FRET mikroskopi för realtidsövervakning av signalering händelser i levande celler Använda unimolekylära Biosensorer
Summary
Förster resonans (FRET) mikroskopi är en kraftfull teknik för realtidsövervakning av signalering händelser i levande celler med olika biosensorer som reportrar. Här beskriver vi hur man bygger en anpassad epifluorescens FRET bildsystem från kommersiellt tillgängliga komponenter och hur man använder den för FRET experiment.
Abstract
Förster resonans (FRET) mikroskopi fortsätter att vinna ökat intresse som en teknik för realtidsövervakning av biokemiska och signalering händelser i levande celler och vävnader. Jämfört med klassiska biokemiska metoder är denna nya teknik kännetecknas av hög temporal och spatial upplösning. FRET experiment använder olika genetiskt kodade biosensorer som kan uttryckas och avbildas med tiden in situ eller in vivo 1-2. Typiska biosensorer kan antingen rapportera protein-proteininteraktioner genom att mäta FRET mellan en fluorofor-märkt par av proteiner eller konformationsförändringar i ett enda protein som härbärgerar donator-och acceptormolekyler sammankopplade med en bindande del för en molekyl av intresse 3-4. Bimolekylära biosensorer för protein-proteininteraktioner inkluderar, till exempel, konstruktioner utformats för att övervaka G-protein-aktivering i celler 5, medan de unimolekylära sensorerna MEASuring konformationsförändringar används ofta för att bilden sekundära budbärare såsom kalcium 6, 7-8 cAMP, inositolfosfater 9 och cGMP 10-11. Här beskriver vi hur man bygger en anpassad epifluorescens FRET bildsystem från enstaka kommersiellt tillgängliga komponenter och hur man kan kontrollera hela installationen med hjälp av Micro-Manager freeware. Denna enkla men kraftfulla verktyg är utformat för rutinmässiga eller mer sofistikerade FRET mätningar i levande celler. Förvärvade bilder bearbetas med egen skriftlig plug-ins för att visualisera förändringar i FRET förhållande i realtid under några experiment innan de lagras i ett grafiskt format som är kompatibelt med inbyggd ImageJ gratisprogram som används för efterföljande dataanalys. Detta låg kostnad system kännetecknas av hög flexibilitet och kan med framgång användas för att övervaka olika biokemiska händelser och signalmolekyler genom en uppsjö av tillgängliga FRET biosensorer i levande celler och vävnader. Som ett exempel, visar vi hOW att använda denna avbildning för att utföra realtidsövervakning av cAMP i levande 293A celler vid stimulering med en β-adrenergisk receptoragonist och blockerare.
Protocol
Discussion
i detta protokoll visar vi hur man bygger en enkel billig men kraftfull FRET avbildning för rutinmässiga tillämpningar med olika tillgängliga biosensorer. Systemet som presenteras här är utformat för GFP och YFP, eller liknande typer av fluorescerande proteiner, som donator-acceptor-par. Samtidigt andra enskilda biosensorer blir tillgängliga som använder till exempel gröna och röda fluorescerande proteiner 14. För att anpassa det beskrivna systemet för andra färger, bör lämpliga ljuskällor oc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Anke Rüttgeroth och Karina Zimmermann för tekniskt stöd. Detta arbete stöddes av Deutsche Forschungsgemeinschaft (bidrag NI 1301/1-1 till VON) och universitetet i Göttingen Medical Center ("Pro Futura" bidrag till VON).
