ファイル]> [ロードシステム状態を選択します。
  3. イメージング室( 例えば Attofluorセルチャンバー)等に付着したトランスフェクトされた293A細胞とcoverslideをマウントします。バッファをFRETで一回細胞を洗浄し、バッファをFRETの400μlを添加する。ときに接着細胞を洗い、皿当たり緩衝液2mlを加えガラス底細胞培養皿を用いた。私たちには、CO 2制御は必要ありませんので、HEPESを含むFRETバッファに室温ですべての測定を実行する。
  4. 客観的にいくつかの液浸油を入れて、上に結像顕微鏡室を移す。透視光を用いた細胞層に焦点を当てています。
  5. 蛍光LIG上のスイッチ"ライブ"ボタンを押して、HT、および実験用のセルを選択します。それはあまりにも明るく、暗すぎないではないがあるべきである、最適なセンサー式でセルを選択してください。適切な細胞を見つけた後、FRETセンサーの光退色を避けるために直ちに蛍光灯のスイッチを切ります。
  6. "スナップ"ボタンを押した後に取得された画像の良好な信号対雑音比を導く方法で "カメラ設定"(通常は10から50ミリ秒)の下で露光時間を調整します。低画質では短すぎる倍の結果ながら、あまりにも長い励起時間は、退色が発生する場合があります。
  7. "マルチ - D ACQ"を押してくださいボタンとタイム·ポイント数と画像取得の時間間隔を設定します。当社のcAMP-FRETセンサーのために、私たちは5秒ごとに一枚の画像を取得する。
  8. "Acquire"ボタンを押して測定を開始します。
  9. 任意の測定中に、1つは"オンラインFRET"プラグイン( オンラインサプリメントで利用可能な、すべてのプラグインが警官である必要があります使用することができますオンラインFRET比の変更を監視する)、それを起動する前に、あなたのマイクロManagerソフトウェアの "plugins"フォルダにiedを。このプラグインを実行し、 "フリーハンドの選択"ツールを使用してFRET比画像の関心領域を選択します。 ROIのマネージャに領域を追加し、 "タイム·シリーズ·アナライザ"ウィンドウ内の "Get平均"ボタンを押してください。比のトレースが表示されますFRET。測定中にトレースを更新するには、 "FRETratioOnline2"プラグインを実行し、 "GetAverage"ボタンを押してください。
  10. できるだけ早くFRETとして比率が安定したベースラインが正確に皿/チャンバーにそれをピペッティングすることにより、所望の化合物を適用するに達している。薬理学的化合物で細胞を治療するには、代わりに単純なピペッティングの灌流システムは、この段階で使用することができます。
  11. 実験を終えた後、画像のタイムラプススタックを保存します。顕微鏡から測定チャンバーを取り外して、客観的な組織を用いて客観的に清掃してください。
  12. で測定を繰り返す4.3のステップに戻ります新しいサンプル。

5。オフラインデータ解析

FRETイメージングデータはImageJのソフトウェアを使用して実験した後、いつでもオフラインで分析することができます。このプロトコルを補完するものとして、私たちは "FREToffline"プラグインは、ドナーとアクセプターのチャンネルに取得した画像を分割するために、対象となる複数の地域で蛍光強度を測定するために、我々の研究室で使用されています。これらの強度はさらに比率をFRET訂正を計算するExcelや起源スプレッドシートにコピーペーストすることができます。単分子FRETバイオセンサーの変化を可視化するために、単純なratiometryが用いられることが多い。この場合、唯一のドナーフルオロフォア(CFP)が励起され、二つの画像はCFPとYFP発光ピークで撮影されます。計算されたYFP / CFP比(時には、CFP / FRET比と呼ぶ)は、2つの蛍光色素分子間のFRETの程度を表しています。単分子バイオセンサーでは、CFPとYFPの部分の数字は単純なratiometryが十分であるように、等しいFRET効率は12を表すにcient。

  1. [プラグイン]> [マイクロマネージャ]> [開く]マイクロマネージャーファイルを選択することにより、実験ファイルを開くにはImageJのソフトウェアを使用してください。
  2. 個々のCFPとYFPのチャンネルにタイムラプススタックを分割する "FREToffline"プラグインを実行します。
  3. バックグラウンド補正が必要な場合、これはImageJのソフトウェアを使用して行うことができる。
  4. 画像のYFPをスタック上にクリックして、1つ以上の "フリーハンドの選択"ツールを使用して関心のあるいくつかの領域を選択し、 "追加"ボタンを押すことで、ウィンドウ内のプラグイン "MultiMeasure"に追加します。
  5. "MultiMeasure"ウィンドウの関心の領域を選択して、各フレームと各領域の平均グレイ値を持つテーブルを取得するために "マルチ"を押してください。 Ctrlキーを使用して、すべてを選択することにより、クリップボードにデータをコピー+とCtrl + Cキーを押すことにより、 Excelや起源スプレッドシートを開き、Ctrl + Vキーを押して、データを貼り付ける
    プログラムによって実行される測定が>セットMを分析の下に設定することができますあなたが測定されるパラメータを定義することができますeasurements。我々は通常のみ、このダイアログボックスで、 "グレー値の平均値"を選択します。
  6. 画像のCFPのスタックにクリックします。 5.5で説明したように同じことを実行します。同じExcelやOriginのスプレッドシートにCFPの強度データを貼り付けます。
  7. ExcelやOriginソフトウェアを使用して、修正されたFRET比を計算する。シンプルな単鎖単分子バイオセンサーを撮像する場合、我々は唯一のアクセプター·チャネルへのドナー蛍光のbleedthroughを修正。この場合、訂正アクセプタ/ドナー比は次のとおりです。
    比=(YFP - B X CFP)/ CFP
    ここで、Bは、CFPとYFPプラスミドチャネル(B = YFP / CFP)のドナー蛍光の割合を測定すると細胞をトランスフェクトすることによって決定することができる補正係数である。それが唯一の曲線の形状上の任意の質的な影響を与えることなく、FRET応答の全体的な振幅に影響を与えるので、単分子バイオセンサーは、この補正を省略すると、可能性があります。
jove_title "> 6。代表的な結果

