Summary
A abundância de receptores de neurotransmissores nas sinapses cluster influencia fortemente a força sináptica. Este método quantifica receptores de neurotransmissores fluorescente-etiquetados em três dimensões com um único sinapse resolução em
Abstract
Força Synapse refere-se à amplitude das respostas pós-sinápticos para eventos de liberação de neurotransmissores pré-sinápticos, e tem um grande impacto na função circuito neural global. Synapse força crítica depende da abundância de receptores de neurotransmissores agrupadas em sítios sinápticos na membrana pós-sináptica. Níveis de receptores são estabelecidos developmentally, e pode ser alterada por tráfico entre pools receptor de superfície localizada, subsináptica, e intracelular, que representam importantes mecanismos de plasticidade sináptica e neuromodulação. Métodos rigorosos para quantificar sinapticamente localizada abundância receptor neurotransmissor são essenciais para estudar o desenvolvimento e plasticidade sináptica. A microscopia de fluorescência é uma abordagem ideal porque preserva informação espacial, distinguindo sináptica de não-sinápticos piscinas e discriminar entre as populações de receptores localizados em diferentes tipos de sinapses. A genética organismo modelo Caenorhabditis elegans é particularmente bem adequado para estes estudos, devido ao pequeno tamanho e simplicidade relativa do seu sistema nervoso, a sua transparência, e da disponibilidade de poderosas técnicas genéticas, permitindo o exame das sinapses nativas em animais intactos.
Aqui apresentamos um método de quantificação fluorescente-etiquetados receptores de neurotransmissores sinápticos em C. elegans. Sua característica fundamental é a identificação automatizada e análise individual das sinapses em três dimensões no plano multi-arquivos microscópio confocal de saída, a posição de tabulação, volume, intensidade de fluorescência, fluorescência e total para cada sinapse. Esta abordagem tem duas vantagens principais sobre a análise manual de z-plano projeções de dados confocal. Primeiro, porque todos os planos do conjunto de dados confocal está incluído, não existem dados são perdidos devido a z-plano de projeção, normalmente com base nas médias de intensidade de pixel ou maxima. Identificação, segundo as sinapses é automatizado, mas pode ser inspecionado pelo experimenter como o produto de análise de dados, permitindo a extração rápida e precisa dos dados de um grande número de sinapses. Centenas de milhares de sinapses por amostra pode ser facilmente obtida, produzindo grandes conjuntos de dados para maximizar a potência estatística. Considerações para a preparação de C. elegans para análise, e realizando imagem confocal para minimizar a variabilidade entre os animais nos grupos de tratamento são também discutidos. Embora tenha sido desenvolvido para analisar C. receptores pós-sinápticos elegans, este método é geralmente útil para qualquer tipo de sinapticamente localizada proteína, ou, na verdade, qualquer sinal de fluorescência que está localizada a aglomerados discretas, puncta, ou organelos.
O procedimento é realizado em três passos: 1) preparação de amostras, 2) imagem confocal, e 3) análise de imagem. Passos 1 e 2 são específicos para C. elegans, enquanto o passo 3 é geralmente aplicável a qualquer sinal de fluorescência em ponteada micrografias confocal.
Protocol
1. Preparação de Worms para imagem
Este segmento do protocolo é baseada em trabalhos C. técnicas de cultura de elegans 1,2, e é descrito na Figura 1.
- Crescer vermes em alta peptona placas de ágar NGM (10 cm) semeados com NA22 E. bactéria Escherichia até quase morrer de fome. Se imunomarcação, uma placa irá produzir de forma confiável vermes suficientes para um indivíduo mancha, tendo em conta as perdas ao longo do caminho, e os rigorosos critérios utilizados para selecionar os vermes para geração de imagens (ver Parte 2).
- Vermes colheita vertendo alguns ml de DDQ 2 0 no prato, agitação brevemente, e verter o líquido para um tubo de 15 ml cónica (repetição se necessário, para transferir a maioria dos vermes para o tubo). Sedimento em centrífuga clínica por 3 min, g 1000x. Lavar pelete 1-3x com ddH2O até sobrenadante é claro para remover as bactérias residuais. Usar pipetas de transferência de polipropileno para remover sobrenadantes, como vermes furar vidro(A partir desse passo é crítico para minimizar o tempo entre os passos para evitar perdas na viabilidade dos ovos).
