Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Unimoleküler Biyosensörler kullanma Canlı Hücreler Olaylar Sinyal gerçek zamanlı izlenmesi için Mikroskopi FRET

doi: 10.3791/4081 Published: August 20, 2012

Summary

Förster rezonans enerji transferi (FRET) mikroskopi gazetecilere gibi çeşitli biyosensör kullanılarak canlı hücrelerde olayların sinyalizasyon gerçek zamanlı izleme için güçlü bir tekniktir. Burada nasıl bir özelleştirilmiş Epifloresans oluşturmak için ticari olarak mevcut bileşenleri ve nasıl deneyler FRET için kullanmak, görüntüleme sistemi FRET tarif.

Abstract

Förster rezonans enerji transferi (FRET) mikroskopi canlı hücrelerin ve dokuların biyokimyasal ve sinyalizasyon olaylar gerçek zamanlı izleme için bir teknik olarak artan faiz kazanmaya devam ediyor. Klasik biyokimyasal yöntemler ile karşılaştırıldığında, bu yeni teknolojinin yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlük ile karakterizedir. Deneyler ifade ve in situ veya in vivo 1-2 zamanla yansıması çeşitli genetik olarak kodlanmış biyosensör kullanın FRET. Tipik biyosensörler ya proteinlerin fluorofor tagged çifti veya donör ve 3-4 ilgi bir molekül için bağlayıcı bir parçası ile birbirine muhatap floroforlar barındıran tek bir proteinin konformasyon değişikliğine arasındaki FRET ölçerek protein-protein etkileşimleri bildirebilirsiniz. Protein-protein etkileşimleri için Bimoleküler biyosensörler, örneğin, sırasında tek moleküllü sensörler mea, hücreler 5 G-protein aktivasyonu izlemek için tasarlanmış yapılarısuring konformasyonel değişiklikler yaygın olarak kalsiyum 6, cAMP 7-8, inositol fosfatların 9 ve cGMP 10-11 gibi görüntü ikinci haberciler için kullanılır. Burada nasıl bir özelleştirilmiş Epifloresans oluşturmak için tek ticari olarak mevcut bileşenleri ve nasıl Micro-Manager ücretsiz kullanarak tüm kurulum kontrol etmek için gelen görüntüleme sistemi FRET tarif. Bu basit ama güçlü bir araç canlı hücrelerde FRET rutin veya daha karmaşık ölçümler için tasarlanmıştır. Edinilmiş görüntüler bir grafik biçiminde depolanan önce herhangi bir deney sırasında gerçek zamanlı olarak FRET oranı değişiklikleri görmenizi kendine yazılmış eklentileri kullanarak işlenir ile uyumlu yapı-izleyen veri analizi için kullanılan ImageJ ücretsiz. Bu düşük maliyetli sistem yüksek esneklik ile karakterizedir ve başarıyla kullanılabilir bir bolluk ile çeşitli biyokimyasal olaylar ve sinyal molekülleri izlemek için kullanılabilir canlı hücre ve dokularda biyosensörler FRET. Bir örnek olarak, saat göstermekBir β-adrenerjik reseptör agonist ve engelleyicisi ile uyarılması üzerine canlı 293A hücrelerde cAMP gerçek zamanlı izleme gerçekleştirmek için bu görüntüleme sistemi kullanmak için ow.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Kurma Bir Görüntüleme Mikroskop FRET

Prensip olarak, laboratuar mevcuttur ve kamera bağlantı noktası olan herhangi bir ters floresan mikroskop görüntüleme FRET için adapte edilebilir. Bir mikroskop, bir ışık kaynağı veya ek deklanşör, emisyon ışık ve bir CCD kamera (bkz. Şekil 1) için bir ışın ayırıcı olmadan: Son kurulum aşağıdaki önemli bileşenleri içermelidir. Donanım aygıtları, özellikle ışık kaynağı, çekim ve kamera entegre ve görüntü alma ve analiz sağlayan görüntüleme yazılımı tarafından kontrol edilir. Aşağıda piyasada bulunan bileşenleri basit bir FRET sistemi oluşturmak için bir prosedür açıklanmaktadır.