Materials
| Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments |
| BES Buffer Grade | AppliChem | A1062 | |
| CaCl2 dihydrate | Sigma-Aldrich | C5010 | |
| Glass coverslides | Thermo Scientific | 004710781 | Diameter 24 mm |
| Glass-bottomed cell-culture dishes | World Precision Instruments | FD3510-100 | |
| D-MEM medium | Biochrom AG | F0445 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Thermo Scientific | SH30073.02 | |
| L-Glutamine | Biochrom AG | K0283 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| MgCl2 hexahydrate | AppliChem | A4425 | |
| NaCl | AppliChem | A1149 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S9707 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom AG | A2213 | |
| Inverted fluorescent microscope | e.g. Nikon | Request at Nikon | |
| CoolLED | CoolLED | pE-100 | 440 nm |
| DualView | Photometrics | DV2-SYS | |
| DualView filter slider | Photometrics | 05-EM | |
| CFP/YFP filter set | Chroma Technology | 49052 | without the emission filter |
| ORCA-03G camera | Hamamatsu Photonics | C8484-03G02 | |
| Arduino I/O board | Sparkfun Electronics | DEV-00666 | |
| Attofluor cell chamber | Invitrogen | A-7816 | |
| Personal computer with WindowsXP or Windows7 system | Any supplier | Include hard-drive with high capacity |
References
- Zaccolo, M. Use of chimeric fluorescent proteins and fluorescence resonance energy transfer to monitor cellular responses. Circ. Res. 94, 866-873 (2004).
- Mehta, S., Zhang, J. Reporting from the field: genetically encoded fluorescent reporters uncover signaling dynamics in living biological systems. Annu. Rev. Biochem. 80, 375-401 (2011).
- Zhang, J., Campbell, R. E., Ting, A. Y., Tsien, R. Y. Creating new fluorescent probes for cell biology. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3, 906-918 (2002).
- Miyawaki, A. Visualization of the spatial and temporal dynamics of intracellular signaling. Dev. Cell. 4, 295-305 (2003).
- Bunemann, M., Frank, M., Lohse, M. J. Gi protein activation in intact cells involves subunit rearrangement rather than dissociation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 16077-16082 (2003).
- Kotlikoff, M. I. Genetically encoded Ca2+ indicators: using genetics and molecular design to understand complex physiology. J. Physiol. 578, 55-67 (2007).
- Willoughby, D., Cooper, D. M. Live-cell imaging of cAMP dynamics. Nat. Methods. 5, 29-36 (2008).
- Nikolaev, V. O., Lohse, M. J. Monitoring of cAMP synthesis and degradation in living cells. Physiology (Bethesda). 21, 86-92 (2006).
- Tanimura, A. Use of Fluorescence Resonance Energy Transfer-based Biosensors for the Quantitative Analysis of Inositol 1,4,5-Trisphosphate Dynamics in Calcium Oscillations. J. Biol. Chem. 284, 8910-8917 (2009).
- Nikolaev, V. O., Lohse, M. J. Novel techniques for real-time monitoring of cGMP in living cells. Handb. Exp. Pharmacol. , 229-243 (2009).
- Nausch, L. W., Ledoux, J., Bonev, A. D., Nelson, M. T., Dostmann, W. R. Differential patterning of cGMP in vascular smooth muscle cells revealed by single GFP-linked biosensors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 365-370 (2008).
- Borner, S. FRET measurements of intracellular cAMP concentrations and cAMP analog permeability in intact cells. Nat. Protoc. 6, 427-438 (2011).
- Nikolaev, V. O., Bunemann, M., Hein, L., Hannawacker, A., Lohse, M. J. Novel single chain cAMP sensors for receptor-induced signal propagation. J. Biol. Chem. 279, 37215-37218 (2004).
- Hong, K. P., Spitzer, N. C., Nicol, X. Improved molecular toolkit for cAMP studies in live cells. BMC Res. Notes. 4, 241-24 (2011).
- Niino, Y., Hotta, K., Oka, K. Simultaneous live cell imaging using dual FRET sensors with a single excitation light. PLoS One. 4, e6036 (2009).
- Palmer, A. E., Tsien, R. Y. Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators. Nat. Protoc. 1, 1057-1065 (2006).
- Brumbaugh, J., Schleifenbaum, A., Stier, G., Sattler, M., Schultz, C. Single- and dual-parameter FRET kinase probes based on pleckstrin. Nat. Protoc. 1, 1044-1055 (2006).
- Aoki, K., Matsuda, M. Visualization of small GTPase activity with fluorescence resonance energy transfer-based biosensors. Nat. Protoc. 4, 1623-1631 (2009).
