Unimoleküler Biyosensörler kullanma Canlı Hücreler Olaylar Sinyal gerçek zamanlı izlenmesi için Mikroskopi FRET
Summary
Förster rezonans enerji transferi (FRET) mikroskopi gazetecilere gibi çeşitli biyosensör kullanılarak canlı hücrelerde olayların sinyalizasyon gerçek zamanlı izleme için güçlü bir tekniktir. Burada nasıl bir özelleştirilmiş Epifloresans oluşturmak için ticari olarak mevcut bileşenleri ve nasıl deneyler FRET için kullanmak, görüntüleme sistemi FRET tarif.
Abstract
Förster rezonans enerji transferi (FRET) mikroskopi canlı hücrelerin ve dokuların biyokimyasal ve sinyalizasyon olaylar gerçek zamanlı izleme için bir teknik olarak artan faiz kazanmaya devam ediyor. Klasik biyokimyasal yöntemler ile karşılaştırıldığında, bu yeni teknolojinin yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlük ile karakterizedir. Deneyler ifade ve in situ veya in vivo 1-2 zamanla yansıması çeşitli genetik olarak kodlanmış biyosensör kullanın FRET. Tipik biyosensörler ya proteinlerin fluorofor tagged çifti veya donör ve 3-4 ilgi bir molekül için bağlayıcı bir parçası ile birbirine muhatap floroforlar barındıran tek bir proteinin konformasyon değişikliğine arasındaki FRET ölçerek protein-protein etkileşimleri bildirebilirsiniz. Protein-protein etkileşimleri için Bimoleküler biyosensörler, örneğin, sırasında tek moleküllü sensörler mea, hücreler 5 G-protein aktivasyonu izlemek için tasarlanmış yapılarısuring konformasyonel değişiklikler yaygın olarak kalsiyum 6, cAMP 7-8, inositol fosfatların 9 ve cGMP 10-11 gibi görüntü ikinci haberciler için kullanılır. Burada nasıl bir özelleştirilmiş Epifloresans oluşturmak için tek ticari olarak mevcut bileşenleri ve nasıl Micro-Manager ücretsiz kullanarak tüm kurulum kontrol etmek için gelen görüntüleme sistemi FRET tarif. Bu basit ama güçlü bir araç canlı hücrelerde FRET rutin veya daha karmaşık ölçümler için tasarlanmıştır. Edinilmiş görüntüler bir grafik biçiminde depolanan önce herhangi bir deney sırasında gerçek zamanlı olarak FRET oranı değişiklikleri görmenizi kendine yazılmış eklentileri kullanarak işlenir ile uyumlu yapı-izleyen veri analizi için kullanılan ImageJ ücretsiz. Bu düşük maliyetli sistem yüksek esneklik ile karakterizedir ve başarıyla kullanılabilir bir bolluk ile çeşitli biyokimyasal olaylar ve sinyal molekülleri izlemek için kullanılabilir canlı hücre ve dokularda biyosensörler FRET. Bir örnek olarak, saat göstermekBir β-adrenerjik reseptör agonist ve engelleyicisi ile uyarılması üzerine canlı 293A hücrelerde cAMP gerçek zamanlı izleme gerçekleştirmek için bu görüntüleme sistemi kullanmak için ow.
