Summary
Trasplante de intestino delgado se ha convertido en una opción terapéutica en los pacientes con fallo intestinal irreversible. Nuestro modelo experimental de trasplante ortotópico del intestino delgado en ratas sirve como una herramienta fiable para abordar inmunológica subyacente y los procesos inflamatorios que complicar el trasplante intestinal.
Abstract
Trasplante de intestino delgado se ha convertido en una opción aceptada clínica de los pacientes con síndrome de intestino corto y la falta de nutrición parenteral (fallo intestinal irreversible). En los centros especializados mejorado la gestión operativa y estrategias han llevado a excelente a corto y medio plazo paciente y la supervivencia del injerto al tiempo que proporciona alta calidad de vida 1,3. A diferencia del trasplante más común de otros órganos sólidos (corazón, es decir, hígado) muchos mecanismos subyacentes de la función del injerto y las alteraciones inmunológicas inducidas por el trasplante intestinal no son del todo conocidos 6,7. Los episodios de rechazo agudo, sepsis e insuficiencia crónica del injerto son los principales obstáculos aún menos favorable que contribuyen al resultado a largo plazo y dificultando un empleo más generalizado del procedimiento a pesar de un número creciente de pacientes con nutrición parenteral domiciliaria que potencialmente se beneficiarían de un trasplante. El intestino delgado contieneun gran número de leucocitos pasajeros comúnmente como parte del sistema linfoide asociado a intestino (GALT) esta siendo parte de la razón de la alta immunogenity del injerto intestinal. La presencia y la proximidad de muchos comensales y patógenos en el intestino explica la gravedad de los episodios de sepsis una vez integridad de la mucosa del injerto se ve comprometida (por ejemplo, rechazo). Para avanzar en el campo de datos intestinales y trasplante multiorgánico más generados a partir de modelos animales fiables y factibles que se necesita. El modelo que aquí combina la fiabilidad y viabilidad una vez establecido de una manera estandarizada y pueden proporcionar información valiosa en los subyacentes complejos mecanismos moleculares, celulares y funcionales que se activan mediante el trasplante intestinal. Hemos utilizado con éxito y perfeccionado el procedimiento descrito a lo largo de más de 5 años en nuestro laboratorio 8-11. El JoVE basado en video formato es especialmente útil para demostrar el procedimiento complejoDuré y evitar los errores iniciales de los grupos de planificación para establecer un modelo de roedor ortotópico investigando el trasplante intestinal.
Protocol
1. Donante de Operación
- La rata donante debe mantenerse en ayunas durante 24 horas (acceso libre a una solución de agua / glucosa).
- Para inducir la anestesia por inhalación isoflurano, comience con un 2% en atomizador estándar, y luego reducir a 1% después de realizar una laparotomía. Realice una pizca dedo para comprobar la sedación.
- Afeitar el abdomen y limpiar con preparación de la piel 3 veces (Kodan). A continuación, realizar una incisión media después de la administración subcutánea del analgésico.
- Después de que el injerto se envuelve en una gasa empapada en solución salina, separar las adherencias fisiológicas entre el páncreas y el colon ascendente suavemente con un Q-tip (bajo el microscopio quirúrgico con el aumento de 6x).
- Ligar y dividir los vasos cólicos ileocecal y derecho y medio con 7-0 seda. Después de que el colon ascendente se extiende hacia el lado derecho de la vena mesentérica superior (SMV), los vasos cólicos ileocecal, central y derecha se pueden identificar para la ligadura y división, usando 7-0 lazos.
- Retraer el estómago hacia arriba, de modo que la SMV todo se endereza y expuesta. Utilice una pinza mosquito para la retracción. La pinza se mantiene en masa de plastilina formado en forma según sea necesario.
- Ligar y dividir las venas pancreático-duodenales procedentes de la SMV. Todos los pequeños pancreático-duodenales venas procedentes de la SMV debe identificarse cuidadosamente, se ligó con seda 7-0 y dividida antes de que el tejido pancreático se puede quitar desde el injerto.
- Ligar y dividir el tejido conectivo incluyendo perder todos los vasos linfáticos entre el SMV y la aorta abdominal. Con la prótesis todavía en el lado derecho del abdomen, el perder tejido conectivo incluyendo todos los vasos linfáticos entre el SMV y la aorta abdominal es accesible. Este tejido conectivo deben ser ligados utilizando seda 7-0 y se divide para evitar linforrea postoperatoria del injerto intestinal.