- Após a última lavagem, verme Ressuspender o granulado em 5 ml de solução de hipoclorito alcalino para lisar vermes e ovos de libertação. Balance suavemente, e examinar os tubos sob um microscópio de dissecação cerca de uma vez por minuto. Quando cerca de 50% dos vermes são lisadas (elas aparecerão dobrados e arrombado), terminar a lise através do enchimento do tubo para o topo com tampão de ovo, invertendo várias vezes, e granulação durante 3 min, g 1000x. Tempo de lise não deve exceder 5 min.
- Remover o sobrenadante com pipeta de transferência, e lavar pellet 3x com tampão de ovo.
- Para separar os ovos de detritos, flutuar-los sobre uma almofada de sacarose a 30% em ddH2O: após a lavagem final a partir do passo 1.4, cuidadosamente remover pelete sobrenadante e ressuspender em 5 ml DDQ 2 0. Adicionar 5 ml de sacarose estéril 60% em DDH 2 O, e misture bem. Girar em centrífuga clínica 6 min, g 1000x. Ovos irá recolher no menisco (eles have uma aparência turva), enquanto os detritos serão pellet.
- Usando uma pipeta de transferência de plástico, sugam ovos em um volume mínimo e transferir para placas de agar unseeded NGM. Quaisquer ovos que aderem ao lado do tubo pode ser enxaguado suavemente para baixo e transferidos também. Uma placa de 10 cm unseeded por estirpe analisado é suficiente.
- Incubar as placas unseeded com os ovos durante a noite (~ 16 horas) a 20 ° C. Alivie a chapa para as primeiras horas para secá-la, deixando a tampa um pouco fora por algumas horas, mas não se esqueça de cobrir durante a noite.
- Após a eclosão, as larvas L1 transferir para um tubo de 15 ml cônico em Basal S (adicionar alguns mililitros S Basal a placa, redemoinho, despeje no tubo). Sedimento em centrífuga clínica (3 min, g 1000x), ressuspender em um volume mínimo de Basal S, e transferir para placas de 10 cm NGM ágar inoculadas com bactérias NA22. Use 2 placas aqui para cada placa original do passo 1.1. Incubar até vermes atingem a idade desejada.
- Monitorizar as culturas uma ou duas vezes por dia. Se eles estão em perigo of fome, a transferência para novas placas NA22. Para vermes do tipo selvagem N2, inanição é precedido pela formação de uma linha ou onda de vermes que se move ao longo da placa como animais de migrar em massa afastado de comida com depleção de zonas. Uma vez que estas formas, a comida será completamente esgotado dentro de algumas horas.
- Worms estão agora prontos para imunomarcação ou imagens ao vivo. Fixação e coloração vermes em suspensão é ótima, porque um grande número de vermes intactas podem ser visualizados facilmente. Procedimentos de coloração com base no protocolo de Finney e Ruvkun 3-6 são preferíveis para congelar-rachadura procedimentos porque um grande número de vermes são necessários para geração de imagens.
2. Imagem confocal
- Monte vermes em slides para imagem confocal. Ajustar a densidade de vermes para algumas centenas por microlitro. Fazer uma almofada de agarose a 2% em S-basal rodeado por um anel fino de vaselina para evitar a evaporação durante o exame (aplicado através de uma seringa de 3 ml equipado com uma agulha de calibre de corte 25). Pipetar ummicrolitros da suspensão poucos verme em uma lamínula (utilizar anestésico se vermes imagens ao vivo), e abaixar o bloco de agarose para a lamínula, espalhando-se os vermes uniformemente sobre a almofada.
- Selecione vermes para imagens. Escolha vermes onde as sinapses de interesse são orientados para a lente objetiva, com deslocamento radial máximo de ± 45 ° (onde 0 ° significa orientada diretamente para o objectivo). Realizar esta avaliação rápida (poucos segundos) para evitar fotodegradação. A escala das culturas iniciais é otimizado para garantir vermes suficientes irá satisfazer estes critérios geométricos.
- Conclua a imagem confocal da amostra. Amostras relativamente planas que podem ser englobadas dentro de cerca de 14 0,4 uM secções espessas produzir os melhores resultados. Alta velocidade, imagens de baixa resolução (512 x 512 pixels) são suficientes para uma rápida coleta de dados precisos. Evitar a saturação do detector com a potência do sinal excessivos, pois isso fará com que a subestimação da fluorescênciasinais.