  1. Mikroskop için ışık kaynağı bağlayın. Örneğin, seçici çoğunda bir donör olarak kullanılan gelişmiş mavi floresan proteini (OBP) biyosensörler FRET heyecanlandıran tek dalga boyunda ışık yayan diyot (p E-100, 440 nm) COOLLED kullanın. Bu doğrudan olabilirly ve kolayca mikroskop Epifloresans aydınlatma noktasına bağlanır. Benzer bir şekilde bağlanabilir mevcut çok dalga boylu LED da vardır. Bunun yerine bu tür XBO75 ksenon ark lambası (genellikle Olympus ve Zeiss mikroskobu için kullanılan) veya cıva lamba HBO (genellikle Nikon mikroskop yüklü) gibi LED, diğer standart bir ışık kaynağı olarak kullanılabilir. Bir floresan lamba durumunda, ayrıca lamba ve örnek binmesini uyarma ışık yazılım destekli denetimini etkinleştirmek için aydınlatma noktası arasına bir deklanşör koymalısın. Doğrudan yazılım tarafından açık ve kapalı olabilir beri COOLLED herhangi bir ek deklanşör gerektirmez. Birden çok moleküllü ve biyosensörleri ile çalışan, özellikle de değişik filtre setleri ile bir floresan lamba, daha esnek bir seçenek ise tek-renkli LED sistemlerin dezavantajı, eksitasyon dalga boyu sınırlı bir sayıdır. Alternatif olarak, monokromatör ışık kaynağının (örneğin Polikrom V, TILLPhotonics) olabilirkullanılan, genellikle bir tetik sinyali üzerinden yazılım kontrollü olabilir entegre bir çekim var.
  2. Mikroskop içine uygun bir filtre küpü yerleştirin. Rutin için CFP ve gelişmiş sarı floresan protein (YFP) veya bir FRET çifti olarak onların türevlerinden ile ölçümleri FRET, biz LED kullanıldığında ihmal edilebilir bir ET436/30M eksitasyon filtresi (içeren basit bir filtre küp kullanmak, ancak vazgeçilmezdir xenon veya cıvalı lamba yerine LED) ve bir DCLP455 dikroik ayna kullanırken. Mikroskop da 40x bir plan-fluor, Plan-neofluar veya planı-apochromat, 60x veya 100x yağ daldırma objektif ile, örneğin, iyi bir çözünürlüğe floresan mikroskobu için uygun bir amacı ile donatılmış olmalıdır.
  3. Floresan ışık açın ve ışık noktası eşit görüş alanında dağılmış olup olmadığını kontrol edin. Bu durumda değilse, ek LED hizalama veya lamba numunenin optimum aydınlatma sağlamak için gereklidir. Bu performans olabilirUzayda diyot veya lamba konumlandırmak vidaları kullanarak med.
  4. Mikroskop emisyon noktalarından birine bir C-mount ile kiriş-splitter bağlayın. Örneğin, aynı anda tek bir CCD kamera çip üzerinde izlenebilir iki (verici ve alıcı) kanal içine emisyon ışık böler DV2 DualView (Fotometrik) kullanın. Alternatif olarak, bu tür Optosplit (Cairn Araştırma) veya Hamamatsu ORCA-D2 çift dalgaboyu kamera entegre bir demeti splitter olarak karşılaştırılabilir diğer ürünler vardır. CFP / YFP FRET çifti için, kullandığımız 05-EM DV2 birlikte verilen sırasıyla 505dcxr dikroik ayna artı ET480/30M ve CFP ve YFP için ET535/40M emisyon filtreleri içeren set filtre. Bunun yerine bir ışın ayırıcı, iki filtre donör için küpler (OBP, DCLP455 dikroik ayna ve CFP emisyon filtresi için ET436/30M eksitasyon filtresi içeren) ve alıcı (CFP eksitasyon filtresi, DCLP455 ve YFP emisyon filtresi içeren) kanalları kullanılmaktadırbirçok sistem FRET. Alternatif olarak, kamera önce herhangi bir emisyon filtresi ve otomatik emisyon filtresi tekerlek pozisyonu olmayan bir filtre küp takılabilir. Bu durumda, bir motorlu bir mikroskop veya ~ 200-300 ms içinde iki emisyon filtre pozisyonları arasında filtre tekerlek dönüşümlü rasyometrik görüntüleme gerçekleştirmek için. Iki kanal gerçekten eşzamanlı edinimi önemli olmadığı görüntüleme yerine cAMP sinyalleri olarak intraselüler süreçler, yavaş olduğunda bu küçük gecikme kabul edilebilir.
  5. Işın ayırıcıya CCD kamera (örneğin ORCA-03G veya Photonics gelen ORCA-R2 için kullanımı) bağlayın. Kamera ile birlikte verilen kılavuzda açıklandığı gibi, IEEE1394 bilgisayar arayüzü için kamera bağlamak için bir FireWire kablosu kullanın. Kamerayı açmadan kamera sürücüleri yükleyin.
  6. Son olarak, bilgisayar ve ışık kaynağı arasındaki iletişimi kurmak için, LED veya t Arduino I / O kartı (örneğin Arduino Duemilanove ya Arduino Uno için kullanın) bağlayınŞekil 2'de gösterildiği gibi işaretçilerine GND (0) ve yönetim kurulu 8 içine bağlanmış LED yan ve diğer ucunda iki adet tek teller üzerinde normal BNC fiş içermesi gereken bir BNC kablo ile deklanşör o. Monte kurulu doğrudan bilgisayarınızın bir USB bağlantı noktasına bağlanabilir.