図1は、完全組み立ての例はCoolLEDニコン倒立顕微鏡、DV2デュアルビュー、浜松ORCA-03G CCDカメラで構成される画像の設定をFRET。示しハードウェアコンポーネントとコンピュータ間の通信を確立するには、I / OのArduinoボードがコンピュータに接続され、 図2に示すようにCoolLEDする。同期化された方法で、カメラでキャプチャし、光源と画像を制御するには、マイクロManagerソフトウェアをインストールする必要があり、適切に構成します図3を参照)。このフリーウェアは簡単にプラグインが必要なを追加して、個々の実験的なニーズに適合させることができます。 図4Aは、代表的な生は、β-アドレナリン作動薬の効果をモニターする293A細胞で発現Epac1-キャンプ13のcAMPセンサーを用いて測定値から比トレースをFRET示しイソプロテレノールは、時刻150秒で適用され、&賭ける;プロプラノロールブロッカーは、時刻300秒(4.3から4.10で説明されるように行われた)で追加された。訂正を得るために5.1から5.7で説明したように、これらのデータは、オフラインとYFPチャンネルにCFPのbleedthroughを補正し分析することができ、図4Bに示す割合トレースをFRET。この代表的な実験では、細胞内cAMPの増加を示し、イソプロテレノール処置によりFRET監視比で遅い減少を示す。 β遮断薬とプロプラノロールは基底レベルにcAMPの減少につながる、イソプロテレノール信号を反転させます。 FRETシグナルにおけるこれらの変化は、どの実験(のように4.9で説明します)の間にオンラインで監視することができます。このような実験は異なるセカンドメッセンジャーまたは生化学的プロセスを監視するために設計され、一般的に使用されるバイオセンサーの様に行うことができる。

図1
図1に、CoolLED成るFRETイメージングセットアップのレイアウトvertedニコン顕微鏡、DV2デュアルビュー、およびORCA-03G CCDカメラ。

図2
図2のArduino I / Oボードとその接続。ボードは自己マウントプラスチックの箱に配置されている。標準のBNCケーブルは8ピンと基板のGND(0)にLEDを接続します。

図3
ハードウェアの構成ウィザードを使用して、システム·コンポーネントの統合を示す図3スクリーン)ハードウェア·コンフィギュレーション·ウィザードを起動します。2.3で述べたようにB)が必要なデバイスを追加します。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください

図4
図4代表がexperimenのFRETEpac1-293Aキャンプでトランスフェクトした細胞内のcAMPレベルを測定トン。まず、細胞(YFP / CFPのFRET比の低下として観察)cAMPを増加させるβ-アドレナリン作動薬のイソプロテレノール(100 nMで、フレーム30または150で秒で)で刺激した。細胞はその後のcAMPの減少を反映し、FRET比の増加につながるプロプラノロールのβ-ブロッカー(秒フレーム60℃または300℃、10μM)で処理した。)原材料オンラインでは、対応する関心の1つの領域から比トレースをFRETオフラインデータ解析として5.1から5.7で説明を行った後、実験中に監視単一のセルに。B)の比率トレースを修正しました。