- Ligar y dividir la arteria renal derecha. Después de que el tejido conectivo se divide, la arteria renal derecha se convierte en accessible y se liga y se divide usando seda 7-0.
- Sistémicamente heparinise la rata usando 200 unidades de heparina iv a través de la vena del pene.
- Ligar las arterias marginales, y dividir el intestino delgado en la unión duodeno-yeyunal y en el íleon terminal.
- La aorta se liga proximal al origen de la SMA. La vena porta se secciona en la confluencia con la vena esplénica. A continuación, el injerto se cosecha con su pedículo vascular que consiste de la SMA con un segmento de la aorta.
2. Procedimiento Backtable
- Perfundir el injerto usando 3 ml de solución de la Universidad de Wisconsin (UW) a 4 ° C a través del conducto aórtico e irrigar el lumen intestinal desde el extremo yeyunal con 30 ml de Uro-Nebacetin solución de N a 4 ° C (lumen de irrigación es obligatorio) .
Inmediatamente después de extraer el injerto, el conducto aórtico se utiliza para la perfusión con 3 ml de solución fría de UW. Para ello, un 20 G iv catéter enuna jeringa de 10 ml se utiliza. El perfundido se debe observar para fluir libremente desde la vena portal dividido. Para la irrigación intestinal con Nebacetin, una jeringa de 50 ml se utiliza.
- Almacenar el injerto en solución UW a 4 º C durante la preparación del receptor.
3. Receptor Operación
- La rata receptora debe mantenerse en ayunas durante 24 horas (acceso libre a una solución de agua / glucosa).
- Para inducir la anestesia por inhalación isoflurano, comience con un 2% en atomizador estándar, y luego reducir a 1% después de realizar una laparotomía. Realice una pizca dedo para comprobar la sedación.
- Afeitar el abdomen y limpiar con preparación de la piel 3 veces (Kodan). A continuación, realizar una incisión media después de la administración subcutánea de Carprofen 5 mg / kg sc de analgesia.
- Envuelva el recipiente en condiciones normales del intestino gasa empapada en solución salina y se coloca en el pecho del receptor.
- Abra el retroperitoneo sin rodeos con Q-tips, y exponer el abdominal aorta y vena cava inferior justo por debajo de los vasos renales hasta el nivel de los vasos ilíacos, si es necesario también utilizar microtijeras. Se liga el tribuaries pequeñas espinal lumbar y de la aorta y la vena cava utilizando 7-0 seda para evitar la pérdida de sangre. (Para ello, cambie el zoom de 16x microscopio quirúrgico.)
- Pinzamiento de la aorta y la vena cava inferior por debajo de la de los vasos renales proximales izquierdas y por encima de la bifurcación ilíaca distal utilizando clips de microvasos. Sólo una de las pinzas se utiliza proximalmente como distalmente así como para sujetar los dos buques simultáneamente. Una incisión ambos buques anteriormente utilizando un microknife y lavar la sangre restante.
- Crear una anastomosis de extremo a lado entre el segmento aórtico injerto y la aorta infrarrenal del destinatario mediante una continua 10-0 sutura Prolene .. Inicialmente, el injerto se coloca en el lado derecho del abdomen (la cabeza de la rata colocada en las 12 horas) para realizar las puntadas de la pared posterior de la anastomosis arterial y la vinculación de la sutura estancia inferior. Then, el injerto se gira hacia el lado izquierdo del abdomen (la cabeza de la rata colocada en las 9 horas) para exponer y suturar la pared frontal de la anastomosis.
- Una anastomosis de extremo a lado entre la vena porta y la vena cava inferior del injerto del destinatario se realiza igualmente mediante la ejecución de suturas utilizando 10-0 Prolene. Con la rata fijas situadas lateralmente (cabeza en posición de las 9), el injerto se coloca en el lado izquierdo del abdomen y una sutura de estancia inferior se coloca. La anastomosis se inicia con la pared posterior desde el interior del recipiente. Después de la sutura estancia inferior está ligado, las puntadas de la pared principal se puede realizar desde el exterior.
- Retire las abrazaderas distales en primer lugar, seguidos de las abrazaderas superiores. Cualquier hemorragia anastomótica es controlado por la presión directa con un Q-tips. El injerto debe ser revisado por reperfusión igual y rápida.