2. Görüntüleme Yazılımı Kurma

Görüntü kamera tarafından yakalama ile ışık kaynağı kontrol etmek ve senkronize etmek için görüntüleme yazılımı bilgisayarda yüklü olmalıdır. MetaFluor (Molecular Devices), Slidebook (Akıllı Görüntü Yenilikler), VisiView (Visitron Sistemleri) dahil olmak üzere birçok ticari yazılım paketleri vardır. Burada düşük maliyetli görüntüleme için yüksek bir esneklik derecesi açık kaynak Mikro-Manager ücretsiz kullanımını göstermektedir.

  1. Bu yazılımı indirin http://valelab.ucsf.edu/ ~ MM / MMwiki / index.php / Micro-Manager_Version_Archive. Biz kolayca bizim ellerde yapılandırılabilir 1.4.5 sürümü yüklemenizi öneririz.
  2. Bilgisayarınızın USB bağlantı noktasına Arduino kartı takın. Dan Arduino kurulu kontrol için yazılım indirin http://www.arduino.cc/en/Main/software . Bu web sitesinde bulunan yönergeleri izleyin ve bu yazılım önceden Mikro Yöneticisi başlangıç ​​için sadece bir kez çalıştırın. Mikro-Manager yazılımı ile birlikte tahta kullanımı için bir kod yükleyin. Kodu indirebilirsiniz http://valelab.ucsf.edu/ ~ MM / MMwiki / index.php / Arduino .
  3. LED ve fotoğraf makinesini açın. Yazılımını başlatın ve Araçlar> Donanım Yapılandırma Sihirbazı (bkz. Şekil 3) seçerek kamera ve LED (ışık kaynaklarının ve örtücü) ile Micro-Yöneticisi iletişim yapılandırın. Fotoğraf makinesi dahil, gerekli bileşenleri ekleyin(Yani Hamamatsu_ DCAM) ve Arduino Kurulu (Arduino-Anahtarı, Arduino-Hub ve Arduino-Shutter aygıtları eklemek). Sonraki adımlar sırasında, Sihirbaz tarafından önerilen varsayılan ayarları kullanabilirsiniz. Sihirbazı tarafından istendiğinde yeni sistem yapılandırmasını kaydedin.
  4. Araçlar> Aygıt Gayrimenkul Browser'ı açmak için ana menüyü kullanın. "Arduino Anahtarı Devlet" inin ve "1" i seçin. Iletişim kutusunu kapatın. "Otomatik deklanşör" kutusuna ana yazılım iletişim işaretli olduğundan emin olun. Basın Dosyası> yazılımını başlattıktan sonra her zaman açılmalıdır yazılım yapılandırma kaydetmek için Sistem Durumu kaydedin. Bu kurulu ve görüntü alımı gerçekleştirmek için gerekli yazılım arasındaki iletişimi kuracak.
  5. Kameradan gelen sinyal izlemek için "Canlı" düğmesine basın. Floresan ışığı her zaman "Canlı" veya "Snap" fonksiyonu seçildiğinde gider emin olun. İlk ölçümler çalıştırmadan önce, başı için demeti splitter birlikte verilen yönergeleri izleyinher ikisi de kanal optik hizalama oluştururlar.