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Discussion

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このプロトコルでは、我々は可能なバイオセンサーの様々なルーチンアプリケーション用のシンプルで低コストでありながら強力なFRETイメージングシステムを構築する方法を示します。ここで紹介するシステムは、ドナー - アクセプターペアとして、CFPとYFP、または蛍光タンパク質の類似したタイプのために設計されています。一方、他の個々のバイオセンサーは、例えば14を緑色と赤色蛍光タンパク質を使用しているか使用可能になります。他の色について説明しているシステムを適応させるために、適切な光源および/またはフィルタセットを選択する必要があります。 LEDの場合、緑色蛍光タンパク質を励起するために例えば別の単一のLEDライン、波長490nmを使用することができます。単一波長のLEDがマウント解除され、交換された(数秒以内)簡単にすることができます。あるいは、様々な蛍光タンパク質( 例えば、PE-2 CoolLED)励起するために複数の行が含まれている使用可能なLEDアレイがあります。代替手段を使用して測定を有効にするにはペアをFRET、他の蛍光フィルターキューブはmicroscに配置することができます OPE、最終的に放射ビームスプリッターフィルターは交換する必要があります。 PhotometricsはDV2デュアルビューのための追加の発光フィルタースライダーを提供しています。いくつかの最近開発されたアプリケーションは、たとえばキャンプに、同時に複数のプロセスを監視するために、同時に2つ以上のバイオセンサーを使用して1つのセル15で一緒にCGMP。この場合、4つの発光チャネルを含むQuadView(Photometrics)を使用することができ、画像の分割と解析のためのImageJのプラグインは、その後、4つのチャンネルで使用するように適合させることができると2つの比率を計算するFRET。 ImageJのソフトウェアは、画像解析と結果のオンライン表現の面で非常に柔軟です。単純なテキスト編集プラグインは、任意の個々のイメージングシステムと実験のニーズにソフトウェアアルゴリズムの適応を可能にする。これは、時には非常に有益であり、彼らは任意の商用ソフトウェアパッケージに実装されなければならない長い時間を必要とすることができる技術的な問題への迅速なソリューションを提供しています。

コンテンツ ">実験をFRET行う場合、それは励起時間が長すぎる場合や、画像があまりにも頻繁に取られている場合、この場合には、光誘起化学的損傷またはフルオロフォアの共有結合修飾が発生する可能性があります表示され退色を避けるために重要であり、 FRET効率減少。退色を避けるためには、露光時間と画像取得の頻度を減らすことができますもこの現象を補正するためのプロトコル12,16が確立されいる。データ解析時には、それは間のクロストークを補正することが可能であるドナーとアクセプター·チャネル(bleedthrough)。単分子を使用して簡単なレシオメトリック測定用(ドナーとアクセプタフルオロフォアが常に同じレベルで発現されている場合に)バイオセンサーをFRETは、ドナーアクセプターへのbleedthroughためだけに修正するために十分なことができますチャネルまたはそれは質的にFRET比曲線の形状に影響を与えないためであっても完全にこの補正を省略します。番目のbleedthroughドナーチャネルに電子受容体は通常はわずかです。二つの異なるタンパク質からなる二分子バイオセンサーが使用されている場合、これらは様々なレベルで発現させることができる。このケースでは、440 nmの光によるbleedthrough補正と直接YFPを励起するための追加補正もお勧めです。 、すべての補正手順が詳細に記載されている公開プロトコル12を参照してください。バイオセンサーの開発に関するその他の包括的な情報は、顕微鏡をFRET、技術およびデータ解析についての可能な落とし穴は、以前に公開されたプロトコルが17-18で利用可能です。結論として、ここで説明する単純かつ強力なイメージングシステムは、生細胞中の高時間空間分解能での様々な生化学的イベントやシグナル伝達分子を監視するための柔軟なプラットフォームを提供します。

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Disclosures

特別な利害関係は宣言されません。

Acknowledgments

著者は、技術支援のためのアンケRüttgerothとカリーナジマーマンに感謝したいと思います。この作品は、ドイツ学術振興(VONに助成NI 1301/1-1)とゲッティンゲン大学医療センター(VONに "プロフューチュラ"グラント)によってサポートされていました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BES Buffer Grade AppliChem A1062
CaCl2 dihydrate Sigma-Aldrich C5010
Glass coverslides Thermo Scientific 004710781 Diameter 24 mm
Glass-bottomed cell-culture dishes World Precision Instruments FD3510-100
D-MEM medium Biochrom AG F0445
Fetal calf serum (FCS) Thermo Scientific SH30073.02
L-Glutamine Biochrom AG K0283
HEPES Sigma H4034
KCl Sigma P5405
MgCl2 hexahydrate AppliChem A4425
NaCl AppliChem A1149
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S9707
Penicillin/Streptomycin Biochrom AG A2213
Inverted fluorescent microscope e.g. Nikon Request at Nikon
CoolLED CoolLED pE-100 440 nm
DualView Photometrics DV2-SYS
DualView filter slider Photometrics 05-EM
CFP/YFP filter set Chroma Technology 49052 without the emission filter
ORCA-03G camera Hamamatsu Photonics C8484-03G02
Arduino I/O board Sparkfun Electronics DEV-00666
Attofluor cell chamber Invitrogen A-7816
Personal computer with WindowsXP or Windows7 system Any supplier Include hard-drive with high capacity

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References

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単分子バイオセンサーを用いた生細胞中のシグナル伝達事象をリアルタイムで監視するための顕微鏡のFRET
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Sprenger, J. U., Perera, R. K., Götz, K. R., Nikolaev, V. O. FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors. J. Vis. Exp. (66), e4081, doi:10.3791/4081 (2012).More

Sprenger, J. U., Perera, R. K., Götz, K. R., Nikolaev, V. O. FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors. J. Vis. Exp. (66), e4081, doi:10.3791/4081 (2012).

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