3. Automatizado de Identificação e Análise de Clusters individuais Synaptic
- Abertos multi-TIF ficheiros de saída a partir do microscópio confocal utilizando Volocity 4,0 (ou superior) software (PerkinElmer).
- Cortar fora as áreas da imagem que não contêm a estrutura de interesse (Image -> Focus Extended -> Cortar para a Seleção> Select área de interesse usando 'Freehand ROI "ferramenta - -> Ações; Figura 2A). Foco nota, Extended produz uma projeção z-plano na tela do computador para ajudar na sua análise, mas não afeta os dados subjacentes, o mesmo é verdadeiro para ajustes de brilho e contraste, se necessário).
- Medir o comprimento da área de analisados utilizando a ferramenta linha. O comprimento da linha será calculado e adicionado à tabela de dados (Figura 2B).
- Identificar objetos usando os "Objetos por Intensidade 'filtro (modo de Medidas). Especifique um limite tal que os clusters sinápticas sãodestacada e não-sináptica de fundo não é (Figura 2C). A inclusão de um marcador independente sináptica rotulados com uma outra cor pode ajudar a identificar inequivocamente sinapses. Sinapses típicas variam de poucos a algumas centenas de voxels. Defina o limite de uma vez, usando uma amostra de controlo, e usá-lo para todas as amostras subseqüentes. Limiarização cada amostra separadamente é inaceitável, porque ela introduz a possibilidade de preconceito de experimentador. Os objectos são seleccionados e tabulados automaticamente (Figura 2D).
- Organizar e exportar os dados. Eliminar objetos de 2 ou menos voxels, uma vez que estes são geralmente manchas de fundo. Estes podem ser eliminados por filtragem adicionais, ou durante a análise subsequente. Para facilitar a jusante sua remoção, reordenar o arquivo de dados por 'o tamanho do objeto' para que eles com todo o grupo junto. Exportar os dados no formato CSV, que pode ser aberto pelo Microsoft Excel ou outros programas de planilha. Cada imagem produz um arquivo de saída.
- Se macio Volocityware é indisponíveis, métodos alternativos para analisar Z-plano projeções de dados confocal pode ser utilizado (por exemplo, ref. 7, ou a análise manual usando ImageJ), apesar de 3-dimensional informação é perdida (ver discussão).
4. Os resultados representativos
O método de quantificação apresentada deve ser capaz de distinguir entre as populações de fragmentação de brilho diferente e volumes diferentes. Imagens representativas e os correspondentes dados quantitativos apresentados na Figura 3 demonstram exemplos de diferenciação com base destes parâmetros. Como regra geral os resultados devem estar de acordo com o que é evidente para o olho. No caso de UNC-49 receptor GABA imunocoloração o cabo de nervo ventral de C. elegans, todos os animais tipicamente apareceu muito semelhantes em tamanho e maturidade e totais sinápticas valores de fluorescência para um grupo de cinco vermes (normalizados para o comprimento do cabo de nervo analisado) mostrou Erro Padrão valores de cerca de 10% da média 4. Mutação genética e outros tratamentos experimentais (por exemplo, a exposição ao medicamento) pode alterar não só o volume e valores de intensidade e as distribuições de freqüência de clusters sinápticas, mas possivelmente o desenvolvimento tempo-curso e sincronia dos vermes, resultando em maior variabilidade. No entanto, os resultados quantitativos devem sempre refletir o que pode ser apreciada visualmente e se não, a inspeção das imagens e os objetos identificados por Volocity deve revelar onde ocorreu o erro e sugerir medidas corretivas, tais como re-thresholding ou remoção de objetos artefatuais.
Figura 1. Preparação de síncrona C. elegans culturas. culturas síncronos são obtidas a partir deste procedimento, pois C. prisões desenvolvimento elegans e da fase larval L1 na ausência de alimentos e retoma quando o alimento é introduzido.
Figura 2. A quantificação de puncta sináptica.