3. Hücre Kültürü ve Transfeksiyonlar

  1. Otoklavlanmış yuvarlak 24 mm cam coverslides (kuyu başına 1 coverslide) ile 6-kuyucuğu hazırlayın. Alternatif olarak, cam tabanlı hücre-kültür kabı kullanılabilir.
  2. Hücreler bir gün sonra% 50-70 oranında konfluent ulaşmak, D-MEM ortam içinde plakalar ya da yemekler üzerine 293A hücreleri (% 10 FCS,% 1 L-glutamin ve% 1 penisilin / streptomisin solüsyonu ile desteklenmiş) çok Levha.
  3. 24 saat sonra kaplama, kalsiyum fosfat transfeksiyonu, yöntem (3.5) kullanarak, plazmid bir FRET algılayıcı ile bir laminar akış tezgah hücreleri transfekte. cAMP biyosensör plazmidler istek üzerine bizim gruptan elde edilebilir. Okuyucu ayrıca 7,8 başka müsait cAMP biyosensörleri tarif kapsamlı değerlendirmeleri adlandırılır.
  4. Ilk önce, transfekte hücreler, transfeksiyon reaktiflerin hazırlanması. 2,5 M CaCl2 ve 2xBBS çözümler Makyaj (ikincisi içeren1.5 mM Na 2 HPO 4, 50 mM BES, 280 mM NaCl, deiyonize su içinde) NaOH ile pH 6.95 'e ayarlanır. Steril Süzülen madde bir normal 0.2 um filtre kullanılarak çözümler.
  5. Bir 6-plaka veya 6 cam tabanlı yemekler transfekte için, mix 10 ug 500 ul 2.5M CaCl2 çözeltisi ve steril su sensörü plazmid, 50 ul FRET. İyice karıştırın.
  6. 2x BBS 500 ul ekleyin. Iyice karıştırılır ve oda sıcaklığında 10 dakika için karışımın inkübe edilir.
  7. Transfeksiyon karışımı pipetle 165 ul, her iyi ya da yemeğin üzerine damla damla. Yavaşça plakası karıştırın ve inkübatör içine geri koymak. Hücreler genellikle transfeksiyon sonra ölçüm 24 saat FRET için hazırız. Bu birkaç hücre yüzey reseptörlerinin aktivitesini etkileyebilecek gibi hücreler, bu noktada confluency ulaşmış değil emin olun.

4. Canlı Hücreler Ölçüler FRET

  1. İlk kez Ölçümden önce, 144 mM NaCI, 5.4 mM KCI, 1 içeren FRET tampon hazırlamakmM MgCl2, 2 mM CaCl2, 10 mM HEPES içinde deiyonize su ve NaOH ile pH 7.3 'e ayarlayın. FRET tampon ile görüntüleme deneylerde kullanılacak bileşikler seyreltilir.
  2. Görüntüleme yazılımı başlatın. Önceden tanımlanmış sistem yapılandırma yükleyin. Önceden yapılandırılmış sistem durumunu seçmek için Dosya> Yük System State seçin.
  3. Görüntüleme odası (örneğin Attofluor hücre odacık) içinde yapışık transfekte 293A hücreleri ile coverslide monte edin. Tampon FRET ile bir kere yıkayın hücrelerini ve tampon FRET 400 ul ilave edin. Kullanırken cam zeminli bir hücre kültür kaplarına yapışık hücrelere yıkayın ve tabak başına tampon 2 ml ekleyin. Biz hiçbir CO 2 kontrol gerekli olduğunu, böylece HEPES içeren FRET tampon oda sıcaklığında bütün ölçümleri gerçekleştirmek.
  4. Nesnel üzerine bazı immersiyon yağı koyun ve mikroskop üzerine görüntüleme odasına aktarın. Transillüminasyon ışık kullanılarak hücre tabakası odaklanın.
  5. Floresan lig açın"Canlı" butonuna basarak, ve deney için bir hücreyi seçin tarafından ht. Çok parlak ve çok loş değil olmalıdır, yani optimal sensörü ifade ile bir hücre seçin. Uygun bir hücre bulduktan sonra, FRET sensör photobleaching önlemek için hemen floresan ışığı kapatın.
  6. "Yakala" düğmesine bastıktan sonra elde edilen görüntüde iyi bir sinyal-gürültü oranı neden olacak şekilde "Kamera ayarları" (genellikle 10-50 msn) altında pozlama süresini ayarlayın. Düşük görüntü kalitesi çok kısa sürelerde sonuç ise çok uzun eksitasyon kez photobleaching neden olabilir.
  7. "Multi-D ACQ." Basın düğmesi ve zaman noktalarının sayısı ve görüntü alımı için zaman aralığını ayarlayın. Bizim cAMP-FRET sensörü için, biz bir görüntü her 5 sn kazanır.
  8. "Acquire" butonuna basarak ölçümleri başlatın.
  9. Herhangi bir ölçüm sırasında, bir "online Fret" plug-in (Çevrimiçi Ek mevcut, tüm eklentileri olmalıdır polis kullanabilirsinizizlemek için başlamadan önce Micro-Manager yazılımının "plugins" klasörüne) içine ied çevrimiçi oranı değişiklikleri FRET. Bu plug-in çalıştırın ve "Freehand seçimler" aracını kullanarak FRET oranında görüntü ilgi bir bölge seçin. ROI yöneticisi içine bölgeyi ekleyin ve "Zaman serileri analizi" penceresinde "Get ortalama" düğmesine basın. Oran iz FRET gösterilir. Ölçüm sırasında iz güncellemek için, "FRETratioOnline2" plug-in çalıştırın ve "GetAverage" düğmesine basın.
  10. En kısa FRET olarak oran sabit bir temel doğru bir çanak / odası içine pipetleme ile istenen bileşik uygulamak ulaşmıştır. Farmakolojik bileşikler ile hücre tedavi etmek için, bunun yerine basit bir pipetleme perfüzyon sistemi, bu aşamada kullanılabilir.
  11. Deney çalışması bittikten sonra, görüntülerin time-lapse yığını kaydedin. Mikroskop ölçüm odas çıkarın ve objektif bir doku kullanarak hedefi temizleyin.
  12. Bir ile ölçümü tekrarlamak için 4.3 adıma geri gityeni bir örnek.