- Resecar el intestino delgado del receptor entero después de la ligadura de los vasos mesentéricos. Los beneficiarios se someten enterectomía subtotal, preservando 2-3 cm de proyeyuno ximal y 1 cm de íleon distal.
- Restaurar la continuidad intestinal por proximal (yeyuno-yeyunostomía) y distal (ileo-ileostomía) de extremo a extremo utilizando una anastomosis intestinales interrumpido de una capa de sutura con 6-0 Monocryl. Aproximadamente 16 puntos de sutura se necesitan para completar las anastomosis.
- Irrigar la cavidad peritoneal con solución salina normal hasta que esté limpia. Administrar 2 ml de solución salina normal por vía intraperitoneal para la reposición de líquidos. A continuación, cierre el abdomen con sutura continua con 3-0 Vicryl para la capa muscular más una sutura de la piel continua.
- En el postoperatorio, las ratas se debe mantener en ayunas (con acceso al agua y una solución de glucosa) por otro de 24 horas luego reanudaron el estándar rata chow y agua ad libitum. Analgesia con carprofeno se debe administrar durante 3 días (ver dosis más adelante).
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Representative Results
Curso postoperatorio normal
Los animales trasplantados deben recuperarse rápidamente del procedimiento bajo una lámpara de calor durante aproximadamente 1 hora. La hipotermia es una causa importante de mortalidad postoperatoria y debe evitarse cuidadosamente intra-y postoperatorio. Pérdidas intraoperatorias de fluido debe ser sustituido por inyección subcutánea de 2,5 ml de solución salina normal más 2,5 ml de glucosa al 5% cada 8 horas durante las primeras 24 h. Las ratas también deben tener acceso libre a una solución de glucosa (o dieta gel) y po agua durante las primeras 24 horas del postoperatorio. Después de este período, se debe recuperar la conducta normal de alimentación con conexión gratuita a nivel rata chow y agua ad libitum. El dolor se controla mediante la administración diaria de carprofeno 5 mg / kg sc durante tres días, con la primera toma para ser administrado en la inducción de anestesia. Profilaxis antibiótica sólo es necesario en la configuración alogénico, y puede ser administrada en días 5-7 (ampicilina 15 mg / kg sc, q. 12 hr). Generalapariencia, condición de piel, así como la apariencia mucosa debería ser normal. Después de POD 1 el nivel de actividad debe volver al estado preoperatorio, comportamiento anormal sugiere apathic o las complicaciones a tiempo quirúrgico. Después de la pérdida inicial de hasta el 20% del peso corporal de las ratas comenzará a ganar peso de nuevo alrededor del día postoperatorio 6-8 y habrá alcanzado alrededor del 90% de su peso preoperatorio normalmente alrededor del día postoperatorio 14 (en la configuración isogénica sin rechazo).
Las complicaciones postoperatorias
Como se indicó anteriormente, un abdomen distendido, comportamiento apathic, la interrupción de la alimentación y los cambios en la apariencia general (pelaje erizado, la secreción de los ojos) deben ser considerados como síntomas de posibles complicaciones. Los animales deben ser atendidos por el cirujano y un veterinario. Condiciones como estado de deshidratación, inflamatoria debido a la peritonitis, por estenosis de la anastomosis íleo intestinal, para el dolor insuficiente y otros deben ser la reglad cabo y se trató. Si el animal no se recupera a pesar del tratamiento, la interrupción del experimento debe ser evaluada caso por caso de acuerdo con la aplicación de los reglamentos de animales de experimentación.
La Figura 1a. Instrumentos.
1. Microscopio (Leica)
2. Anestesia aparato (EICKEMEYER)
La Figura 1b. Instrumentos.
3. Maquinilla de afeitar
4. Bisturí electrónico (Geiger)
5. Fórceps quirúrgico
6. DeBakey pinzas curvas
7. Pinzas curvas pequeña
8. Micro pinzas curvas
9. Micro Pinza recta 1
10. Micro Pinza recta 2
11. Soporte de la aguja Micro
12. Soporte de la aguja
13. Mosquito abrazadera
14. Tijeras 1
15. Tijeras 2
16. Microtijeras
17. Micro Scalpel
Figura 1c. Instrumentos.
18. Microclamps
19. Cánulas y Q-Tips (no representado)
20. Jeringas (50 ml, 10 ml, 2,5 ml, 1 ml)
Figura 1c. Instrumentos.