- Regiões estranhas da imagem são cortadas para reduzir o tamanho dos arquivos e aumentar a especificidade. Painel da esquerda mostra a partir de imagem, painel do meio mostra região selecionada, o painel direito mostra imagem após a colheita. Sinal vermelho é UNC-49 de imunofluorescência receptor GABA, o sinal verde é sinaptobrevina-GFP (um marcador pré-sináptica), expresso em pré-sinápticos de neurônios GABA 4. Clique aqui para ver maior figura .
- Uma linha é traçada o comprimento do segmento de cabo de nervo a ser analisado, eo seu comprimento é registada automaticamente na tabela de resultados. Esta informação é necessária para normalizar os dados sinápticas devido ao comprimento do cabo de nervo analisável, que pode variar várias vezes se vermes tornar fragmentados durante a coloração.www.jove.com/files/ftp_upload/4090/4090fig2blarge.jpg "target =" _blank "> Clique aqui para ver maior figura.
- Um limiar é aplicado para identificar individuais aglomerados sinápticas. O painel esquerdo mostra imagem antes de limiarização; exemplos de níveis de limiarização diferentes são mostradas em painéis separados (sinal verde omitido). Cada objecto identificado é representado na imagem como uma região de cor. Observe a correspondência entre os grupos visualmente evidentes sinápticas no painel mais à esquerda e as regiões coloridas no painel mais à direita. Clique aqui para ver maior figura .
- Cada objeto identificado é listado separadamente na tabela de resultados. Objetos individuais podem ser selecionados, e são destaque na imagem para a inspeção, se desejar. Observe a tabela contém informações para o vermelho ("rodamina ') e verde (' EGFP ') canais; a informação do canal verde é potencialmente enganosa uma vez que objetos eramidentificados com base estritamente na fluorescência vermelha. Esta análise também pode ser realizada em imagens de cor única. Clique aqui para ver maior figura .
Figura 3. Resultados representativos. Micrografias representativas de tipo selvagem C. elegans coradas para UNC-49 receptores GABA antes (A) e após (B) o tratamento com o muscimol, um agonista do receptor de GABA que faz com que os receptores para se tornar downregulated após uma exposição prolongada. Painéis mostram imagens cortadas antes (esquerda) e depois (direita) limiarização e remoção de partículas pequenas de fundo. (C) A parcela de quantitativos parâmetros sinápticos para os espécimes mostrados em (A) e (B): fluorescência total normalizada para a cabo de comprimento do nervo (esquerda), e os histogramas probabilidade cumulativa de conteúdo individual sinapse fluorescência (meio) e volume sinapse (right), demonstrando redução estatisticamente significante no conteúdo e volume sináptica induzida pela exposição agonista (n = 60 sinapses para não tratadas, n = 115 sinapses para muscimol-tratado, p <0,001, Kolmogorov-Smirnov http://www.physics.csbsju .edu / stats / KS-teste.html ).
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Discussion
O método aqui apresentado é projetado para extrair quantitativos múltiplos parâmetros de dados para grandes populações de sinapses em C. elegans, enquanto maximiza a consistência dentro de grupos de tratamento. Três características contribuir para estes objectivos. Em primeiro lugar, imunocoloração é realizada em populações de vermes síncronas para assegurar que todos os animais são da mesma idade. Este passo é crítico porque regulação do desenvolvimento de níveis de expressão podem obscurecer efeitos do tratamento experimental (por exemplo, UNC-49 imunofluorescência receptor GABA varia várias vezes durante o desenvolvimento (K. Davis et al., Em preparação)). Além disso, a permeabilização e fixação pode ser altamente variável, tornando difícil comparações quantitativas. Usando culturas sincronizados minimiza essa variabilidade inerente, melhorando a confiabilidade da técnica. Outras formas de abordar esta variabilidade incluem a utilização de um segundo anticorpo para um alvo não relacionado, que pode ser visualizado como uma forma independente internacontrolar para permeabilização, ou de imagem proteínas GFP em vermes vivos, o que evita a necessidade de permeabilização completamente. No entanto, esta última abordagem introduz novos problemas porque a proteína endógena é já não sendo medido artefactos directamente, de modo potenciais devido a inconsistências em número de expressão / cópia transgene, alteração estrutural devido à fusão de GFP, ou não fisiológicas níveis de expressão do transgene precisam de ser considerado. Nenhum método é perfeito, idealmente, corroborando dados podem ser obtidos através de múltiplas abordagens. Neste protocolo, o tamanho das culturas iniciadoras foi optimizado para resultar em números