5. Çevrimdışı Veri Analizi

FRET görüntüleme verileri ImageJ yazılımı kullanarak deney sonrasında herhangi bir zamanda çevrimdışı analiz edilebilir. Bu protokole ek olarak, "FREToffline" plug-in verici ve alıcı kanalların içine alınan görüntüleri bölmek ve ilgi birden çok bölgede floresan yoğunlukları ölçmek için laboratuarda kullanılan sağlayabilir. Bunlar yoğunlukları fazla olabilir, kopyalanıp yapıştırılmış düzeltilmiş FRET oranını hesaplamak için bir Excel veya Menşe tablo içine. Unimolecular biyosensör değişiklikler FRET görselleştirmek için, basit ratiometry sıklıkla kullanılmaktadır. Bu durumda, sadece donör fluorofor (OBP) heyecanlı ve iki görüntü CFP ve YFP emisyon zirveleri alınır. Hesaplanan YFP / CFP oranı (bazen de CFP / FRET oran olarak anılacaktır) iki florofor arasındaki FRET derecesini temsil eder. Tek moleküllü biyosensörler, CFP ve YFP kısımların sayıları basit ratiometry Yeterli, böylece eşitverim 12 FRET temsil cient.

  1. Eklentiler> Mikro Yöneticisi> Aç Mikro-Manager Dosya seçerek deneme dosyayı açmak için ImageJ yazılımını kullanın.
  2. "FREToffline" plug-in Çalıştır bireysel OBP ve YFP kanallarına time-lapse yığını kıran.
  3. Arka plan düzeltmesi gerekli ise, bu ImageJ yazılımı kullanılarak gerçekleştirilebilir.
  4. Görüntülerin YFP yığını üzerine tıklayın ve bir ya da "Freehand seçimler" aracını kullanarak faiz çeşitli bölgeleri seçin ve "Ekle" butonuna basarak penceresinde eklenti "MultiMeasure" ekleyebilirsiniz.
  5. "MultiMeasure" penceresinde çıkarlarının bölge seçin ve her kare ve her bölge için ortalama gri değerine sahip bir tablo elde etmek için "Multi" düğmesine basın. Ctrl kullanarak tüm seçerek panoya içine veri kopyalama + A ve Ctrl + C tuşlarına basarak Excel veya Menşe tabloyu açın ve Ctrl + V tuşlarına basarak veri yapıştırmak
    Programı tarafından gerçekleştirilen ölçümler> Set M Analyze altında yapılandırılabilir Eğer parametreleri ölçülecek tanımlayabilirsiniz easurements. Biz genellikle sadece bu iletişim "gri Ortalama değer" seçeneğini seçin.
  6. Görüntülerin CFP yığına tıklayın. 5.5 açıklandığı gibi aynı gerçekleştirin. Aynı Excel veya Menşe elektronik tabloya CFP yoğunluğu verileri yapıştırın.
  7. Excel veya Menşe yazılımı kullanarak, düzeltilmiş FRET oranı hesaplanır. Basit tek-zincir Unimolecular biyosensörler yansıması zaman, biz sadece alıcı kanal içine donör floresan bleedthrough için düzeltin. Bu durumda, düzeltilmiş alıcı / verici oranı aşağıdaki gibidir:
    Oranı = (YFP - B x OBP) / CFP
    B CFP plazmidi ile transfekte hücreler ve YFP kanal (B = YFP / CFP) içinde verici floresans bir yüzdesi ölçülerek tespit edilebilir düzeltme faktörü olduğu. Sadece eğrisinin şekli üzerinde hiçbir etkisi olmadan nitel FRET tepki genel genlik etkileyecek beri tek moleküllü biyosensör için bu düzeltme atlamak mümkündür.
jove_title "> 6. Temsilcisi Sonuçlar