21. UW solución para el almacenamiento de injerto
22. Antibióticos (Uro-nebacetin N) para el riego lumen del injerto
23. UW para la perfusión del injerto
24. La solución salina normal
25. Plato con solución salina normal (por backtable)
Figura 2. Peso promedio postoperatorio (datos acumulados). La figura 2 muestra el peso medio postoperatorio después de trasplante ortotópico del intestino delgado. Después de la pérdida inicial de hasta el 20% del peso corporal de las ratas empiezan a ganar peso de nuevo alrededor del día postoperatorio 6-8 y se habrá alcanzado el 90% de su preoppeso cooperativa normalmente alrededor del día postoperatorio 14 (en la configuración isogénica sin rechazo / inmunodepresión). Figura 2 representa los datos de pérdida de peso, la supervivencia no disminuir, el número de animales disponibles para medir la pérdida de peso se debe principalmente a sacrifing de animales para experimentos.
Figura 3. El tejido pancreático (flecha) tiene que ser eliminado del colon.
Figura 4. Después de ligar y dividir el perder tejido conectivo incluyendo todos los vasos linfáticos entre SMV y la aorta abdominal, la arteria renal derecha (flecha) se divide entre ligaduras de seda.
Figura 5. Perfusión del injerto con solución UW a través del conducto aórtico.
Figura 6. Después de la preparación de receptor vena cava y la aorta de los vasos están expuestos, listo para la sujeción.
Figura 7. Abrazadera de la Cruz se realiza en la vena cava y la aorta utilizando simultáneamente microclamps.
Figura 8. (A) La anastomosis aorto-aórtico se realiza utilizando suturas. (B) Después de la terminación de la anastomosis aorto-aórtico, la anastomosis portocava se realizará el próximo. La sutura estancia inferior ya está en marcha.
Figura 9. (A) La anastomosis portocava se inicia después de la sutura estancia segunda está en su lugar. (B) Después de completion de la anastomosis portocava.
Figura 10. Después de la eliminación de las abrazaderas del injerto reperfuses bien.
Figura 11. (A) La colocación de suturas para la anastomosis intestinal. (B) Completado anastomosis intestinal.
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Discussion
Mientras que los modelos de trasplante intestinal en ratas se han descrito ya en el 1970ies 5 la mayoría de los modelos recientemente empleadas implican trasplante heterotópico intestinal utilizando diferentes técnicas 13. Si bien los procedimientos heterotópico en general, tienen la ventaja de las técnicas de microcirugía más y más fácil accesibilidad del injerto para la evaluación, el trasplante heterotópico intestinal tiene la gran desventaja de no tener en cuenta las múltiples interacciones del intestino delgado trasplantado y sus aspectos funcionales como la actividad contráctil y función de barrera de la mucosa que caracteriza un injerto ortotópico en el contexto de una inmensa multitud de comensales y patógenos. Nuestro grupo ha adquirido una gran experiencia con el modelo descrito en este documento ortotópico y nuestros hallazgos sugieren que muchas de las alteraciones específicas causadas por las respuestas inmunes inflamatorias y de adaptación tienen que ser evaluados en el contexto de la pro funcionalpiedades del intestino transplantado pequeña como la contractilidad y la integridad de la mucosa. Es de destacar que las técnicas anastomóticas empleadas aquí no incluyen el uso de manguitos arteriales o venosas, algunos de los cuales han sido mostrados para facilitar el procedimiento y reducir el tiempo crítico de isquemia caliente, especialmente en modelos de trasplante multivisceral 12,14. Aunque puede ser necesario emplear técnicas de manguito en modelos de roedores de multivisceral trasplante, el potencial complicative de los puños nos ha llevado a evitar técnicas similares en este modelo de trasplante intestinal único. No hemos tratado de utilizar las técnicas de drenaje portal en este modelo. Aparte de ser técnicamente difícil (el diámetro de la vena porta pequeña podría conducir a problemas de flujo de salida venoso), lo que haría que todo el modelo más difícil establecer - es un hecho que en el drenaje trasplante clínico sistémico intestinal se utiliza en la mayoría de los casos. Por lo tanto, la técnica descrita refleja la práctica clínica combinada con la viabilidad técnica. Portal de drenaje de los injertos no se ha demostrado que se asocia con resultados superiores en varios estudios clínicos y experimentales 2,4. Tiempos de isquemia suficientemente cortos de alrededor de 35 minutos necesarios para la supervivencia de los animales estable se puede lograr después de la finalización de la curva de aprendizaje para este modelo.