suficientes de vermes fixadas e coradas para análise confocal. Um grande número de vermes são necessários porque os critérios geométricos utilizados para selecionar os vermes para imagens são rígidas, que é a segunda característica do protocolo para minimizar a variabilidade. A estrutura anatômica mesmo deve ser trabalhada em cada animal (ou o site mais biologicamente relevante, ou umarbitrariamente escolhido local, no caso da distribuição do tecido gama de a proteína de interesse), e que a estrutura deve ser orientada para a lente objectiva com desvio apenas ligeira para os lados. Este critério melhora a consistência por eliminar a variabilidade na quantidade de tecido que pode intervir excitação de dispersão e emissão de luz, que afecta a força do sinal. É importante que este é o único critério utilizado para seleccionar vermes, uma vez que é fácil de viés os resultados com base na expectativa de um determinado resultado. De fato experimentos são melhor realizadas cego sempre que possível. A terceira característica que contribui para a potência desta técnica é a identificação automática e caracterização quantitativa dos aglomerados sinápticas em três dimensões, utilizando Volocity. Esta análise é simples e rápido, capaz de identificar e tabulação centenas a milhares de sinapses individuais para cada condição experimental. Mais importante, Volocity inclui dados de todos os planos de multi-plano cpilhas onfocal de dados, em vez de dados para gerar os descartando 2-dimensionais z-projecções utilizados em protocolos anteriores. A jusante desta análise, os grupos experimentais podem ser comparados em termos de fluorescência sináptica total por animal, a distribuição espacial de sinapses, e distribuições de freqüência de volumes, a fluorescência total, e fluorescência máxima para sinapses individuais. Estes parâmetros podem revelar importantes transições indicando eventos de desenvolvimento sinápticas, os papéis das proteínas de desenvolvimento e regulamentares, e plasticidade sináptica.
A quantificação de sinais de fluorescência usando Volocity tem aplicações em neurobiologia além da análise de permeabilizadas C. fixa elegans amostras, sendo útil para a quantificação de qualquer sinal fluorescente localizada em alto contraste puncta. Por isso, é adequado para a análise de tecido fixo ou de células de qualquer organismo. No entanto, a fixação e permeabilização conduz a visualização da população total de proteína sinápticas independentemente do facto de eles são expressos na superfície, enquanto que para os receptores de, pelo menos, apenas a superfície, expressa fracção contribui para a força sináptica. Análise Volocity baseado também pode ser usado para quantificar superfície expressos por populações, desde condições de não-permeabilização de fixação são utilizados. Análise Volocity também será útil para estudar a dinâmica de proteínas em células vivas. Muitos proteína shuttle domínios entre ambientes vesiculares e extracelular com um pH diferente durante eventos de sinalização neuronais (eg terminal do carboxi da sinaptobrevina durante 8-10 de libertação da vesícula sináptica, ou os domínios de terminal amino de receptores de neurotransmissores durante o tráfico para a superfície celular 11). Fusão sensíveis ao pH etiquetas GFP eclíptica para estas regiões pode produzir em repórteres in vivo destas transições que podem ser estudadas quantitativamente usando uma abordagem baseada em Volocity. Do mesmo modo, a GFP-marcação de resultados de neuropeptídeos genes em GFP-rotulados com núcleo denso vesículas que de-mancha comoestes fusíveis vesículas com a membrana plasmática 12; análise Volocity podem ser úteis neste contexto como um ensaio para a libertação neuropeptídeo específica in vivo. A vantagem da análise Volocity em todas estas definições é a sua capacidade de rapidamente identificar e quantificar um grande número de sinapses, permitindo que diferenças sutis em suas propriedades individuais ou distribuições de população deve ser demonstrada com rigor estatístico.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer A. Benham para ajudar com o desenvolvimento do protocolo. Este trabalho foi financiado pelo NIH concessão NS06747 para BAB
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||
| Volocity v4.0 or higher | PerkinElmer/Improvision | Check your local imaging core facility for access to this software. Demo software is available at the PerkinElmer website. This method requires only the Quantitation module of Volocity. | |||||||
| Table 2. Specific reagents and equipment. | |||||||||
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| Table 1. Solutions. | |||||||||
References
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