Şekil 1 bir örnek gösterilmektedir tam bir Nikon inverted mikroskop, COOLLED, DV2 DualView ve Hamamatsu ORCA-03G CCD kamera oluşan görüntüleme kurulumu FRET toplandı. Donanım bileşenleri ve bilgisayar arasında iletişim kurmak için, G / Ç Arduino kartı bilgisayara ve COOLLED olarak Şekil 2'de gösterilmiştir bağlanır. Senkronize bir şekilde kamera tarafından yakalama ışık kaynağı ve görüntüyü kontrol etmek için, Mikro-Manager yazılımının yüklü olması gerekir ve düzgün (bkz. Şekil 3) yapılandırılır. Bu ücretsiz kolay eklentileri gerekli ekleyerek bireysel deneysel gereksinimlerine adapte edilebilir. Şekil 4A temsilcisi ham β-adrenerjik agonist etkileri izlemek için 293A hücrelerinde eksprese cAMP sensörü Epac1-kampları 13 kullanarak bir ölçümün oranı iz FRET gösterir isoproterenol zaman noktasında 150 sn uygulanır ve ve bahisBir;-bloker propranolol zaman noktası 300 sn (as 4,3-4,10 açıklandığı gerçekleştirilen) eklenir. Bu veriler, analiz edilebilir çevrimdışı ve elde 5,1-5,7 de tarif edildiği gibi YFP kanal içine kapmış olan bleedthrough için düzeltilmiş Şekil 4B de gösterildiği oran iz FRET giderilmiştir. Bu temsilci deney intrasellüler cAMP artışı ifade izoproterenol tedavisi üzerine FRET izlenen oranında yavaş bir azalma gösterir. Bir β-bloker bazal düzeylere cAMP bir azalmaya yol açması, isoproterenol sinyali ters çevirir Propranolol. Bu değişiklikler sinyal herhangi bir deney (as 4,9 olarak açıklanmıştır) sırasında online izlenebilir FRET. Bu tür deneyler farklı bir ikinci haberciler ya da biyokimyasal süreç izlemek için tasarlanmış yaygın olarak kullanılan çok çeşitli biyosensör ile gerçekleştirilebilir.

Şekil 1
Şekil 1. Düzen, bir COOLLED oluşan görüntüleme kurulumu FRETverted Nikon mikroskop, DV2 DualView ve ORCA-03G CCD kamera.

Şekil 2,
Şekil 2. Arduino I / O kartı ve bağlantıları. Kurulu kendine monte plastik kutu yerleştirilir. Standart BNC kablo kurulu işaretçilerine 8 ve GND (0) LED bağlanır.

Şekil 3
Donanım Yapılandırma Sihirbazı'nı kullanarak sistem bileşenlerinin entegrasyonu gösteren Şekil 3. Ekran. A) Donanım Yapılandırma Sihirbazı'nı başlatın. 2.3 'de belirtilen B) Gerekli cihazlar ekleyin. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 4,
Şekil 4. Temsilcisi experimen FRETEpac1-kamp ile transfekte edilmiş 293A hücrelerde cAMP düzeylerini ölçer t. İlk olarak, hücre (YFP / kapmış bir azalma olarak görülmektedir oran FRET) cAMP arttırmak için β-adrenerjik agonist, izoproterenole (100 nM, sec çerçeve 30 ya da 150) ile uyarıldı. Hücreler daha sonra cAMP azalma yansıtan FRET oranı artışa yol propranolol β-bloker (sn kare 60 veya 300 10 uM,) ile tedavi edildi. A) Ham çevrimiçi konusu faiz bir bölgesinden oranı iz FRET çevrimdışı veri analizi gibi 5,1-5,7 açıklanan gerçekleştirilen sonra deneme sırasında izlenen tek bir hücreye. B) oranı iz düzeltildi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bu protokolde, biz mevcut biyosensör çeşitli rutin uygulamalar için basit, düşük maliyetli ama güçlü FRET görüntüleme sistemi oluşturmak nasıl gösterilmektedir. Burada anlatılan sistem, verici-alıcı çiftleri olarak, CFP ve YFP, veya floresan protein benzer tipi için tasarlanmıştır. Bu arada, diğer bireysel biyosensörler örneğin yeşil ve kırmızı floresan proteinleri 14 için kullanmak hangi kullanılabilir hale gelir. Diğer renkler için açıklanan sistem uyarlamak için, uygun ışık kaynağı ve / veya filtre setleri seçilmelidir. LED, başka tek bir LED hattının söz konusu olduğunda, örneğin 490 nm yeşil flöresanlı protein kullanılabilir uyarmak için. Tek dalgaboyu LED'ler atından ve takas (saniye içinde) kolayca olabilir. Alternatif olarak, çeşitli floresan proteinleri (örneğin pE-2) COOLLED heyecanlandırmak için birkaç satır içeren mevcut LED diziler vardır. Alternatif ölçümler etkinleştirmek için çift FRET, diğer floresan filtre küpler Microsc içine yerleştirilebilir ope, ve sonunda emisyon ışın ayırıcı filtreler değiştirilmelidir. Fotometrik DV2 DualView için ek emisyon filtresi sürgü sunmaktadır. Bazı son zamanlarda geliştirilen uygulamalar örnek cAMP için, aynı anda birden çok süreçlerini izlemek ve bir hücre 15 birlikte cGMP aynı anda iki veya daha fazla biyosensörler kullanın. Görüntü bölme ve analiz sonra dört kanal ile kullanılmak üzere adapte edilebilir ve hesaplamak için bu durumda, dört emisyon kanalı içeren bir QuadView (Fotometrik) kullanılabilir, ImageJ plug-iki oran FRET. ImageJ yazılım görüntü analizi ve sonuçlarının çevrimiçi gösterimi açısından çok esnektir. Basit metin düzenlenebilir eklentileri herhangi bir bireyin görüntüleme sistemi ve deney ihtiyaçlarına yazılım algoritması uyum sağlar. Bu bazen çok yararlı ve onlar herhangi bir ticari yazılım paketi halinde uygulanacak olduğunda uzun süreler gerektirebilir teknik sorunlar, hızlı çözümler sunmaktadır.