Trasplante ortotópico del intestino delgado según este protocolo puede ser aprendida por un investigador experimentado microquirúrgicamente después de realizar los procedimientos de aproximadamente 30-40. La visualización como se logra por el formato JoVE permite la observación visual directa y reproducción precisa de las técnicas empleadas que posiblemente conduce a la rápida creación del método y menos sacrificio animal. Los puntos críticos son el sangrado, tiempo de isquemia fría y caliente y el intestino insuficiencia anastomótica estenosis /. El tiempo de isquemia fría en esta configuración experimental no es tan crucial como isquemia calientetiempo mia pero no debe exceder de 45 minutos. El tiempo de isquemia caliente debe estar alrededor de 35 minutos y también no exceda de 45 minutos, ya que esto puede causar una mayor mortalidad postoperatoria. El donante ideal y peso del receptor es de alrededor de 200 g porque las pequeñas ratas no toleran el procedimiento bien y pesan más de 300 g se asocia con la grasa intraabdominal excesiva. Las ratas perder hasta el 20% del peso corporal en el postoperatorio directa, pero debe comenzar a ganar peso de nuevo después de 6-8 días después de la operación (Figura 2). Controles diarios de salud (estado de alerta, piel y mucosa de aspecto, peso, calidad de las heces y la frecuencia) debería realizarse hasta que se sacrifica el animal. Se recomienda la administración diaria de antibióticos y analgesia durante al menos los tres primeros días como se describió anteriormente. Después de la práctica inicial, en particular de la microvascular y anastomosis intestinales, este modelo proporciona fiable y estable de supervivencia a largo plazo de alrededor de 80-90% en el entorno isogénica. En la allogesupervivencia nic ajuste es generalmente menor, depende principalmente de fenómenos inmunológicos como el rechazo agudo y crónico y puede variar ampliamente de acuerdo con el régimen inmunosupresor utilizado y probado.
Notas técnicas: El tiempo de funcionamiento de donantes debería ser de alrededor de 45 minutos. La operación destinatario no mucho debe exceder 1,5 horas. Una almohadilla térmica debe utilizarse rutinariamente para evitar la hipotermia en el receptor. Para el acceso vascular fácil, la vena lateral de la cola del receptor puede ser canulado al comienzo del procedimiento usando un catéter de 22 G intravenosa. Irrigación de la luz intestinal, como se describió anteriormente puede no ser necesario, omitiendo este paso tiene que nuestro conocimiento no hay efectos negativos sobre el resultado y la mortalidad.
Las condiciones de policía de estudio: Los animales se mantuvieron de acuerdo con las leyes aplicables y regulaciones de la República Federal de Alemania, Estado Renania del Norte-Westfalia. Los números de los documentos en que tque los experimentos fueron aprobados pueden solicitar al autor correspondiente.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| University of Wisconsin (UW) solution (ViaSpan) | Bristol-Myers Squibb | ||
| Uro-Nebacetin N solution | Nycomed | 6967855 | |
| Ampicillin | Ratiopharm | ||
| Carprofen (Rimadyl) | Pfizer | ||
| Prolene 10-0 unresorbable suture | Ethicon | ||
| Monocryl 6-0 resorbable suture | Ethicon | ||
| Vicryl 3-0 resorbable suture | Ethicon | ||
| i.v. Catheter G 20 1.1x33 mm | Braun | ||
| i.v. Catheter G 22 0.9x25 mm | Braun | ||
| Kodan Skin Prep | Schülke | ||
| NaCl 0.9% Infusion solution | Braun | ||
| Curved forceps small | FineScienceTools | 11009-13 | |
| Micro forceps curved | AESCULAP | BD 333 | |
| Micro forceps curved | AESCULAP | FD281R | |
| Micro forceps straight 1 | WPI | 5 | |
| Micro forceps straight 2 | WPI | 2 | |
| Micro needle holder | WPI | 14081 | |
| Micro scissors | FineScienceTools | 15006-09 | |
| Micro scalpel | MANI | Ophthalmic knife | |
| Micro clamps | AESCULAP | FB329R |
References
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