Summary
Kuiken in ovo electroporatie is een techniek die genetische manipulatie van de aviaire embryo mogelijk maakt. Voorkomende toepassingen van deze techniek zijn functionele analyse van genen en vermeende enhancer elementen. Deze video toont neurale buis elektroporatie in HH 10 kippenembryo's. Injectietechniek en de juiste eierbehandeling worden besproken.
Abstract
Groot formaat en externe ontwikkeling van het kippenembryo al lang het tot een waardevol hulpmiddel in de studie van de ontwikkelingsbiologie. Met de komst van moleculair biologische technieken, is het kuiken uitgegroeid tot een nuttig systeem om genregulatie en functie te bestuderen. Door electroporating DNA of RNA-constructen in de zich ontwikkelende kippenembryo, kunnen genen worden uitgedrukt of neergeslagen om te analyseren in vivo genfunctie. Op dezelfde manier kan reporter constructen gebruikt worden voor het lot in kaart brengen of naar vermeende gen-regulatorische elementen te onderzoeken. In vergelijking met soortgelijke experimenten in de muis, kuiken elektroporatie heeft als voordeel dat het snel, eenvoudig en goedkoop. Deze video toont eerst hoe een venster te maken in de eierschaal om het embryo te manipuleren. Vervolgens wordt het embryo wordt gevisualiseerd met een verdunde oplossing van Oost-Indische inkt ingespoten onder het embryo. Een glazen naald en pipet worden gebruikt om DNA en snel groen kleurstof te injecteren in de zich ontwikkelende neurale buis, dan platina elektroden worden parallel geplaatst om het embryo en korte elektrische pulsen worden toegediend met een pulsgenerator. Tot slot wordt het ei afgesloten met tape en teruggeplaatst in een incubator voor verdere ontwikkeling. Daarnaast is de video is te zien juiste ei opslag en handling en bespreekt mogelijke oorzaken van embryo verlies na elektroporatie.
Protocol
Eierbehandeling
- Eieren mogen worden bewaard bij 13 ° C tot een week voorafgaand aan de incubatie zonder een significant verlies van de levensvatbaarheid (een klein wijnkoeler is ideaal voor dit doel).
- Voorafgaand aan de incubatie, laat de eieren op kamertemperatuur, plaats dan warm in een bevochtigde kip incubator ingesteld op 37,8 ° C (100 ° F).
- We meestal electroporate embryo's ongeveer 48 uur na het begin van de incubatie, wanneer het embryo heeft Hamburger en Hamilton het podium 10 bereikt.
- De tijd van incubatie kan variëren afhankelijk van de gewenste Hamburger en Hamilton het podium. Temperatuur is kritisch en afwijking van een optimale incubatie temperatuur zal veranderen incubatietijd en de afname van embryo levensvatbaar is.
- Tijdens de incubatie, moeten de eieren worden gehouden op hun kant, zodat het embryo zal goed gepositioneerd voor elektroporatie. Het embryo zal drijven op de top van de dooier en het is nuttig om de top van het ei markeren met een potlood voor window, zodat je weet waar je moet knippen.
Voorbereiding
- Warm Leibovitz L-15 media tot 37 ° C. Trek glas haarvaten in de naalden. Plaats elektroden en micromanipulator en sluit elektroden op de pulsgenerator.
Window
- Behulp van een injectiespuit met grote naald, prik de schil aan het smalle uiteinde van het ei.
- Wijst de naald voorzichtig naar beneden tot een verstoring van de dooier te voorkomen, verwijder dan ongeveer 5 ml albumine.
- Dicht het gat met een klein stukje van de tape.
- Bedek de bovenkant van het ei met een ander stuk van de band (ongeveer 4x4 cm).
- Met behulp van gebogen schaar, en zorg ervoor dat u het embryo te verstoren, een gat net groot genoeg om een raam in te werken bieden.
Optioneel: visualiseer de neurale buis, inkt oplossing te injecteren met een 26 gauge naald onder de embryo (steek naald onder de embryo van buiten het bloed ring). Oost-Indische inkt moet worden verdund 1:05 met Hanks of vergelijkbare steriele gebufferde oplossing.
Injectie en elektroporatie
- Breek de capillaire tip om de gewenste diameter met een pincet
- Met behulp van de mond pipet, laad het capillair met plasmide / Fast groene kleurstof.
- Positie van het embryo met het hoofd naar u toe en steek de naald in de neurale buis op een ondiepe hoek.
- Injecteer het plasmide oplossing in het lumen van de neurale buis tot kleurstof vult de hele ruimte.
Opmerking: Let erop dat u tip groter dan neurale buis met een diameter hebben. In het algemeen zal je kunnen vertellen of de optimale tip grootte is bereikt door hoe gemakkelijk of moeilijk het is om vloeistof te trekken in het capillair. Als er extreme weerstand, de opening is waarschijnlijk te klein en de tip moet weer hoger zijn opgebroken. Als er weinig of geen weerstand, de opening is te groot en een nieuwe naald worden gebruikt.
- Plaats een tot twee druppels steriele L-15 media op het embryo.
- Onmiddellijk plaats de elektroden aan weerszijden van het embryo, parallel aan de neurale buis, en pols 5 keer op 10-24 volt voor 50 mseconds tussenpozen van 1 seconde. U ziet belletjes de buurt van de elektroden of het werkt naar behoren.
- Verwijder voorzichtig elektroden, 5 druppels L-15 terug te brengen op de top van de embryo's en verzegel het ei met tape. Zorg ervoor dat het ei goed wordt afgesloten, omdat het drogen is een belangrijke bijdrage aan embryo verlies na elektroporatie.
- Plaats de eieren terug in de couveuse, venster naar boven, en incubeer tot ze de gewenste H & H podium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol biedt een stapsgewijze handleiding voor neurale buis elektroporatie van HH10 kippenembryo's. Naast het tonen van de techniek, is richtlijnen voor de opslag en behandeling van eieren ook voorzien. Deze techniek heeft een breed scala van toepassingen voor genetische analyse, en het gemak en de lage kosten van experimenten maakt ze haalbaar is voor vele labs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chicken egg incubator | humidified, set to 37.80°C (100F). | ||
| Pulse generator | Genetronics | BTX T820 | Square wave generator or comparable |
| Electrodes | our electrodes were made from 0.25 mm diameter platinum wire and were 5 mm long and spaced 1 mm apart | ||
| Connecter cables | |||
| Micromanipulator | |||
| Dissecting scope | with large working distance | ||
| Glass capillaries | and capillary puller or commercial glass needles | ||
| Leibovitz’s L-15 media | |||
| chicken eggs | fertilized | ||
| Curved scissors | |||
| 10 ml syringe | |||
| Large bore needle | 16-18G | ||
| Mouth pipette | |||
| India ink | |||
| Insulin syringe/syringe | |||
| Plasmid DNA | ≥ 1μg/μl in sterile TE or 1X PBS containing 0.05% Fast Green dye |
References
- 'Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression. Nat Cell Biol. 1, 203-207 (1999).