content "> deneyler FRET yaparken, bu uyarım kez görüntüler çok sık alındığında çok uzun veya zaman göründüğü photobleaching önlemek için çok önemlidir. Bu durumda, bir foton ile indüklenen kimyasal hasar veya florofor kovalent modifikasyonlar de oluşabilir verimlilik FRET azaltın. photobleaching önlemek için, bir pozlama süresi ve görüntü elde etme sıklığını azaltabilir. Ayrıca bu olay için düzeltmek için protokoller 12,16 Orada kurulmuştur. Verilerin analizi sırasında, bu arasındaki çapraz konuşma düzeltmek mümkündür verici ve alıcı kanalların (bleedthrough). tek moleküllü kullanıldığı zaman basit rasyometrik ölçümleri için biyosensör (bu durumda verici ve alıcı floroforlar her zaman aynı düzeyde ifade edilmiştir) FRET, bu alıcı içine sadece vericinin bleedthrough düzeltmek için yeterli olabilir, kanal ya da niteliksel FRET oranı eğrinin şeklini etkilemez çünkü hatta tamamen bu düzeltme atlarsanız. th bleedthroughdonör kanal içine e akseptör genellikle çok azdır. Iki farklı protein oluşan moleküllü biyosensör kullanıldığında, bunlar farklı seviyelerde ifade edilebilir. Bu durumda, bleedthrough düzeltme ve 440 nm'de ışık tarafından direkt YFP uyarma için ilave bir düzeltme da uygundur. , Tüm düzeltme işlemleri daha ayrıntılı olarak açıklanmıştır yayımlanan protokol 12 bakın lütfen. Biyosensör gelişimi hakkında ek kapsamlı bilgi, mikroskop FRET, tekniğin ve veri analizi ile ilgili olası tuzaklar önceden yayınlanmış protokolleri 17-18 mevcuttur. Sonuç olarak, burada açıklanan basit ve güçlü görüntüleme sistemi canlı hücrelerde yüksek temporal ve uzaysal çözünürlüğü ile çeşitli biyokimyasal olaylar ve sinyal molekülleri izlemek için esnek bir platform sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgments

Yazarlar teknik yardım Anke Rüttgeroth ve Karina Zimmermann teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Deutsche Forschungsgemeinschaft (VON hibe NI 1301/1-1) ve Göttingen Üniversitesi Tıp Merkezi (VON için "pro futura" hibe) tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BES Buffer Grade AppliChem A1062
CaCl2 dihydrate Sigma-Aldrich C5010
Glass coverslides Thermo Scientific 004710781 Diameter 24 mm
Glass-bottomed cell-culture dishes World Precision Instruments FD3510-100
D-MEM medium Biochrom AG F0445
Fetal calf serum (FCS) Thermo Scientific SH30073.02
L-Glutamine Biochrom AG K0283
HEPES Sigma H4034
KCl Sigma P5405
MgCl2 hexahydrate AppliChem A4425
NaCl AppliChem A1149
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S9707
Penicillin/Streptomycin Biochrom AG A2213
Inverted fluorescent microscope e.g. Nikon Request at Nikon
CoolLED CoolLED pE-100 440 nm
DualView Photometrics DV2-SYS
DualView filter slider Photometrics 05-EM
CFP/YFP filter set Chroma Technology 49052 without the emission filter
ORCA-03G camera Hamamatsu Photonics C8484-03G02
Arduino I/O board Sparkfun Electronics DEV-00666
Attofluor cell chamber Invitrogen A-7816
Personal computer with WindowsXP or Windows7 system Any supplier Include hard-drive with high capacity