Protocol
Discussion
Bu protokolde, biz mevcut biyosensör çeşitli rutin uygulamalar için basit, düşük maliyetli ama güçlü FRET görüntüleme sistemi oluşturmak nasıl gösterilmektedir. Burada anlatılan sistem, verici-alıcı çiftleri olarak, CFP ve YFP, veya floresan protein benzer tipi için tasarlanmıştır. Bu arada, diğer bireysel biyosensörler örneğin yeşil ve kırmızı floresan proteinleri 14 için kullanmak hangi kullanılabilir hale gelir. Diğer renkler için açıklanan sistem uyarlamak için, uygu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar teknik yardım Anke Rüttgeroth ve Karina Zimmermann teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Deutsche Forschungsgemeinschaft (VON hibe NI 1301/1-1) ve Göttingen Üniversitesi Tıp Merkezi (VON için "pro futura" hibe) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments |
| BES Buffer Grade | AppliChem | A1062 | |
| CaCl2 dihydrate | Sigma-Aldrich | C5010 | |
| Glass coverslides | Thermo Scientific | 004710781 | Diameter 24 mm |
| Glass-bottomed cell-culture dishes | World Precision Instruments | FD3510-100 | |
| D-MEM medium | Biochrom AG | F0445 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Thermo Scientific | SH30073.02 | |
| L-Glutamine | Biochrom AG | K0283 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| MgCl2 hexahydrate | AppliChem | A4425 | |
| NaCl | AppliChem | A1149 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S9707 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom AG | A2213 | |
| Inverted fluorescent microscope | e.g. Nikon | Request at Nikon | |
| CoolLED | CoolLED | pE-100 | 440 nm |
| DualView | Photometrics | DV2-SYS | |
| DualView filter slider | Photometrics | 05-EM | |
| CFP/YFP filter set | Chroma Technology | 49052 | without the emission filter |
| ORCA-03G camera | Hamamatsu Photonics | C8484-03G02 | |
| Arduino I/O board | Sparkfun Electronics | DEV-00666 | |
| Attofluor cell chamber | Invitrogen | A-7816 | |
| Personal computer with WindowsXP or Windows7 system | Any supplier | Include hard-drive with high capacity |
References
- Zaccolo, M. Use of chimeric fluorescent proteins and fluorescence resonance energy transfer to monitor cellular responses. Circ. Res. 94, 866-873 (2004).
- Mehta, S., Zhang, J. Reporting from the field: genetically encoded fluorescent reporters uncover signaling dynamics in living biological systems. Annu. Rev. Biochem. 80, 375-401 (2011).
- Zhang, J., Campbell, R. E., Ting, A. Y., Tsien, R. Y. Creating new fluorescent probes for cell biology. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3, 906-918 (2002).
- Miyawaki, A. Visualization of the spatial and temporal dynamics of intracellular signaling. Dev. Cell. 4, 295-305 (2003).
- Bunemann, M., Frank, M., Lohse, M. J. Gi protein activation in intact cells involves subunit rearrangement rather than dissociation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 16077-16082 (2003).
- Kotlikoff, M. I. Genetically encoded Ca2+ indicators: using genetics and molecular design to understand complex physiology. J. Physiol. 578, 55-67 (2007).
- Willoughby, D., Cooper, D. M. Live-cell imaging of cAMP dynamics. Nat. Methods. 5, 29-36 (2008).
- Nikolaev, V. O., Lohse, M. J. Monitoring of cAMP synthesis and degradation in living cells. Physiology (Bethesda). 21, 86-92 (2006).
- Tanimura, A. Use of Fluorescence Resonance Energy Transfer-based Biosensors for the Quantitative Analysis of Inositol 1,4,5-Trisphosphate Dynamics in Calcium Oscillations. J. Biol. Chem. 284, 8910-8917 (2009).
- Nikolaev, V. O., Lohse, M. J. Novel techniques for real-time monitoring of cGMP in living cells. Handb. Exp. Pharmacol. , 229-243 (2009).
- Nausch, L. W., Ledoux, J., Bonev, A. D., Nelson, M. T., Dostmann, W. R. Differential patterning of cGMP in vascular smooth muscle cells revealed by single GFP-linked biosensors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 365-370 (2008).
- Borner, S. FRET measurements of intracellular cAMP concentrations and cAMP analog permeability in intact cells. Nat. Protoc. 6, 427-438 (2011).
- Nikolaev, V. O., Bunemann, M., Hein, L., Hannawacker, A., Lohse, M. J. Novel single chain cAMP sensors for receptor-induced signal propagation. J. Biol. Chem. 279, 37215-37218 (2004).
- Hong, K. P., Spitzer, N. C., Nicol, X. Improved molecular toolkit for cAMP studies in live cells. BMC Res. Notes. 4, 241-24 (2011).
- Niino, Y., Hotta, K., Oka, K. Simultaneous live cell imaging using dual FRET sensors with a single excitation light. PLoS One. 4, e6036 (2009).
- Palmer, A. E., Tsien, R. Y. Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators. Nat. Protoc. 1, 1057-1065 (2006).
- Brumbaugh, J., Schleifenbaum, A., Stier, G., Sattler, M., Schultz, C. Single- and dual-parameter FRET kinase probes based on pleckstrin. Nat. Protoc. 1, 1044-1055 (2006).
- Aoki, K., Matsuda, M. Visualization of small GTPase activity with fluorescence resonance energy transfer-based biosensors. Nat. Protoc. 4, 1623-1631 (2009).