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zaccolo, M. Use of chimeric fluorescent proteins and fluorescence resonance energy transfer to monitor cellular responses. Circ. Res. 94, 866-873 (2004).
  2. Mehta, S., Zhang, J. Reporting from the field: genetically encoded fluorescent reporters uncover signaling dynamics in living biological systems. Annu. Rev. Biochem. 80, 375-401 (2011).
  3. Zhang, J., Campbell, R. E., Ting, A. Y., Tsien, R. Y. Creating new fluorescent probes for cell biology. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3, 906-918 (2002).
  4. Miyawaki, A. Visualization of the spatial and temporal dynamics of intracellular signaling. Dev. Cell. 4, 295-305 (2003).
  5. Bunemann, M., Frank, M., Lohse, M. J. Gi protein activation in intact cells involves subunit rearrangement rather than dissociation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 16077-16082 (2003).
  6. Kotlikoff, M. I. Genetically encoded Ca2+ indicators: using genetics and molecular design to understand complex physiology. J. Physiol. 578, 55-67 (2007).
  7. Willoughby, D., Cooper, D. M. Live-cell imaging of cAMP dynamics. Nat. Methods. 5, 29-36 (2008).
  8. Nikolaev, V. O., Lohse, M. J. Monitoring of cAMP synthesis and degradation in living cells. Physiology (Bethesda). 21, 86-92 (2006).
  9. Tanimura, A. Use of Fluorescence Resonance Energy Transfer-based Biosensors for the Quantitative Analysis of Inositol 1,4,5-Trisphosphate Dynamics in Calcium Oscillations. J. Biol. Chem. 284, 8910-8917 (2009).
  10. Nikolaev, V. O., Lohse, M. J. Novel techniques for real-time monitoring of cGMP in living cells. Handb. Exp. Pharmacol. 229-243 (2009).
  11. Nausch, L. W., Ledoux, J., Bonev, A. D., Nelson, M. T., Dostmann, W. R. Differential patterning of cGMP in vascular smooth muscle cells revealed by single GFP-linked biosensors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 365-370 (2008).
  12. Borner, S. FRET measurements of intracellular cAMP concentrations and cAMP analog permeability in intact cells. Nat. Protoc. 6, 427-438 (2011).
  13. Nikolaev, V. O., Bunemann, M., Hein, L., Hannawacker, A., Lohse, M. J. Novel single chain cAMP sensors for receptor-induced signal propagation. J. Biol. Chem. 279, 37215-37218 (2004).
  14. Hong, K. P., Spitzer, N. C., Nicol, X. Improved molecular toolkit for cAMP studies in live cells. BMC Res. Notes. 4, 241-24 (2011).
  15. Niino, Y., Hotta, K., Oka, K. Simultaneous live cell imaging using dual FRET sensors with a single excitation light. PLoS One. 4, e6036 (2009).
  16. Palmer, A. E., Tsien, R. Y. Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators. Nat. Protoc. 1, 1057-1065 (2006).
  17. Brumbaugh, J., Schleifenbaum, A., Stier, G., Sattler, M., Schultz, C. Single- and dual-parameter FRET kinase probes based on pleckstrin. Nat. Protoc. 1, 1044-1055 (2006).
  18. Aoki, K., Matsuda, M. Visualization of small GTPase activity with fluorescence resonance energy transfer-based biosensors. Nat. Protoc. 4, 1623-1631 (2009).
Unimoleküler Biyosensörler kullanma Canlı Hücreler Olaylar Sinyal gerçek zamanlı izlenmesi için Mikroskopi FRET
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sprenger, J. U., Perera, R. K., Götz, K. R., Nikolaev, V. O. FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors. J. Vis. Exp. (66), e4081, doi:10.3791/4081 (2012).More

Sprenger, J. U., Perera, R. K., Götz, K. R., Nikolaev, V. O. FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors. J. Vis. Exp. (66), e4081, doi:10.3791/4081 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter